基于轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)研究調(diào)控驢背最長(zhǎng)肌嫩度的分子機(jī)制

李武峰，關(guān)家偉，邱麗霞，孫瑜彤，杜 敏

(1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801；2.美國(guó)華盛頓州立大學(xué)動(dòng)物科學(xué)系，普爾曼 99164-6310)

驢肉是常見(jiàn)的肉類(lèi)食品之一，不僅肉質(zhì)鮮嫩，還富含許多優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)。廣靈驢是早期勞動(dòng)人民多年精心培育的優(yōu)質(zhì)小型驢種，也是中國(guó)五大優(yōu)良驢種之一[1-2]。近年來(lái)，廣靈驢因肉質(zhì)鮮嫩以及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富逐漸受到人們的追捧。嫩度是衡量肉品質(zhì)的感官指標(biāo)之一，是肉食質(zhì)量的決定性感官屬性[3]。許多研究發(fā)現(xiàn)，消費(fèi)者有意愿選購(gòu)嫩度更好的肉食產(chǎn)品[4]。肉質(zhì)的嫩度主要受到肌纖維特性、肌內(nèi)結(jié)締組織特性、肌原纖維蛋白水解酶特性以及肌內(nèi)脂肪含量等相關(guān)因素的影響[5-6]。目前，評(píng)價(jià)肉質(zhì)嫩度的方法主要是華納-布拉茨勒剪切力(WBSF)和肌原纖維斷裂指數(shù)(MFI)[7-8]，此外，高光譜成像技術(shù)可能是進(jìn)行肉質(zhì)嫩度分類(lèi)和可視化的潛在方法[9-10]。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)是一種通過(guò)對(duì)基因表達(dá)情況和調(diào)控規(guī)律進(jìn)行全面研究從而揭示復(fù)雜的生物學(xué)通路以及性狀調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分子機(jī)制的學(xué)科。Fernandez-Barroso等[11]對(duì)不同嫩度伊比利亞豬進(jìn)行RNA-Seq研究，鑒定出了200個(gè)差異表達(dá)基因和245個(gè)新異構(gòu)體。Muniz等[12]利用RNA測(cè)序數(shù)據(jù)鑒定與肉牛嫩度相關(guān)的新mRNA亞型。代謝組學(xué)不僅提供了發(fā)現(xiàn)用于監(jiān)測(cè)和評(píng)估食品質(zhì)量的生物標(biāo)志物的線索，而且還揭示了酶促反應(yīng)產(chǎn)生關(guān)鍵代謝物的分子途徑，已被廣泛應(yīng)用于肌肉和肉類(lèi)科學(xué)的研究[13-14]。Muroya等[15]基于CE-TOF MS的代謝組學(xué)研究揭示了死后豬快慢型肌肉特有的代謝途徑。Wang等[16]通過(guò)核磁共振氫譜(1HNMR)和多元數(shù)據(jù)分析研究了肉雞胸肌木質(zhì)化對(duì)代謝產(chǎn)物譜的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，組氨酸、β-丙氨酸、肌酸、肌酐等代謝物的水平顯著低于正常組。目前，對(duì)畜禽動(dòng)物肉質(zhì)進(jìn)行組學(xué)研究的報(bào)道多見(jiàn)于豬[17]、牛[18-19]、羊[20]和雞[21]等動(dòng)物，而尚未見(jiàn)以驢肉為材料進(jìn)行肉質(zhì)嫩度的研究。

由于單一的轉(zhuǎn)錄組分析獲得的差異表達(dá)基因在代謝通路中作用于多種物質(zhì)，不能直接判斷引起代謝物質(zhì)累積的強(qiáng)度，而代謝組學(xué)可以發(fā)現(xiàn)相關(guān)通路中代謝物種類(lèi)和離子豐度的差異，對(duì)全面解析肉質(zhì)嫩度相關(guān)代謝產(chǎn)物生物合成的調(diào)控機(jī)制具有非常重要的意義。因此，可以借助轉(zhuǎn)錄組與代謝組聯(lián)合分析充分挖掘調(diào)控驢肉嫩度的基因與代謝物，從分子水平上解析驢肉嫩度的調(diào)控機(jī)制。本試驗(yàn)利用轉(zhuǎn)錄組以及代謝組測(cè)序技術(shù)研究不同肉質(zhì)嫩度的廣靈驢背最長(zhǎng)肌組織并篩選出差異表達(dá)基因和差異代謝物，然后通過(guò)聯(lián)合分析來(lái)揭示不同肉質(zhì)嫩度的廣靈驢個(gè)體的生物遺傳機(jī)制，旨在為廣靈驢肉質(zhì)嫩度的分子改良和分子育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

