荷斯坦公牛X和Y精子核形態(tài)差異及其影響因素分析

丁鳳玲，上官愛哨，周 揚(yáng)，丁 瑞，孫 偉，李喜和，張淑君*

(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070；2.內(nèi)蒙古賽科星繁育生物技術(shù)集團(tuán)股份有限公司，呼和浩特 011517)

精子形態(tài)與受精能力、運(yùn)動(dòng)能力有關(guān)。射精中形態(tài)正常精子百分比的減少與其生育力降低有關(guān)[1-2]。在對(duì)伊比利亞鹿和公羊的研究中發(fā)現(xiàn)，頭小而細(xì)長(zhǎng)的精子與快速運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)，在高生育力雄性中更常見[3-4]。然而許多對(duì)精子的分析仍依賴于耗時(shí)和主觀的人工評(píng)分，缺乏準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，試驗(yàn)操作人員之間的變異系數(shù)約為10%～80%，這限制了形態(tài)學(xué)評(píng)估作為精液質(zhì)量預(yù)測(cè)指標(biāo)的廣泛應(yīng)用[5-7]。

利用家畜性別控制精子和人工授精極大地提高了畜牧業(yè)生產(chǎn)效率和經(jīng)濟(jì)效益[8-10]。目前，流式分選在公牛精子性別分選中廣泛應(yīng)用[11]，然而該技術(shù)仍存在精子受損較多和成本較高等不足之處[11-13]。研究還發(fā)現(xiàn)，流式分選可導(dǎo)致精子細(xì)胞膜磷脂紊亂[14]和蛋白質(zhì)分布改變[15]等，從而使精子運(yùn)動(dòng)能力降低，頂體的完整性降低[16]。

精子的冷凍保存已成為繁殖、育種和保種的必要手段[17]。然而，隨著冷凍過程中溫度的急劇變化，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了多種物理化學(xué)變化，嚴(yán)重?fù)p害精子質(zhì)量和生育能力[18]。精子的結(jié)構(gòu)和功能也都會(huì)受到冷凍的影響。細(xì)胞膜上的磷脂[19]和某些細(xì)胞骨架蛋白[20-21]的分布發(fā)生改變，鞭毛中與ATP代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)(HSP90)的豐度降低[22]。精子的遺傳物質(zhì)在冷凍過程中也發(fā)生了改變[23-25]，包括DNA損傷和早期胚胎發(fā)育相關(guān)的精子mRNA轉(zhuǎn)錄活性下調(diào)[26]。冷凍保存還會(huì)誘導(dǎo)多種表觀遺傳變化，包括DNA甲基化水平增加和組蛋白修飾改變[27]。

哺乳動(dòng)物X和Y精子的發(fā)生與成熟過程是相同的，但研究發(fā)現(xiàn)二者在DNA含量、運(yùn)動(dòng)能力等方面存在差異[28]。然而，荷斯坦公牛新鮮性控精子(X和Y精子)及其冷凍性控精子的核形態(tài)差異及其主要影響因素還不清楚。因此，本試驗(yàn)擬分析性控X和Y精子核形態(tài)及其差異，研究流式分選和冷凍過程分別對(duì)公牛精子、性控X和Y精子核形態(tài)的影響，為流式分選、冷凍等精液生產(chǎn)技術(shù)的改進(jìn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器和試劑

1.1.1 主要儀器 SX型流式細(xì)胞儀(DakoCytomation，美國(guó)Fort Colllins公司)，移液槍(德國(guó)Eppendorf公司)，高速低溫離心機(jī)(德國(guó)Thermo centrifuge X3R公司)，電子天平(BL1500型，德國(guó)Sartorius公司)，低速離心機(jī)(F8AΦ6×30型，中國(guó)北京醫(yī)用離心機(jī)廠)，無菌操作臺(tái)(SW-CJ/2D型，中國(guó)江蘇凈化公司)，熒光顯微鏡(Ti2-U型，日本尼康)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(中國(guó)常州諾基有限公司)。

