非洲豬瘟病毒p54蛋白單克隆抗體的制備及阻斷ELISA方法的建立

徐玲玉，曹琛福，李中圣，陳俊宏，柳騰飛，王新凱，賈偉新,3*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，國家非洲豬瘟區(qū)域?qū)嶒炇?廣州)/人獸共患病防控制劑國家地方聯(lián)合工程實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部人畜共患病重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用疫苗創(chuàng)制重點實驗室/廣東省動物源性人獸共患病防控重點實驗室，廣州 510642；2.深圳海關(guān)動植物檢驗檢疫技術(shù)中心，深圳 518045；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室，廣州 510642; 4.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣州 511400)

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬唯一成員非洲豬瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的一種烈性、接觸性傳染病。ASFV不僅能感染家豬、野豬，還能使軟蜱帶毒成為傳播媒介[1-3]。豬感染ASFV后的臨床特征是內(nèi)臟器官出血、高熱不退，死亡率高達100%[4]。世界動物衛(wèi)生組織(OIE)將ASF列為法定報告動物疫病[5]，中國也將其列為一類動物疫病。1921年全球首次報道了發(fā)生于1910年肯尼亞的ASF疫情，中國在2018年8月3日首次報道ASF感染后半年內(nèi)便蔓延到河南、江蘇等31個省份，疫情幾乎波及整個中國，造成直接經(jīng)濟損失達數(shù)百億元，對我國生豬產(chǎn)業(yè)造成極大損失[6-7]。ASFV是目前已知的唯一一種DNA蟲媒病毒，該病毒較大且?guī)в心夷?、外殼呈二十面體對稱(260～300 nm)，基因組全長為170～190 kb[8]，編碼50多種結(jié)構(gòu)蛋白和100多種非結(jié)構(gòu)蛋白[9-10]。

目前，ASF的流行出現(xiàn)了新的特點，ASFV自然弱毒株與強毒株同時存在，感染豬出現(xiàn)超長潛伏期，精準剔除難度增加，因此監(jiān)測ASFV抗體成為早期發(fā)現(xiàn)ASF的重要手段[11]。而抗體監(jiān)測的成效取決于監(jiān)測手段的便捷性和準確性。由于ELISA檢測成本低廉且操作簡便，OIE將其作為檢測ASF的首選血清學(xué)方法，國內(nèi)外常將p30、p72作為檢測抗原的蛋白[12]。目前，國外進口的試劑盒價格昂貴，操作復(fù)雜，在非規(guī)?；B(yǎng)豬場難以推廣[13]。因此，研制適用于我國臨床使用的ASFV檢測試劑盒十分必要。目前已經(jīng)建立針對ASFV核酸、蛋白和抗體的檢測方法，大部分檢測方法以ASFV蛋白p72等作為檢測對象[14]。p54存在于病毒衣殼的內(nèi)部，具有和8 ku的細胞動力蛋白輕鏈(DLC8)直接結(jié)合從而使病毒進入宿主細胞復(fù)制位點的功能[15]。有研究表明，豬免疫重組p54蛋白后，機體會產(chǎn)生一定量的中和抗體，ASFV與細胞吸附之前可以被針對p54的抗體中和[16-17]。因此，p54蛋白具有較好的抗原性，是理想的檢測抗原，但基于p54建立的阻斷ELISA檢測方法報道較少。

基于此，本研究以ASFV p54蛋白為包被抗原，利用制備的1株mAb建立了檢測ASFV抗體的阻斷ELISA方法，并進行了驗證，該方法具有較好的特異性和敏感性，為我國ASF的防控提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 血清、細胞和試劑盒

非洲豬瘟標準陽性血清購自西班牙ASF參考實驗室；商品化試劑盒購自西班牙INGENASA公司；豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬流感病毒(SIV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)陽性血清均購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；SP2/0細胞由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