從山西省忻州市繁峙縣田源毛驢養(yǎng)殖科技發(fā)展有限公司選擇30頭生長(zhǎng)環(huán)境和飼養(yǎng)條件相同、33～36月齡的雌性廣靈驢。于屠宰30 min內(nèi)采集第12～13肋骨間的背最長(zhǎng)肌組織，之后于液氮中冷藏備用。

1.2 主要儀器與試劑

石油醚、TRIzol、甲醇、丙醇、甲酸和乙腈均為Merck級(jí)標(biāo)準(zhǔn)品。MAQC-12肌肉嫩度儀(南京銘奧儀器設(shè)備有限公司)；索氏抽提器SXT-02(上海洪紀(jì)儀器設(shè)備有限公司)；超高效液相色譜串聯(lián)傅里葉變換質(zhì)譜儀(Thermo公司)；Illumina Novaseq 6000 測(cè)序儀(Illumina公司)。

1.3 樣品測(cè)定及篩選

利用嫩度儀和索氏抽提儀檢測(cè)廣靈驢背最長(zhǎng)肌的剪切力和肌內(nèi)脂肪含量。對(duì)30頭廣靈驢剪切力和肌內(nèi)脂肪含量進(jìn)行綜合分析，以“剪切力×0.7-肌內(nèi)脂肪含量×100×0.3”為參考，篩選出剪切力和肌內(nèi)脂肪含量存在顯著差異的8頭廣靈驢，并將其分成高嫩度組(HT，n=4)和低嫩度組(LT，n=4)。

1.4 廣靈驢背最長(zhǎng)肌總RNA提取以及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

使用TRIzol試劑從背最長(zhǎng)肌組織中提取總RNA，然后利用Nanodrop 2000和Agilent 2100生物分析儀對(duì)總RNA的濃度、純度以及RIN(RNA integrity number)值進(jìn)行檢測(cè)。取檢驗(yàn)合格的總RNA樣品構(gòu)建cDNA文庫(kù)并在Illumina Novaseq 6000平臺(tái)上進(jìn)行雙端測(cè)序，測(cè)序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。將原始數(shù)據(jù)過(guò)濾后得到高質(zhì)量的質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，并與從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的驢的基因組數(shù)據(jù)(GCF_001305755.1)進(jìn)行比對(duì)，利用Trinity 2.8.4軟件對(duì)reads序列進(jìn)行組裝拼接，利用定量指標(biāo)TPM方法來(lái)計(jì)算基因表達(dá)水平。

1.5 代謝組樣品處理及LC-MS檢測(cè)

取50 mg背最長(zhǎng)肌組織樣本于2 mL離心管中，加入400 μL提取液(甲醇∶水=4∶1(v∶v))進(jìn)行代謝產(chǎn)物提取。樣本經(jīng)研磨、低溫超聲提取、靜置、離心后移取上清液至進(jìn)樣瓶中上機(jī)分析。所有樣品均采用LC-MS進(jìn)行分析，每組樣品有6個(gè)生物學(xué)重復(fù)。色譜條件：HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm i.d., 1.8 μm)；流動(dòng)相(A為95%水+5%乙腈，B為47.5%乙腈+47.5%異丙醇+5%水，A、B相均含0.1%甲酸)；柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。質(zhì)譜條件：采用正、負(fù)離子兩種模式采集質(zhì)譜信號(hào)，電壓為3 500 V和-2 800 V；鞘氣40 psi，輔助加熱氣10 psi，離子源加熱溫度400 ℃，20～40～60 V循環(huán)碰撞能。