1.1.2 主要試劑 Hoechst-33342(Sigma，St Louis，美國(guó))；磷酸鹽緩沖鹽水(PBS，GE Healthcare Life Sciences，美國(guó))，4%多聚甲醛固定液，多聚賴氨酸(PDL)，DAPI(4’,6-diamidino-2-phenylindole，4’,6-二脒基-2-苯基吲哚)，抗熒光淬滅封片液，以上試劑均購(gòu)于武漢碧云天生物技術(shù)公司。

1.2 精液處理及精子染色

于內(nèi)蒙古賽科星繁育生物技術(shù)(集團(tuán))股份有限公司種公牛站選取15頭健康、年齡相當(dāng)?shù)姆N公牛。使用假陰道法采集精液樣本，原精送達(dá)實(shí)驗(yàn)室后，將精液轉(zhuǎn)移到50 mL的離心管中，在室溫(18 ℃)下保存30～60 min。按照以下程序進(jìn)行精子分離。首先，用Hoechst-33342熒光染料(106個(gè)精子用量為0.3 mmol·L-1)對(duì)1 mL精液進(jìn)行染色，在35 ℃黑暗條件下孵育1 h；其次，將樣品通過30 mm尼龍網(wǎng)過濾器去除碎片及成團(tuán)精子，在黑暗室溫下保持15 min；然后，使用高速SXXDP流式細(xì)胞儀分離精子。分離后的X精子的純度可達(dá)90%以上。將分離后的精液洗滌兩次(在PBS中20 ℃以700 r·min-1離心10 min)，去除上清保留精子沉淀。

精液冷凍步驟：將緩沖液(主要成分:檸檬酸鈉、蛋黃、果糖、甘油、青霉素、鏈霉素)加入精液樣品中，從25 ℃緩慢冷卻至4 ℃，在4 ℃中平衡4 h。隨后將試管精液在8 min內(nèi)從4 ℃冷卻至-140 ℃，轉(zhuǎn)移到液氮罐中保存。冷凍樣品在液氮中保存約10 h后，在37 ℃水浴解凍30 s，然后進(jìn)行活力檢測(cè)，確保每根吸管中的精子活力大于0.35。

制片步驟：取適量精液，加入1 mL預(yù)冷的PBS洗2次，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清；加入4%多聚甲醛固定10 min；加入1 mL預(yù)冷的PBS洗2次，1 500 r·min-1離心5 min，棄上清；向EP管中加入PBS，使精子濃度為105個(gè)·mL-1，取100 μL精液涂于經(jīng)多聚賴氨酸處理過的載玻片上，通風(fēng)晾置數(shù)分鐘，不能干透；加入DAPI染精子核10 min；加抗熒光淬滅劑封片，隨后置于熒光顯微鏡下觀察。

1.3 精子核形態(tài)分析

使用熒光顯微鏡(尼康，日本)觀察載玻片上的精子(100×物鏡，3.3×目鏡)，視頻信號(hào)是通過安裝在顯微鏡上的Sony CCD AVC-D7CE攝像機(jī)(索尼，日本)獲取的。視頻幀采集卡的陣列大小為512×512×8位，可提供262 144個(gè)像素和256個(gè)灰度的數(shù)字化圖像。圖像的水平和垂直軸分辨率均為每像素0.083 μm。僅考慮不與其他細(xì)胞重疊的精子進(jìn)行分析。每個(gè)樣本拍攝至少10個(gè)顯微鏡的視野，每個(gè)樣本至少包含300個(gè)精子核。為了減少主觀誤差，載玻片中精子的處理和拍攝均由同一個(gè)人完成。

利用Image J軟件的插件(Nuclear Morphology Analysis，version 1.15.0)分析精子圖像。測(cè)定和分析精子核形態(tài)的8個(gè)參數(shù)，包括4個(gè)描述精子核大小的參數(shù)以及4個(gè)描述精子核形狀的衍生參數(shù)。描述大小的主要參數(shù)是面積(A，area以μm2為單位，作為邊界內(nèi)所有像素區(qū)域的總和)、周長(zhǎng)(P，perimeter以μm為單位，作為外部邊界的總和)、最小直徑(W，width，以μm為單位，F(xiàn)eret直徑的最小值)和最大直徑(L，length，以μm為單位，F(xiàn)eret直徑的最大值)。4個(gè)描述精子核形狀的衍生參數(shù)為橢圓度(ellipticity, L/W)、圓度(circularity, 4×π×A/P2)，伸長(zhǎng)度為(elongation,(L-W)/(L+W))和規(guī)則度(regularity, π×L×W/4×A)。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

