初生和成年黑藏羊肉品質(zhì)與肌纖維特性差異分析

周 力，高占紅，侯生珍，楊葆春，王志有，桂林生

(青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016)

黑藏羊俗稱黑裘皮羊，以生產(chǎn)黑色二毛裘皮著稱，是藏系綿羊中重要的經(jīng)濟(jì)類(lèi)群[1]。當(dāng)前黑藏羊產(chǎn)業(yè)由生產(chǎn)裘皮向肉用逐步轉(zhuǎn)型，若能了解其肌纖維類(lèi)型分布以及肉質(zhì)等變化規(guī)律，對(duì)于保護(hù)地方品種資源，提高農(nóng)牧民經(jīng)濟(jì)收入以及推動(dòng)青海特色畜牧業(yè)發(fā)展均具有重要意義。長(zhǎng)期以來(lái)，羊肉產(chǎn)品以高蛋白、低脂肪、低膽固醇、味道鮮美、富含維生素和礦物質(zhì)特征而備受青睞。羊肉肉質(zhì)主要受飼料種類(lèi)、飼養(yǎng)方式以及遺傳因素的影響[2]，肉羊年齡也是一個(gè)重要方面[3]。研究發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于50日齡羔羊，100日齡的羔羊肉中干物質(zhì)、總蛋白質(zhì)和粗蛋白質(zhì)含量更高，而50日齡的羔羊肉則具有更強(qiáng)的持水力[4]。其他試驗(yàn)也表明，不同年齡組間牦牛背最長(zhǎng)肌中過(guò)氧化氫酶、總超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和總抗氧化能力差異均不顯著，但隨著年齡的增長(zhǎng)，丙二醛含量不斷上升，4.5歲組比1.5歲組升高了53.80%[5]。由此可以看出，不同發(fā)育時(shí)期反芻動(dòng)物肌肉中營(yíng)養(yǎng)成分與抗氧化能力均存在一定差異性。

肌纖維類(lèi)型是決定肌肉特性的重要因素，根據(jù)肌動(dòng)蛋白重鏈上ATP酶對(duì)酸堿的穩(wěn)定性可以將肌纖維分成3種類(lèi)型，即Ⅰ型(慢速氧化型肌纖維)、ⅡA型(快速氧化型肌纖維)和ⅡB型(快速酵解型肌纖維)[6]。王麗莎等[7]指出，不同類(lèi)型的肌纖維代表著不同的結(jié)構(gòu)、功能及代謝特征。當(dāng)肌肉中氧化型肌纖維所占比例較高時(shí)，肌肉細(xì)嫩多汁，系水力強(qiáng)，肉質(zhì)也較好[8]。以土耳其地方綿羊品種為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)肌纖維的形態(tài)特性，如肌纖維類(lèi)型、數(shù)目和直徑會(huì)對(duì)肉品質(zhì)產(chǎn)生重要的影響[9]。日糧添加乳酸菌試驗(yàn)表明[10]，可以通過(guò)提高氧化型肌纖維的比例改善肌肉色澤，提高肌肉嫩度，繼而改善蘇尼特羊肉品質(zhì)。在肉羊上也進(jìn)一步證實(shí)，肌球蛋白重鏈基因表達(dá)水平的變化能夠反映肌纖維類(lèi)型轉(zhuǎn)化的程度[11]。由此可知，肉質(zhì)特性受年齡的影響較大，且不同年齡的肌肉品質(zhì)與其肌纖維類(lèi)型以及MyHCs基因的mRNA表達(dá)量差異關(guān)系密切。

目前，現(xiàn)階段有關(guān)黑藏羊的研究相對(duì)匱乏，僅有針對(duì)不同性別黑藏羊肉品質(zhì)特性的差異分析[12]?；诖耍驹囼?yàn)以自然放牧條件下的初生羔羊和成年黑藏羊?yàn)樵囼?yàn)對(duì)象，通過(guò)對(duì)其肌肉常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分、抗氧化能力、肌纖維組織學(xué)特性及其MyHCs基因的表達(dá)水平進(jìn)行分析比較，進(jìn)而為開(kāi)展青海黑藏羊肉品質(zhì)相關(guān)研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

試驗(yàn)選用青海省海北州貴南縣自然放牧條件下發(fā)育正常、健康無(wú)病的初生黑藏羊公羔(平均體重(2.31±0.49)kg)和12月齡成年黑藏羊公羊(平均體重(36.58±1.26)kg)各5只。試驗(yàn)羊只屠宰后，采集其左側(cè)胴體第12～13肋骨間背最長(zhǎng)肌，液氮保存待用。