1.6 轉(zhuǎn)錄組、代謝組的數(shù)據(jù)分析及聯(lián)合分析

使用DESeq2[22]進(jìn)行組間基因的差異分析，計(jì)算每個(gè)基因的差異表達(dá)倍數(shù)(Fold Change，F(xiàn)C)，并以|log2Fold-Change|≥1且矯正后的P值(P-adjust)<0.05為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達(dá)基因。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG富集分析[23]，并以P-adjust<0.05為判斷標(biāo)準(zhǔn)。利用主成分分析(PCA)和正交最小偏二乘判別分析(OPLS-DA)來(lái)判定各樣本間的差異大小。差異代謝物的選擇基于變量權(quán)重值(VIP)和Student’s-t檢驗(yàn)P值來(lái)確定，VIP≥1且P-adjust<0.05的代謝物為顯著差異代謝物。通過(guò)KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行的代謝通路注釋?zhuān)訮-adjust<0.05為條件判斷KEGG通路存在顯著富集情況。利用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異表達(dá)基因與代謝物進(jìn)行通路富集分析，利用R語(yǔ)言cor函數(shù)算出兩者的斯皮爾曼(Spearman)系數(shù)，以相關(guān)系數(shù)大于0.8為篩選標(biāo)準(zhǔn)，之后用Cytoscape構(gòu)建基因-代謝物網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié) 果

2.1 廣靈驢背最長(zhǎng)肌剪切力和肌內(nèi)脂肪含量的測(cè)定

高嫩度組(HT，n=4)和低嫩度組(LT，n=4)的廣靈驢肌內(nèi)脂肪含量和剪切力值如表1所示，LT組與HT組差異極顯著(P<0.000 1)。

表1 廣靈驢背最長(zhǎng)肌剪切力和肌內(nèi)脂肪含量的描述性統(tǒng)計(jì)

2.2 廣靈驢背最長(zhǎng)肌組織差異表達(dá)基因篩選

與對(duì)照組(LT組)相比較，在HT組中共鑒定出1 253個(gè)差異表達(dá)基因，其中表達(dá)量發(fā)生上調(diào)(up)的基因共有832個(gè)，占差異基因總數(shù)的66.40%，表達(dá)量發(fā)生下調(diào)(down)的基因共有421個(gè)，占差異基因總數(shù)的33.60%(圖1)。對(duì)HT和LT兩組中的差異表達(dá)基因進(jìn)行了聚類(lèi)分析，從圖2中可以看出，8個(gè)樣本聚為兩個(gè)類(lèi)別，HT組中的樣本HT1、HT3、HT2、HT4聚為一類(lèi)，LT組的樣本LT2、LT4、LT1、LT3聚為一類(lèi)，這說(shuō)明這些聚集基因可能具有相似的功能注釋或者處于同一條代謝通路，且不同組間樣本具有明顯的表達(dá)差異。

圖1 HT組和LT組的組間差異表達(dá)基因火山圖

橫坐標(biāo)為樣本，縱坐標(biāo)為基因聚類(lèi)

2.3 廣靈驢背最長(zhǎng)肌組織差異基因KEGG富集分析

將1 253個(gè)差異基因進(jìn)行KEGG富集分析，結(jié)果顯示共富集到310個(gè)代謝途徑，其中29個(gè)代謝途徑顯著富集(P<0.05)，選取顯著富集的前25條KEGG代謝通路進(jìn)行展示(圖3)，其中AMPK信號(hào)通路、糖酵解/糖異生、胰高血糖素信號(hào)通路、黏附斑激酶信號(hào)通路、磷酸戊糖途徑、果糖和甘露糖代謝、胰島素抵抗、甘油酯代謝、甘油磷脂代謝、HIF-1信號(hào)通路以及胰島素信號(hào)通路等多種通路可能影響廣靈驢的肉質(zhì)嫩度。

圖3 KEGG富集分析散點(diǎn)圖

2.4 廣靈驢背最長(zhǎng)肌組織代謝組PCA分析和OPLS-DA分析

PCA分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)(圖4)，正、負(fù)離子模式中的組間樣本被區(qū)分開(kāi)，QC樣本均能聚集在中心點(diǎn)附近，表明兩組之間的代謝物存在差異，分析方法重復(fù)性較好。OPLS-DA分析表明(圖5)，HT組和LT組在正、負(fù)離子模式下均有效地分成兩類(lèi)，表明各組間代謝物表型存在顯著差異。為了避免過(guò)度擬合，本研究還進(jìn)行了OPLS-DA模型驗(yàn)證(置換檢驗(yàn)n=200)，正、負(fù)兩種離子模式下的R2與Q2截距分別達(dá)到0.928 7、-0.009 3和0.936、-0.117 7，說(shuō)明兩個(gè)模型具有較好穩(wěn)定性且不存在過(guò)擬合現(xiàn)象。這些結(jié)果表明，材料具有足夠的重現(xiàn)性，使其適合于以下分析驗(yàn)證。