分析使用的軟件是“Nuclear Morphology Analysis”(version 1.15.0)及R軟件相關(guān)的數(shù)據(jù)處理工具。經(jīng)過調(diào)試，設(shè)定的精子核面積大小范圍是3 000～5 000(單位為像素)，精子核橢圓度的大小范圍為0.70～0.85，從而剔除掉有重疊的精子。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。使用非參數(shù)檢驗(yàn)——Mann-Whitney U檢驗(yàn)，然后使用Bonferroni進(jìn)行多重檢驗(yàn)，校正后的P<0.05則認(rèn)為具有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 公牛精子核形態(tài)圖像的信息

采集15頭荷斯坦公牛的精子，通過流式分選和冷凍分別獲得6種精子樣本共3.7萬個(gè)精子核圖像(圖1)。由于在每類精子中剔除了精子圖像數(shù)量較少的公牛，故每種精子樣本公牛頭數(shù)不等，如表1所示。

A.染色后熒光顯微鏡拍攝照片；B.同一張圖Image J軟件識(shí)別的精子圖像

2.2 性控X和Y精子核形態(tài)差異的比較

對(duì)12頭荷斯坦公牛(因精子核圖像較少刪除了3頭公牛)X和Y精子共7 950個(gè)精子核圖像的大小(面積、周長(zhǎng)、長(zhǎng)和寬)與形狀(橢圓度、圓度，伸長(zhǎng)度和規(guī)則度)進(jìn)行比較分析，從精子核大小的變化發(fā)現(xiàn)，12頭公牛中有4頭公牛(4/12)X和Y精子的核面積、周長(zhǎng)、長(zhǎng)度和寬度存在顯著性差異(圖2A)；比較精子核形狀的變化，4頭(4/12)公牛X和Y精子的核伸長(zhǎng)度和圓度有顯著性差異，2頭(2/12)公牛的精子核規(guī)則度和橢圓度有顯著性差異(圖2B)。

A.精子核面積、周長(zhǎng)、長(zhǎng)度和寬度；B.精子核圓度、伸長(zhǎng)度、橢圓度和規(guī)則度。X軸為牛的個(gè)體編號(hào)，X軸的最后一項(xiàng)為所測(cè)牛只的均值；Y軸為各項(xiàng)參數(shù)的“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”

2.3 流式分選對(duì)牛精子核形態(tài)的影響

對(duì)流式分選前后11頭荷斯坦公牛的精子核形態(tài)進(jìn)行比較，分析了約1.13萬個(gè)精子核圖像(表1)。流式分選前后精子純度如圖3所示。

A.分選后Y精子純度；B.分選后X精子純度

2.3.1 流式分選對(duì)精子核大小的影響 對(duì)11頭公牛的精子核面積、周長(zhǎng)、長(zhǎng)和寬4個(gè)參數(shù)在流式分選前后的平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖4)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流式分選對(duì)精子核大小具有顯著性影響，其中8頭(8/11)公牛的精子核面積、周長(zhǎng)和長(zhǎng)度在流式分選后發(fā)生顯著性變化，6頭(6/11)公牛的精子核寬度在分選后發(fā)生顯著性變化。

A.精子核面積；B.精子核周長(zhǎng)；C.精子核長(zhǎng)度；D.精子核寬度

2.3.2 流式分選對(duì)精子核形狀的影響 比較11頭公牛流式分選前后的精子核形狀(圖5)，11頭公牛中有5頭(5/11)公牛精子核橢圓度、伸長(zhǎng)度和規(guī)則度發(fā)生顯著性變化，3頭(3/11)公牛精子核圓度發(fā)生顯著性變化。但是11頭公牛精子核形狀參數(shù)的平均值在流式分選前后差異不顯著。