包埋劑(日本Sakura公司)，二甲苯(廣東光華科技股份有限公司)，乙醇(天津富宇精細(xì)化工有限公司)，總抗氧化能力、丙二醛含量，超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶活性試劑盒(南京建成生物工程研究所有限公司)，RNA Prep Pure總RNA(動(dòng)物組織)提取試劑盒D431，F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成試劑盒(去基因組)KR106和SuperReal PreMix Color(SYBR Green)試劑盒等均購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

德國(guó)LEICA切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；美國(guó)Bio-Rad伯樂(lè)凝膠成像分析系統(tǒng)(北京賽百奧科技有限公司)；羅氏實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(北京眾力挽生物科技有限公司)；科華酶標(biāo)儀(上海科華生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 肌肉常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定 水分(moisture)含量參照GB5009.3—2016進(jìn)行測(cè)定；粗灰分(ash)含量參照GB5009.4—2016進(jìn)行測(cè)定；粗蛋白(crude protein, CP)含量參照GB/T5009.5—2016進(jìn)行測(cè)定；粗脂肪(ether extract, EE)含量參照GB 5009.6—2016進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 肌肉抗氧化指標(biāo)檢測(cè) 抗氧化指標(biāo)包括超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶活性，總抗氧化能力及丙二醛含量，具體操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 肌纖維組織形態(tài)學(xué)特性測(cè)定

1.3.3.1 樣品采集和制片：將樣品沿著肌纖維的橫向方向切成0.5 cm×0.5 cm×1.0 cm大小的肉樣，經(jīng)過(guò)預(yù)冷的異戊烷干燥30 s后，將肉塊放入冰凍切片機(jī)內(nèi)進(jìn)行切片(厚度約8 μm)，再利用堿孵育ATPase對(duì)黑藏羊背最長(zhǎng)肌進(jìn)行染色。

1.3.3.2 肌纖維各項(xiàng)指標(biāo)分析：利用顯微鏡彩圖分析軟件在20×10倍下觀察并分析肌纖維組織學(xué)特性的相關(guān)指標(biāo)。每個(gè)片子隨機(jī)選取3～5個(gè)視野，使測(cè)定的肌纖維總數(shù)大于1 500根。1)肌纖維直徑(muscle fiber diameter)：測(cè)量每根肌纖維橫截面最長(zhǎng)兩點(diǎn)距離，作為長(zhǎng)軸，垂直于長(zhǎng)軸的最短兩點(diǎn)距離，作為短軸，多次測(cè)量求其平均值；2)肌纖維橫切面積(muscle fiber cross-sectional area)：圈出視野內(nèi)各型肌纖維的橫截面積，測(cè)多根取其平均值；3)肌纖維密度(muscle fiber density)：計(jì)算每個(gè)視野的面積，并統(tǒng)計(jì)每個(gè)視野內(nèi)肌纖維的根數(shù)，將其換算成每平方毫米的根數(shù)；4)肌纖維數(shù)量比例(number rate of muscle fiber)：每種類(lèi)型肌纖維數(shù)量除以肌纖維總數(shù)量即為肌纖維數(shù)量比例，公式如(1)所示：

(1)

5)肌纖維面積比例(area rate of muscle fiber)：每種肌纖維總面積除以總肌纖維面積即為肌纖維面積比例，公式如(2)所示：

(2)

1.3.4MyHCs基因表達(dá)量測(cè)定 利用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒提取黑藏羊肌肉中總RNA，利用1.5%瓊脂糖和超微量核酸蛋白儀分別檢測(cè)RNA完整性、濃度和純度，將符合要求的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照SuperReal PreMix Color(SYBR Green)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。qPCR反應(yīng)體系為：1.6 μL cDNA模板，上、下游引物各0.8 μL，2×SuperReal Color PreMix 10 μL，RNase-free ddH2O 6.8 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 15 min，95 ℃變性 10 s，60 ℃退火/延伸 30 s，40個(gè)循環(huán)。引物由上海生工生物設(shè)計(jì)合成。內(nèi)參基因(GAPDH)和目的基因(MyHCI、MyHCⅡA及MyHCⅡB)序列如表1所示。

表1 引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

本研究采用2-ΔΔCt法作為目的基因表達(dá)量的分析方法[13]，試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel(2020)初步計(jì)算處理，在初生羔羊和成年羊間的數(shù)據(jù)差異作獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)”表示，以P<0.05作為顯著性判斷的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 不同生長(zhǎng)期黑藏羊背最長(zhǎng)肌常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的比較

由表2可知，相較于初生羔羊，成年羊背最長(zhǎng)肌中水分(moisture)、灰分(ash)、粗蛋白(CP)以及粗脂肪(EE)含量差異均不顯著(P>0.05)。這說(shuō)明黑藏羊肌肉中營(yíng)養(yǎng)成分的含量受年齡影響較小。