大腸桿菌由深圳市康百得生物科技有限公司供應(yīng)；LB培養(yǎng)基購自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；氨芐青霉素抗生素購自Sigma公司；純化Ni柱購自GE Healthcare；HRP快速標記試劑盒購自湖州英創(chuàng)生物科技有限公司；HAT、HT、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑聚乙二醇(PEG)均購自Sigma公司；可拆卸ELISA酶標板購自Costar公司；TMB購自上海西寶生物科技有限公司。

1.3 包被抗原的制備

1.3.1 重組菌株的構(gòu)建與鑒定 基于流行病學(xué)調(diào)查分析選擇GenBank中已登錄的ASFV p54蛋白基因序列作為參考(GenBank序列號：FJ174405.1)，委托蘇州金唯智生物科技有限公司合成攜帶p54基因的質(zhì)粒，并將質(zhì)粒中p54基因片段轉(zhuǎn)入pUC57載體，構(gòu)建包含ASFVp54序列的重組質(zhì)粒pUC57-ASFVp54。膠回收目的片段和載體片段后，分別取目的基因6 μL、載體片段2 μL、T4 DNA Ligase 1 μL、10×T4 Ligation Buffer 1 μL混勻，在16 ℃連接4 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中，并涂布于含100 μg·mL-1氨芐青霉素的LB瓊脂平板上，在37 ℃培養(yǎng)12 h后，挑取單個菌落于含50 μg·mL-1氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h后，對菌液進行PCR鑒定，利用質(zhì)粒上的T7引物(F:TAATACGACTCAC-TATAGGG, R:GCTAGTTATTGCTCAGCGG)進行PCR擴增，隨后進行凝膠電泳檢測。菌液鑒定體系組分如下：Accurate Taq Mix(2×)10 μL，菌液2 μL，引物F、R各0.5 μL,去離子水7 μL，隨后將PCR產(chǎn)物送生工生物(上海)公司進行測序，測序結(jié)果與GenBank中的序列進行比對。

1.3.2 ASFV p54蛋白的表達、純化與鑒定 挑取單個菌落，接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫搖床振蕩培養(yǎng)至OD600 nm值為0.6～1.0，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(終濃度為1 mmol·L-1)，表達2 h后收集菌液。將菌液在4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min后去除上清并收集菌體。用PBS洗滌菌體，再次離心去除上清。加入破菌緩沖液重懸菌體，冰上超聲破碎，破碎后4 ℃、10 000 r·min-1離心15 min，收集上清，采用Ni Sepharose 6 Fast Flow 進行蛋白親和層析純化，收集洗脫物，進行SDS-PAGE分析和Western blot鑒定。純化的蛋白，利用Pierce BCA Protein Assay Kit測定含量。

1.4 單克隆抗體(mAb)的制備

1.4.1 抗原免疫 取3只6周齡的BALB/c小鼠，3只小鼠分別標記為A、B、C。每兩周免疫1次，共免疫3次。第一次免疫用PBS將原核表達且純化好的p54蛋白稀釋至200 μg·mL-1。取100 μL與完全弗氏佐劑按體積比1∶1混合均勻，乳化30 min。取200 μL乳化好的抗原在小鼠背部和大腿進行肌內(nèi)注射，第二、三次免疫則采用不完全弗氏佐劑混勻的抗原。對照組注射等體積的PBS乳化液。從第一次免疫開始每次免疫后14 d將小鼠斷尾取血制備血清，用間接ELISA方法檢測血清抗體效價。選擇抗體效價最高的小鼠，在融合前3 d加強免疫。

1.4.2 檢測p54蛋白的間接ELISA方法 根據(jù)間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(iELISA)方法的一般操作程序，將純化的p54蛋白稀釋至2.5 μg·mL-1，包被酶聯(lián)免疫吸附試驗微孔板，并用脫脂奶粉封閉。將ASFV陽性血清加入包被板，在37 ℃孵育45 min，用PBST洗滌3次后，加入HRP標記的兔抗豬IgG，在37 ℃孵育15 min。最后用顯色底物溶液顯色，讀取OD450 nm值[18]。陰性對照OD450 nm<0.2時試驗成立：S/N(待檢樣品OD450 nm/陰性對照OD450 nm)≥2.1，判定結(jié)果為陽性。