A.精子核橢圓度；B.精子核伸長(zhǎng)度；C.精子核規(guī)則度；D.精子核圓度

2.4 冷凍對(duì)牛精子核形態(tài)的影響

本試驗(yàn)分析了冷凍對(duì)14頭荷斯坦公牛精子核形態(tài)的影響，此外，為了研究冷凍對(duì)性控X和Y精子核形態(tài)的影響是否有差異，本試驗(yàn)對(duì)公牛冷凍前后的X和Y精子也進(jìn)行了比較分析。

2.4.1 冷凍對(duì)精子核形態(tài)的影響 采集14頭公牛冷凍前后約1.1萬個(gè)精子核圖像，分析冷凍對(duì)精子核形態(tài)的影響。11頭(11/14)公牛的精子核面積和周長(zhǎng)存在顯著性差異，9頭(9/14)公牛的精子核長(zhǎng)度有顯著性差異，10頭(10/14)公牛的精子核寬度存在顯著性差異，冷凍后精子核大小相關(guān)的4個(gè)參數(shù)發(fā)生顯著性變化的公牛數(shù)量比例均大于50%(圖6A)。而精子核形狀相關(guān)的4個(gè)參數(shù)具有顯著性差異的公牛個(gè)體比例均少于50%，其中有5頭(5/14)公牛的精子核圓度有顯著性差異，6頭(6/14)公牛的精子核規(guī)則度、伸長(zhǎng)度和橢圓度有顯著性差異(圖6B)。

A.精子大小，包括核面積、周長(zhǎng)、長(zhǎng)度和寬；B.精子形狀，包括核橢圓度、圓度、伸長(zhǎng)度和規(guī)則度

2.4.2 冷凍對(duì)X和Y精子核形態(tài)的影響 為比較冷凍對(duì)分選的X和Y精子核形態(tài)的影響是否有差異，本研究比較了12頭公牛精子核大小和形狀在冷凍前后的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Y精子冷凍后精子核大小發(fā)生顯著性變化的公牛數(shù)量(11/12)比X精子(5/12)多6頭。

與未冷凍的X精子相比，少于50%公牛的X精子核大小在冷凍后發(fā)生顯著改變，5頭(5/12)公牛的精子核面積、周長(zhǎng)和寬度發(fā)生顯著變化，3頭(3/12)公牛的精子核長(zhǎng)度發(fā)生了顯著變化。同時(shí)，少數(shù)公牛的精子核形狀發(fā)生變化，4頭(4/12)公牛的精子核橢圓度、伸長(zhǎng)度和規(guī)則度發(fā)生顯著變化，所有公牛的精子核圓度都沒有顯著變化。然而，Y精子冷凍后，超過50%公牛的精子核大小發(fā)生顯著變化，11頭(11/12)公牛的精子核面積、周長(zhǎng)和寬度發(fā)生顯著變化，9頭(9/12)公牛的精子核長(zhǎng)度有顯著變化。少數(shù)公牛Y精子的核形狀發(fā)生變化，4頭公牛(4/12)的精子核橢圓度和伸長(zhǎng)度發(fā)生顯著變化，7頭公牛(7/12)的精子核圓度和2頭(2/12)公牛的規(guī)則度發(fā)生顯著變化。

為了更直觀地顯示X和Y精子大小在冷凍過程中變化差異，以分析兩者抗凍性的差異，本研究計(jì)算出了12頭公牛Y與X精子核大小的冷凍前后的差值，統(tǒng)計(jì)分析每頭公牛X和Y精子核大小差異(包括面積、周長(zhǎng)、長(zhǎng)和寬4個(gè)參數(shù))的總和，并將其繪制為圖7，從圖中可知，精子核面積和周長(zhǎng)是X和Y精子核大小差異的主要原因。為了更準(zhǔn)確地反映X和Y精子核面積和周長(zhǎng)在冷凍過程中變化差異，本研究進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析了12頭公牛X和Y精子核面積和周長(zhǎng)；冷凍前X和Y精子核大小具有顯著差異的只有4頭公牛，冷凍后精子核大小具有顯著性差異的公牛增加到了8頭，如表2所示。

表2 冷凍對(duì)公牛X和Y精子面積及周長(zhǎng)的影響

A.新鮮的Y精子與X精子的差值；B.冷凍后Y精子與X精子的差值。藍(lán)色代表精子核面積，紅色代表周長(zhǎng)，灰色代表精子核長(zhǎng)度，黃色表示精子核寬度