2.5 廣靈驢背最長(zhǎng)肌組織代謝產(chǎn)物分析與鑒定

在正、負(fù)兩種離子模式下共檢測(cè)出699種具有已知結(jié)構(gòu)的代謝物。和LT組相比，HT組中篩選出225個(gè)差異代謝物，正離子模式下159個(gè)(圖6A)，其中上調(diào)代謝物107個(gè)，下調(diào)代謝物52個(gè)；負(fù)離子模式下66個(gè)(圖6B)，其中上調(diào)代謝物47個(gè)，下調(diào)代謝物19個(gè)。

A.正離子模式下差異代謝物火山圖；B.負(fù)離子模式下差異代謝物火山圖。散點(diǎn)大小表示OPLS-DA模型的VIP值，紅色表示代謝物含量增加，藍(lán)色表示代謝物含量降低，灰色表示無(wú)顯著差異

2.6 廣靈驢背最長(zhǎng)肌組織差異代謝物KEGG富集分析

將差異代謝物富集到KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共有111條通路得到富集，其中有20條KEGG代謝通路顯著富集(P<0.05，圖7)。在這些代謝通路中，嘌呤代謝，磷酸戊糖途徑，組氨酸代謝，甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝，甘油磷脂代謝，谷胱甘肽代謝，F(xiàn)oxO信號(hào)通路，D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝，檸檬酸鹽循環(huán)，精氨酸生物合成，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝等11個(gè)通路可能與廣靈驢的肉質(zhì)嫩度有關(guān)。

圖7 差異代謝物KEGG富集圖

2.7 廣靈驢背最長(zhǎng)肌組織轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合KEGG通路分析

為深入了解廣靈驢肉質(zhì)相關(guān)作用機(jī)制，本研究對(duì)相同分組的差異基因和代謝物進(jìn)行KEGG聯(lián)合分析。將HT組和LT組的差異代謝物與差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路聯(lián)合分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)共有57條共富集通路，有6條代謝通路(甘油磷脂代謝，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，磷酸戊糖途徑，精氨酸和脯氨酸代謝，胰高血糖素信號(hào)通路以及PPAR信號(hào)通路)在KEGG聯(lián)合通路中富集(P<0.1)，并可能參與了廣靈驢肉質(zhì)嫩度的調(diào)控(表2)。

表2 轉(zhuǎn)錄組和代謝組聯(lián)合KEGG富集分析部分通路

2.8 廣靈驢背最長(zhǎng)肌組織差異表達(dá)基因、差異代謝物相關(guān)性及網(wǎng)絡(luò)圖分析

對(duì)HT組和LT組差異表達(dá)基因和差異代謝物進(jìn)行相關(guān)性分析，并通過(guò)相關(guān)性分析篩選KEGG通路中差異表達(dá)基因和差異代謝物。發(fā)現(xiàn)在甘油磷脂代謝，胰高血糖素信號(hào)通路，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，磷酸戊糖途徑，精氨酸和脯氨酸代謝中存在Spearman相關(guān)系數(shù)大于0.8的基因和代謝物，繪制相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖并解釋代謝物和基因之間的相互關(guān)系。甘油磷脂代謝通路中，上調(diào)代謝物膽堿、溶血磷脂酰膽堿(18:1(9Z))、溶血磷脂酰膽堿(17:0)、溶血磷脂酰膽堿(18:0)與上調(diào)基因GPAM的正相關(guān)性強(qiáng)；上調(diào)代謝物甘油磷酸膽堿與上調(diào)基因(GPAM、DGKE)的正相關(guān)性較強(qiáng)；上調(diào)代謝物甘油磷?；掖及放c上調(diào)基因(PLA2G12A、DGKE、DGKH、GPAM)的正相關(guān)性強(qiáng)(圖8A)。在磷酸戊糖途徑中，上調(diào)代謝物1-磷酸核糖與下調(diào)基因(PFKM、PGM1、GPI、LOC106841113、LOC106828083)的負(fù)相關(guān)性較強(qiáng)；上調(diào)代謝物7-磷酸景天庚酮糖與下調(diào)基因(PFKM、PGM1、GPI)的負(fù)相關(guān)性強(qiáng)(圖8B)。在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路中，上調(diào)代謝物腺苷酸基琥珀酸和檸檬酸與上調(diào)基因RIMKLB和下調(diào)基因DDO有較強(qiáng)的相關(guān)性(圖8C)。在精氨酸和脯氨酸代謝通路中，下調(diào)代謝物肌酸與上調(diào)基因LOC106837908和下調(diào)基因GAMT的相關(guān)性強(qiáng)(圖8D)。在胰高血糖素信號(hào)通路中，上調(diào)代謝物檸檬酸與下調(diào)基因PRKAB2的負(fù)相關(guān)性強(qiáng)(圖8E)。