1.4.3 雜交瘤細胞的篩選及克隆 細胞融合前1 d制備好飼養(yǎng)細胞，將骨髓瘤細胞SP2/0和免疫后小鼠脾細胞進行常規(guī)PEG融合。并采用間接ELISA方法檢測每孔雜交瘤細胞培養(yǎng)上清，對能產(chǎn)生抗體的陽性孔利用有限稀釋法進行亞克隆，雜交瘤細胞篩選，利用有限稀釋法對雜交瘤細胞進行單克隆[14]。

1.4.4 腹水型mAb制備、純化 采用10周齡的BALB/c雌鼠，每只小鼠腹腔注射0.5 mL液體石蠟，7 d后再次通過腹腔注射陽性雜交瘤細胞(約5×106個)。每天定時觀察小鼠的身體狀況，約1周后小鼠會出現(xiàn)腹部膨脹的情況，此時收集腹水并離心，上清液即為含ASFV p54 mAb的腹水。利用Thermod單抗純化試劑盒對收集到的腹水進行純化。

1.5 mAb亞類鑒定與Western blot分析

用Sigma公司的單抗亞類鑒定試劑盒進行mAb亞類鑒定。將鑒定好亞型的mAb與轉(zhuǎn)至硝酸纖維膜上的原核表達的p54蛋白進行雜交，同時用大腸桿菌細胞超聲破碎上清作為陰性對照，用純化得到的mAb作為一抗進行孵育，用HRP標記的羊抗鼠IgG作為二抗進行孵育顯色，驗證mAb的特異性。

1.6 阻斷ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用

1.6.1 最佳工作條件的確定 采用方陣法確定阻斷ELISA方法的最佳反應(yīng)條件：最佳包被抗原濃度(5、2.5、2.0、1.25、1、0.625 μg·mL-1，50 μL·孔-1，4 ℃包被過夜)，HRP-mAb-p54最佳稀釋度(1∶200、1∶400、1∶800、1∶1 000、1∶1 200)，待檢血清(1∶40、1∶80、1∶160、1∶320)，HRP-mAb-p54最佳孵育時間(15、30、60 min)，最佳底物顯色時間(3、6、10 min)。

1.6.3 特異性試驗 選取豬瘟病毒(CSFV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、口蹄疫病毒(FMDV)、豬流感病毒(SIV)、豬偽狂犬病病毒(PRV)6種常見豬病病原的陽性血清作為樣品，根據(jù)阻斷率臨界值判斷該方法的特異性。

1.6.4 敏感性試驗 將標準ASFV陽性血清做1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280倍比稀釋，利用建立的阻斷ELISA方法進行檢測，確定該方法敏感性。

1.6.5 重復(fù)性試驗 采取同一批次包被的ELISA板，用ASFV陰、陽性血清各3份進行批內(nèi)重復(fù)試驗；取不同批次包被的ELISA板，用ASFV陰、陽性血清各3份進行批間重復(fù)試驗。分別計算各血清樣品的平均抑制率、標準方差和變異系數(shù)。

1.6.6 初步應(yīng)用和符合性試驗 使用采集自廣東、云南等省份的豬血清1 000份，利用本研究建立的阻斷ELISA方法進行檢測。再選取部分陰性樣品和全部陽性樣品利用商品化檢測試劑盒(西班牙INGENASA)進行驗證，并計算二者的符合率。

2 結(jié) 果

2.1 包被抗原制備

2.1.1 重組菌株的構(gòu)建與鑒定結(jié)果 將菌液進行PCR擴增和測序鑒定，結(jié)果顯示(圖1)，在預(yù)期462 bp處出現(xiàn)了目的條帶，表明重組菌株構(gòu)建成功。序列比對結(jié)果顯示，p54基因與ASFV SY18株相似性達100%。