表2 黑藏羊肌肉常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分指標(biāo)分析

2.2 不同生長(zhǎng)期黑藏羊背最長(zhǎng)肌抗氧化能力的比較

由表3可知，與初生羔羊相比，成年羊背最長(zhǎng)肌中總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)含量，超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)以及谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性差異均不顯著(P>0.05)。這表明不同發(fā)育階段對(duì)黑藏羊肌肉抗氧化能力影響不顯著。

表3 黑藏羊肌肉抗氧化指標(biāo)分析

2.3 不同生長(zhǎng)期黑藏羊背最長(zhǎng)肌組織形態(tài)學(xué)特性的比較

肌纖維直徑分析結(jié)果如圖1所示。初生羔羊背最長(zhǎng)肌肌纖維直徑Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型均顯著小于成年羊(P<0.05)。由此可見(jiàn)，不同年齡階段黑藏羊肌纖維直徑Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型差異較大。

*表示差異顯著(P<0.05)，下同

肌纖維橫截面積分析結(jié)果如圖2所示。成年羊背最長(zhǎng)肌肌纖維橫截面積Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型均顯著高于初生羔羊(P<0.05)。由此可知，不同發(fā)育時(shí)期對(duì)黑藏羊肌纖維橫截面積Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型具有明顯的影響。

圖2 不同生長(zhǎng)期黑藏羊背最長(zhǎng)肌肌纖維橫截面積的比較

肌纖維密度分析結(jié)果如圖3所示。初生羔羊背最長(zhǎng)肌肌纖維密度Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型均高于成年羊，其中2組間肌纖維密度Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型差異顯著(P<0.05)。由此揭示，不同生長(zhǎng)時(shí)期黑藏羊肌纖維密度Ⅰ型、ⅡA型和ⅡB型存在一定的差異。

圖3 不同生長(zhǎng)期黑藏羊背最長(zhǎng)肌肌纖維密度的比較

由表4可知，初生羔羊背最長(zhǎng)?、裥图±w維數(shù)量比例顯著高于成年羊(P<0.05)。2組間黑藏羊背最長(zhǎng)肌肌纖維ⅡA型和ⅡB型差異均不顯著(P>0.05)。據(jù)此可見(jiàn)，隨著黑藏羊年齡的增長(zhǎng)，肌肉中Ⅰ型肌纖維數(shù)量比例會(huì)明顯減少。

表4 不同生長(zhǎng)期黑藏羊背最長(zhǎng)肌肌纖維數(shù)量比例的比較

由表5可知，成年羊背最長(zhǎng)肌Ⅰ型和ⅡA型肌纖維面積比例顯著低于初生羔羊(P<0.05)。2組間黑藏羊背最長(zhǎng)肌肌纖維ⅡB型差異不顯著(P>0.05)，據(jù)此可知，隨著黑藏羊年齡的變化，肌肉中Ⅰ型和ⅡA型肌纖維面積比例會(huì)明顯降低。

表5 不同生長(zhǎng)期黑藏羊背最長(zhǎng)肌肌纖維面積比例的比較

2.4 不同生長(zhǎng)期黑藏羊背最長(zhǎng)肌MyHCs基因表達(dá)規(guī)律

黑藏羊MyHCs基因的表達(dá)水平如圖4所示，羔羊背最長(zhǎng)肌中MyHCⅠ和MyHCⅡA基因的表達(dá)量顯著低于成年羊(P<0.05)，而MyHCⅡB基因的表達(dá)量則呈現(xiàn)相反的趨勢(shì)(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，不同生長(zhǎng)期黑藏羊肌肉中MyHCs基因表達(dá)水平差異明顯。

圖4 黑藏羊MyHCs基因的表達(dá)量(n=5)

2.5 MyHCs基因表達(dá)量與肉品質(zhì)的相關(guān)性分析

通過(guò)相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)(表6)，水分、灰分、總抗氧化能力、過(guò)氧化氫酶、超氧化物歧化酶與MyHCⅠ、MyHCⅡA正相關(guān)；與MyHCⅡB負(fù)相關(guān)，而丙二醛則表現(xiàn)相反趨勢(shì)。粗脂肪、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶與MyHCⅠ、MyHCⅡA之間正相關(guān)，其中與MyHCⅠ顯著正相關(guān)(P<0.05)，但與MyHCIIB負(fù)相關(guān)。粗蛋白質(zhì)與MyHCⅠ、MyHCⅡA之間正相關(guān)，其中與MyHCⅡA呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，但與MyHCⅡB負(fù)相關(guān)。以上結(jié)果表明，黑藏羊背最長(zhǎng)肌肌纖維特性與肉品質(zhì)是密切相關(guān)的。