A.甘油磷脂代謝；B.磷酸戊糖途徑；C.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝；D.精氨酸和脯氨酸代謝；E.胰高血糖素信號(hào)通路。橢圓代表代謝物，菱形代表基因，實(shí)線表示正相關(guān)，虛線線表示負(fù)相關(guān)

3 討 論

驢肉是常見(jiàn)的肉類(lèi)食品之一，驢肉的品質(zhì)和口感直接影響消費(fèi)者的選擇意愿，廣靈驢作為山西地方品種，具有肉質(zhì)鮮嫩、肌內(nèi)脂肪含量高等特點(diǎn)。因此本試驗(yàn)以廣靈驢為研究對(duì)象，對(duì)具有不同嫩度背最長(zhǎng)肌的廣靈驢進(jìn)行了研究，找到了嫩度的相關(guān)差異表達(dá)基因，并通過(guò)結(jié)合差異代謝物進(jìn)行聯(lián)合分析，從轉(zhuǎn)錄和代謝水平共同探究調(diào)控廣靈驢肉質(zhì)嫩度的分子機(jī)制。

本試驗(yàn)對(duì)HT和LT兩組進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析，共發(fā)現(xiàn)有1 253個(gè)差異基因，其中發(fā)生上調(diào)的基因有832個(gè)，下調(diào)的基因有421個(gè)，KEGG通路涉及到碳水化合物代謝(糖酵解/糖異生、磷酸戊糖途徑、果糖和甘露糖代謝)，脂質(zhì)代謝(甘油酯代謝、甘油磷脂代謝)，內(nèi)分泌系統(tǒng)(胰高血糖素信號(hào)通路、胰島素信號(hào)通路、胰島素抵抗)，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(HIF-1信號(hào)通路、AMPK信號(hào)通路)以及細(xì)胞過(guò)程(黏附斑激酶信號(hào)通路)等多種途徑。代謝組分析發(fā)現(xiàn)，在HT組和LT組共篩選出225個(gè)差異代謝物，其中上調(diào)154個(gè)，下調(diào)71個(gè)。之后進(jìn)行了KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)主要涉及到碳水化合物代謝(磷酸戊糖途徑、檸檬酸循環(huán))，脂質(zhì)代謝(甘油磷脂代謝)，氨基酸代謝(組氨酸代謝、甘氨酸，絲氨酸和蘇氨酸代謝、谷胱甘肽代謝、D-谷氨酰胺與D-谷氨酸代謝、精氨酸生物合成和丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代謝)，核苷酸代謝(嘌呤代謝)以及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)(FoxO信號(hào)通路)等多個(gè)途徑。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組和代謝組進(jìn)行聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)富集到KEGG的共同通路有57條，其中甘油磷脂代謝，磷酸戊糖途徑，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，精氨酸和脯氨酸代謝以及胰高血糖素信號(hào)通路可能參與了廣靈驢肉質(zhì)嫩度的調(diào)控。