M.DNA marker Ⅱ相對分子質(zhì)量標準；1.陰性對照；2.陽性對照；3.菌液

2.1.2 ASFV p54蛋白的表達、純化與鑒定結(jié)果 將經(jīng)Ni柱親和層析純化過程中每一步驟上清液收集起來，分別進行SDS-PAGE檢測分析，結(jié)果顯示(圖2A)，最終產(chǎn)生的柱脫液在預(yù)期的28 ku處出現(xiàn)了目的條帶，純化得到的蛋白純度較高、雜蛋白少。Western blot進一步分析，結(jié)果顯示(圖2B),重組的p54蛋白能夠與ASF陽性血清反應(yīng)，預(yù)期目標處出現(xiàn)特異性條帶。利用Pierce BCA Protein Assay Kit測定p54蛋白的濃度為2.5 mg·mL-1。

M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標準；1.裂解上清；2.過柱穿透液；3.第1次洗脫組分；4.第2次洗脫組分；5、6.純化的p54蛋白

2.2 單克隆抗體(mAb)制備

2.2.1 免疫小鼠的選擇及血清效價的測定結(jié)果 相同的方法3次免疫3只小鼠后，經(jīng)過間接ELISA分析，編號為C的BALB/c小鼠在第3次免疫后血清測得的OD450 nm值最高，血清效價可以達到6.4×104，故選擇C小鼠脾用作細胞融合。

2.2.2 雜交瘤細胞的篩選及克隆結(jié)果 經(jīng)間接ELISA篩選獲得2株陽性雜交瘤細胞，經(jīng)過6次篩選后陽性率為100%。選取其中1株進行試驗，并命名為mAb-p54。

2.2.3 腹水型單抗的制備、純化結(jié)果 測定腹水型單抗效價為1.28×105，利用Thermod單抗純化試劑盒純化，結(jié)果顯示(圖3)，經(jīng)過純化后mAb中的雜蛋白明顯減少，純化效果好。純化后測定mAb的濃度為1 mg·mL-1，制備的mAb可以滿足免疫學(xué)檢測方法的建立和免疫檢測產(chǎn)品的研發(fā)。對mAb進行HRP標記，以此作為阻斷ELISA方法建立時的阻斷酶標二抗。

2.2.4 單克隆抗體亞類鑒定與Western blot結(jié)果 用Sigma公司的單抗亞類鑒定試劑盒進行單克隆抗體亞類鑒定，經(jīng)鑒定單克隆抗體亞型為IgG1型。Western blot結(jié)果表明(圖4)，單抗不與大腸桿菌蛋白結(jié)合，可以和原核表達的重組蛋白p54結(jié)合，表明得到的單抗特異性較好。

2.3 阻斷ELISA檢測方法的建立及初步應(yīng)用

2.3.1 最佳反應(yīng)條件的確定 根據(jù)方陣滴定及優(yōu)化后的各反應(yīng)條件，確定阻斷ELISA方法最優(yōu)條件如表1所示。

表1 阻斷ELISA檢測方法的反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

2.3.3 特異性試驗 利用建立的阻斷ELISA方法檢測CSFV、PRRSV、PCV2、FMDV、SIV、PRV 6種豬常見病毒陽性血清樣本各2份及ASFV陽性血清1份，共計13份樣品，結(jié)果顯示：僅ASFV陽性血清阻斷率達80%以上；其余均低于40%。表明該方法特異性較強。

2.3.4 敏感性試驗 利用建立的阻斷ELISA方法檢測倍比稀釋的ASFV陽性血清(稀釋倍數(shù)為1∶80、1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280)，結(jié)果顯示，當(dāng)陽性血清1∶640稀釋時，阻斷率為55.5%，仍為陽性結(jié)果，表明該方法敏感性較高。