3 討 論

為了獲得準(zhǔn)確的研究結(jié)果，在文獻(xiàn)報(bào)道的不同物種X和Y精子核形態(tài)差異相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，本研究特別采取了以下措施：1)采用較新的圖像處理插件Nuclear Morphology Analysis，能快速準(zhǔn)確的采集和分析精子核二維圖像；2)對(duì)較多的精子樣本進(jìn)行比較分析，為了比較荷斯坦公牛X和Y精子核形態(tài)及其差異，本研究采集了12頭公牛共7 950個(gè)精子圖像用于比較分析，大于現(xiàn)有研究報(bào)道的400～3 300個(gè)精子核圖像[29]；3)對(duì)精子核形態(tài)的8個(gè)參數(shù)進(jìn)行了全面系統(tǒng)的比較分析，除了分析公牛X和Y精子核大小(精子核面積、周長(zhǎng)、長(zhǎng)度和寬度)的差異之外，還比較了其形狀(精子核圓度、橢圓度、伸長(zhǎng)度和規(guī)則度)差異；4)在分析和統(tǒng)計(jì)方法上，不是直接比較12頭公牛X精子核的平均值與Y精子核的平均值的差異，本研究首先檢驗(yàn)了數(shù)據(jù)的正態(tài)性和均方差性，發(fā)現(xiàn)精子核參數(shù)的分布不符合正態(tài)分布，所以選擇非參數(shù)檢驗(yàn)——Mann-Whitney U檢驗(yàn)，對(duì)同一頭牛的X和Y精子使用配對(duì)檢驗(yàn)，然后使用Bonferroni進(jìn)行多重檢驗(yàn)，校正后的P<0.05認(rèn)為具有顯著性差異。本研究在比較了12頭荷斯坦公牛X和Y精子核形態(tài)差異后，發(fā)現(xiàn)4頭公牛性控X和Y精子核大小及形狀存在顯著差異，但X和Y精子核形態(tài)具有顯著性差異的公牛數(shù)量比例(4/12)少于50%，12頭公牛性控X和Y精子形態(tài)相關(guān)參數(shù)的平均值不存在顯著性差異。因此，流式分選后的公牛X和Y精子核形態(tài)存在一定的差異，但是只有少數(shù)公牛的X和Y精子核形態(tài)存在顯著差異。

本研究分析了流式分選、冷凍2種因素對(duì)荷斯坦公牛精子核形態(tài)(大小和形狀)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)流式分選和冷凍對(duì)牛精子核大小具有顯著性影響，對(duì)核形狀的影響相對(duì)較小。現(xiàn)有文獻(xiàn)只報(bào)道了冷凍顯著影響精子核大小[30]，沒有關(guān)于冷凍對(duì)精子核形狀影響的研究報(bào)道，有關(guān)流式分選對(duì)精子核大小和形狀影響的研究報(bào)道也不多。

通過比較流式分選前后11頭荷斯坦公牛的精子核形態(tài)，分析了約1.13萬個(gè)精子核圖像，結(jié)果顯示流式分選后的精子核大小和形狀都發(fā)生了變化，而精子核形狀發(fā)生顯著性變化的牛只數(shù)少于精子核大小發(fā)生顯著性變化的牛只數(shù)。此前在針對(duì)牛、小鼠和豬的研究中發(fā)現(xiàn)，流式分選過程可以導(dǎo)致分選的細(xì)胞發(fā)生明顯變化[31]，包括精子細(xì)胞膜磷脂紊亂[14]、蛋白質(zhì)分布改變[15]等。在牛中，研究者發(fā)現(xiàn)流式分選的精子運(yùn)動(dòng)能力降低，精子頂體的完整性降低，這些都會(huì)影響精子的生育能力。原因可能是機(jī)械[32]和化學(xué)物質(zhì)相關(guān)的流式分選過程會(huì)影響精子與輸卵管的結(jié)合[33]以及線粒體的完整性[34]，從而影響精子的運(yùn)動(dòng)能力和活力。