磷脂是肌內(nèi)脂肪中主要的活性成分，而甘油磷脂是磷脂中含量最多的一種。甘油磷脂不僅能夠參與生物體內(nèi)細(xì)胞膜對(duì)蛋白質(zhì)的識(shí)別和信號(hào)傳導(dǎo)[24]，還能活化細(xì)胞并促進(jìn)脂肪代謝和血清膽固醇的降低等[25]。研究發(fā)現(xiàn)，膽堿類(lèi)化合物是肉質(zhì)嫩度的重要指標(biāo)[17]。在甘油磷脂代謝通路中，膽堿、溶血磷脂酰膽堿(18:1(9Z))、溶血磷脂酰膽堿(17:0)、溶血磷脂酰膽堿(18:0)都與GPAM基因的正相關(guān)性強(qiáng)；代謝物甘油磷酸膽堿與GPAM和DGKE基因的正相關(guān)性較強(qiáng)；代謝物甘油磷?；掖及放cPLA2G12A、DGKE、DGKH和GPAM基因的正相關(guān)性強(qiáng)。PLA2G12A基因在脂質(zhì)催化過(guò)程和磷脂代謝過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，并與肌內(nèi)脂肪有一定的相關(guān)性，因此它可能有助于的脂肪沉積[26]。二甘油激酶(DGKs)能夠?qū)⒏视投チ姿峄⑵滢D(zhuǎn)化為磷脂酸，從而在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮作用。作為DGKs的亞型，DGKE和DGKH基因在調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝方面發(fā)揮了一定的作用從而對(duì)脂肪的沉積產(chǎn)生一定的影響[27-28]。而GPAM基因也在肌內(nèi)脂肪的形成中起調(diào)控作用[29]。因此，甘油磷脂代謝通路中的相關(guān)基因可能通過(guò)參與磷脂代謝的相關(guān)過(guò)程來(lái)調(diào)控肌內(nèi)脂肪的沉積，從而對(duì)肉質(zhì)嫩度產(chǎn)生一定的影響。Hamill等[30]對(duì)豬肉嫩度和肌內(nèi)脂肪含量相關(guān)基因進(jìn)行了功能分析，發(fā)現(xiàn)與嫩度相關(guān)的差異基因顯著富集在甘油磷脂代謝和磷酸戊糖途徑中，與肌內(nèi)脂肪相關(guān)的基因在磷酸戊糖途徑中也得到顯著富集，這與本研究結(jié)果相一致。

磷酸戊糖途徑是葡萄糖代謝中的重要代謝途徑，其中的NADPH可以參與生物大分子的合成，同時(shí)也可以使體內(nèi)的氧化還原處于穩(wěn)定狀態(tài)，使得肌肉的抗氧化能力增強(qiáng)[31]。在磷酸戊糖途徑中，1-磷酸核糖和7-磷酸景天庚酮糖分別與PFKM、PGM1、GPI、LOC106841113、LOC106828083基因以及PFKM、PGM1、GPI基因的負(fù)相關(guān)性強(qiáng)。PFKM是一個(gè)能夠在糖酵解過(guò)程中進(jìn)行調(diào)節(jié)的酶，也是葡萄糖代謝的主要控制點(diǎn)[32]。PGM1能夠可逆地催化磷酸葡萄糖第1和第6位置間磷酸基的轉(zhuǎn)移，在糖原代謝調(diào)節(jié)中起重要作用。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，PGM1可進(jìn)行磷酸化、乙酰化和甲基化等翻譯后修飾，翻譯后修飾影響著新陳代謝和宰后肌肉肉質(zhì)的轉(zhuǎn)變[33]，Silva等[34]利用蛋白質(zhì)組學(xué)研究表明，包括PGM1在內(nèi)的肌肉蛋白磷酸化可能是導(dǎo)致牛肉嫩度最終差異的原因。GPI是參與糖酵解的一種酶，能夠促進(jìn)葡萄糖-6-磷酸與果糖-6-磷酸的相互轉(zhuǎn)換[35]。LOC106841113和LOC106828083兩個(gè)基因都注釋到果糖-1,6-二磷酸酶基因(FBP)中，F(xiàn)BP是糖異生途徑第二步反應(yīng)的限速酶，在葡萄糖生成或糖原合成中發(fā)揮功能[36]。作為參與磷酸戊糖途徑中的相關(guān)基因，PFKM、LOC106841113、LOC106828083、PGM1、GPI等基因可能參與肌肉能量代謝的調(diào)控，從而對(duì)肉質(zhì)嫩度產(chǎn)生一定的影響。