2.3.5 重復(fù)性試驗 利用建立的阻斷ELISA方法對6份血清樣品的批內(nèi)重復(fù)試驗及批間重復(fù)試驗的變異系數(shù)均在10%以內(nèi)，表明該方法重復(fù)性較好。

2.3.6 初步應(yīng)用和符合性試驗結(jié)果 采用100份從廣東、云南等地區(qū)采集的豬血清樣品，利用進口商品化的非洲豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒和本研究建立的阻斷ELISA方法進行檢測，結(jié)果顯示，進口商品化的非洲豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒檢測呈陽性的樣品數(shù)為26，陰性的樣品數(shù)為74；本研究建立的阻斷ELISA方法檢測呈陽性的性樣品數(shù)為26，陰性樣品數(shù)為72。通過計算，兩個試劑盒的陽性符合率為100%,陰性符合率為97.3%，總符合率為98%(表2)。臨床應(yīng)用證明，本研究建立的阻斷ELISA方法敏感性好，特異性強，與進口商品化試劑盒符合率高，可適用于臨床血清學(xué)樣品的非洲豬瘟抗體檢測。

表2 符合率試驗結(jié)果

3 討 論

當(dāng)前我國部分省區(qū)出現(xiàn)了低致死率的ASFV基因Ⅱ型自然變異流行株，相比典型強毒株致病力降低，主要引起持續(xù)感染和慢性病程，具有很強的水平傳播能力，這些變異株臨床表現(xiàn)具有一定的隱蔽性，早期診斷難度加大，給我國ASF防控帶來全新的挑戰(zhàn)[19-20]。鑒于ASF流行出現(xiàn)的新特點，對ASF早期診斷除了檢測ASFV外，檢測ASF抗體顯得尤為重要。2021年3月7日，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部印發(fā)了《非洲豬瘟疫情應(yīng)急實施方案(第五版)(農(nóng)牧發(fā)[2021]7號)，提出了對ASFV抗體檢測可采用阻斷ELISA、間接ELISA、抗原夾心ELISA、間接免疫熒光等方法。因此，研制敏感性、特異性和穩(wěn)定性好的ASFV抗體檢測技術(shù)迫在眉睫。

使用ASFV結(jié)構(gòu)蛋白建立ELISA檢測方法具有成本低、特異性好、靈敏度高和檢測速度快等優(yōu)勢，能夠用于大量樣品的自動化檢測，是目前應(yīng)用最廣泛的檢測方法[21-23]。本研究篩選出的ELISA包被抗原為原核表達的ASFV p54蛋白，p54蛋白是ASFV主要的結(jié)構(gòu)蛋白之一，包含假定的跨膜域，對病毒形態(tài)的形成至關(guān)重要[24-26]。本研究中采用的酶標單抗所針對的抗原位點非常保守，理論上能檢測到世界目前所有流行非洲豬瘟病毒株的陽性血清。有研究表明，p54的缺失會影響ASFV的穩(wěn)定性，在病毒復(fù)制、轉(zhuǎn)染、維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性方面p54都發(fā)揮著重要作用，是ASFV的主要免疫原蛋白。p54蛋白抗原性良好，當(dāng)豬被ASFV感染后其抗體大概在1周后出現(xiàn)，且持續(xù)數(shù)周[24，27-30]，作為包被抗原建立的ELISA檢測方法可以用于ASFV感染后全程的監(jiān)測。

4 結(jié) 論

基于ASFV主要的結(jié)構(gòu)蛋白p54蛋白建立檢測ASFV的阻斷ELISA方法，該方法特異性好、重復(fù)性好、靈敏度高，與國外同類商品化試劑盒具有良好的符合性。建立的檢測方法為我國ASFV防控提供了技術(shù)支持，可用于ASFV免疫檢測和血清流行病學(xué)調(diào)查。