通過比較14頭荷斯坦公牛冷凍前后精子核形態(tài)(大小和形狀)的變化，發(fā)現(xiàn)冷凍后11頭(11/14)公牛精子核大小和6頭(6/14)公牛精子核形狀發(fā)生顯著變化。與流式分選對(duì)精子核形態(tài)的影響結(jié)果類似，相對(duì)于精子核大小的變化而言，精子核形狀的穩(wěn)定性較高。除此之外，通過比較冷凍對(duì)X和Y精子核形態(tài)的差異影響，發(fā)現(xiàn)冷凍后Y精子核大小發(fā)生顯著性變化的公牛數(shù)量(11/12)比X精子(5/12)多6頭，在冷凍過程中Y精子核大小變化較大，以上結(jié)果顯示，冷凍對(duì)性控X和Y精子核大小影響存在顯著性差異?，F(xiàn)有研究認(rèn)為，精子的抗冷凍性與多種因素有關(guān)，不同亞群的精子具有不同的運(yùn)動(dòng)、功能和形態(tài)特征[35]；能夠快速運(yùn)動(dòng)且頭部面積較小的精子亞群更能抵抗冷凍保存損傷。然而，由于用傳統(tǒng)的分子方法難以單獨(dú)分析存在于精液中的不同精子群，因此冷凍保存期間精子亞群之間存在差異的分子機(jī)制仍然不清楚，有研究者提出這些亞群之間的運(yùn)動(dòng)學(xué)和功能差異可能歸因于不同的蛋白質(zhì)譜[36]。本研究發(fā)現(xiàn)，冷凍對(duì)Y精子核大小的影響大于對(duì)X精子的影響，推測(cè)X精子比Y精子具有更強(qiáng)的抗凍能力。目前還沒有關(guān)于X和Y精子抗凍能力差異的研究報(bào)道?，F(xiàn)有報(bào)道認(rèn)為，冷凍過程中X和Y精子在運(yùn)動(dòng)性能和能量代謝通路等存在差異，如參與形成精子尾部骨架結(jié)構(gòu)的蛋白、線粒體膜蛋白、參與能量代謝調(diào)節(jié)的糖酵解酶和鈣調(diào)素等存在差異[37-38]。冷凍導(dǎo)致精子活力和運(yùn)動(dòng)性能降低的原因主要有3個(gè)：1)冷凍過程中的氧化應(yīng)激反應(yīng)破壞線粒體活性，并損害軸突蛋白以及線粒體蛋白，從而使精子喪失運(yùn)動(dòng)能力[39]；2)冷凍過程改變了公牛精子中與氧化磷酸化和糖酵解相關(guān)酶的豐度和含量[40]，而這兩者是反芻動(dòng)物細(xì)胞代謝產(chǎn)生ATP的主要過程；3)由于細(xì)胞骨架蛋白對(duì)溫度敏感，一些細(xì)胞骨架蛋白的豐度也會(huì)降低[41]。本研究認(rèn)為，X和Y精子核大小對(duì)冷凍的抗性不同，推測(cè)X和Y精子在細(xì)胞骨架和能量代謝存在的差異以及冷凍過程對(duì)線粒體活性和ATP生成的不利影響可能是其部分影響因素。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，雖然性控X和Y精子形態(tài)相關(guān)參數(shù)的平均值不存在顯著性差異，但少數(shù)荷斯坦公牛(約1/3)X和Y精子核形態(tài)具有顯著性差異(P<0.05)，值得進(jìn)一步研究。由于目前流式分選技術(shù)分選獲得的公牛X和Y精子準(zhǔn)確率不能達(dá)到100%，本研究的結(jié)果還需要更多樣本和更準(zhǔn)確的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié) 論

本研究使用較新的圖像處理插件分析了15頭荷斯坦公牛約3.7萬個(gè)精子核的圖像，分析公牛X和Y精子核形態(tài)差異，流式分選和冷凍2種因素對(duì)公牛精子核形態(tài)的影響，以及冷凍對(duì)X和Y精子核形態(tài)的差異影響。明確了流式分選和冷凍對(duì)荷斯坦公牛精子核大小有顯著影響，冷凍對(duì)荷斯坦公牛Y精子核大小的影響程度高于X精子等，將為公牛精液冷凍、性控精子分選等技術(shù)的完善提供參考。