肌肉中氨基酸含量不僅影響著蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)也影響著肉質(zhì)嫩度和風(fēng)味[37]。通常，氨基酸是動(dòng)物死后早期肌肉的重要能量來(lái)源，因?yàn)樗鼈兌伎梢越到鉃闄幟仕猁}循環(huán)的一部分或可以轉(zhuǎn)換為該循環(huán)的一部分的中間化合物[38]，從而改變動(dòng)物死后早期能量狀態(tài)的差異而影響蛋白水解并有利于肉的嫩化。在丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路中，本研究發(fā)現(xiàn)代謝物腺苷酸基琥珀酸和檸檬酸與RIMKLB、DDO基因有較強(qiáng)的相關(guān)性。RIMKLB基因能夠編碼N-乙酰天冬氨酸谷氨酸合成酶I，并在HT組中上調(diào)。DDO是一種D-天冬氨酸氧化酶，是目前唯一能夠降解雙羧酸D-氨基酸的酶[39]。在此通路中，RIMKLB和DDO均與腺苷酸基琥珀酸和檸檬酸有一定的相關(guān)性，說(shuō)明這兩個(gè)基因可能參與了丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝通路中的相關(guān)過(guò)程，并對(duì)肉質(zhì)嫩度產(chǎn)生了一定的作用。在精氨酸和脯氨酸代謝通路中，代謝物肌酸與LOC106837908和GAMT基因的相關(guān)性強(qiáng)。肌肉中的肌酸主要以N-磷酸肌酸的形式存在，它是收縮肌肉纖維的主要能量來(lái)源[40]，GAMT是肌酸生物合成最后一步的反應(yīng)酶。Rosa等[41]比較了不同鈣蛋白酶基因型內(nèi)洛爾牛的肌肉蛋白質(zhì)譜，發(fā)現(xiàn)GAMT基因與嫩度表型相關(guān)。另外，在胰高血糖素信號(hào)通路中，代謝物檸檬酸與PRKAB2基因的負(fù)相關(guān)性強(qiáng)。一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)是一種能量穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)器，在對(duì)外部應(yīng)激反應(yīng)的能量穩(wěn)態(tài)控制中起著重要作用[42]。AMPK是由催化亞基α和兩個(gè)調(diào)節(jié)亞基β和γ組成的異三聚絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其中PRKAB2編碼AMPKβ2亞基[43]。AMPK可以有效的促進(jìn)肌肉對(duì)葡萄糖的吸收，保證骨骼肌中的糖原含量，骨骼肌代謝會(huì)影響肌肉結(jié)構(gòu)與生物學(xué)特性，進(jìn)一步改變?nèi)赓|(zhì)的嫩度[44]。在此通路中，檸檬酸與PRKAB2基因具有一定的相關(guān)性，并對(duì)肉質(zhì)嫩度的調(diào)控具有一定的作用。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和代謝組學(xué)對(duì)不同肉質(zhì)嫩度的廣靈驢的背最長(zhǎng)肌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)了精氨酸和脯氨酸代謝，甘油磷脂代謝，磷酸戊糖途徑，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝以及胰高血糖素信號(hào)通路可能參與廣靈驢不同肉質(zhì)嫩度之間的調(diào)控，從而揭示了不同肉質(zhì)嫩度的廣靈驢的轉(zhuǎn)錄和代謝響應(yīng)規(guī)律，涉及到PLA2G12A、DGKE、DGKH、GPAM、PFKM、PGM1、GPI、RIMKLB、DDO、GAMT等基因以及1-磷酸核糖、7-磷酸景天庚酮糖、甘油磷酸膽堿、溶血磷脂酰膽堿(18:1(9Z))、膽堿、溶血磷脂酰膽堿(17:0)、溶血磷脂酰膽堿(18:0)、甘油磷?；掖及?、腺苷酸基琥珀酸、檸檬酸和肌酸等代謝物。該研究結(jié)果有助于解析具有不同背最長(zhǎng)肌肌肉嫩度的廣靈驢個(gè)體的遺傳差異，為進(jìn)一步研究廣靈驢的分子育種提供了理論依據(jù)。