表6 MyHCs表達(dá)量與肉品質(zhì)的相關(guān)性分析

3 討 論

3.1 不同生長(zhǎng)期黑藏羊背最長(zhǎng)肌常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分的比較

水分、粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、礦物質(zhì)和維生素等均是羊肉常規(guī)營(yíng)養(yǎng)成分，其組成和含量是營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的直接體現(xiàn)[14]。其中水分含量與肌肉的多汁性關(guān)系密切，若水分含量越高，口感就越好，機(jī)體更易消化吸收?；曳趾吭蕉啵馕吨∪庵兴V物質(zhì)元素和部分微量元素的含量也就越高[15]。本試驗(yàn)中，羔羊和成年羊背最長(zhǎng)肌中水分和灰分含量差異不顯著。說(shuō)明隨著黑藏羊年齡的增長(zhǎng)，肌肉的多汁性以及礦物質(zhì)含量沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。粗蛋白和粗脂肪的含量直接決定著肌肉的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[16]。研究發(fā)現(xiàn)，3歲羊肌內(nèi)脂肪含量極顯著高于4月齡羔羊[17]。其他試驗(yàn)也表明，隨著湖羊年齡的增長(zhǎng)，肌肉中除水分降低外，粗脂肪、粗蛋白質(zhì)、粗灰分、鈣和磷的含量逐漸增加，且成年羊與初生羔羊和斷奶羔羊間差異顯著[18]。孟凡珠等[19]也證實(shí)，在天然放牧條件下，隨著年齡的增長(zhǎng)，蘇尼特羊臂三頭肌、股二頭肌和臀肌粗脂肪含量均顯著提高，增加了新鮮肉的風(fēng)味。以上研究結(jié)論表明，年齡對(duì)肌肉粗脂肪以及粗蛋白含量具有明顯的影響。而本試驗(yàn)卻發(fā)現(xiàn)不同生長(zhǎng)時(shí)期黑藏羊肌肉中粗蛋白與粗脂肪含量差異不顯著，這與上述研究結(jié)論不一致，究其原因可能是品種、飼養(yǎng)環(huán)境、放牧?xí)r間以及屠宰年齡等不同造成的。

3.2 不同生長(zhǎng)期黑藏羊背最長(zhǎng)肌抗氧化能力的比較

一般而言，機(jī)體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡中。而當(dāng)自由基生成量增加或自由基清除能力下降時(shí)，則發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)[20]。自由基能夠使組織器官受到氧化損傷，降低機(jī)體免疫力，從而導(dǎo)致疾病發(fā)生[21]。因此，測(cè)定肌肉中抗氧化能力，能夠反映黑藏羊健康狀況，為其不同生長(zhǎng)發(fā)育階段提供理論參考。一般認(rèn)為總抗氧化能力、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶、過(guò)氧化氫酶以及丙二醛等是衡量機(jī)體抗氧化能力強(qiáng)弱的重要標(biāo)志[22]。其中總抗氧化能力是衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的綜合性指標(biāo)[23]，其含量可以直接衡量黑藏羊肌肉中抗氧化防衛(wèi)能力。谷胱甘肽過(guò)氧化物酶能夠清除活性氧自由基，作為體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)的主要組成部分[24]。超氧化物歧化酶作為保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整、功能完整一種重要的酶[25]。過(guò)氧化氫酶可以催化細(xì)胞內(nèi)過(guò)氧化氫分解，防止機(jī)體發(fā)生損傷[26]。而丙二醛能夠降低機(jī)體抗氧化酶的活性，反映機(jī)體脂質(zhì)氧化的程度[27]。丙二醛值越低說(shuō)明肌肉脂質(zhì)氧化程度越低，抗氧化能力就越強(qiáng)[28]。同時(shí)肌肉丙二醛含量也可評(píng)價(jià)生肉新鮮程度的重要指標(biāo)。從本試驗(yàn)來(lái)看，羔羊和成年羊背最長(zhǎng)肌抗氧化能力差異不顯著。由此可知，隨著黑藏羊年齡的增長(zhǎng)，其抗氧化效果并未發(fā)生明顯的改變，這種現(xiàn)象在韓國(guó)本地肉牛[29]也有類(lèi)似的報(bào)道。

3.3 不同生長(zhǎng)期黑藏羊背最長(zhǎng)肌組織形態(tài)學(xué)特性的比較

肌纖維作為骨骼肌組織的基本組成單位，其類(lèi)型組成的差異是影響肌肉品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一[30]。由此可見(jiàn)，骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育與動(dòng)物肌纖維有著密切的聯(lián)系。其生理生化特性的差異以及代謝的特征從而直接影響動(dòng)物屠宰后肌肉的質(zhì)量。當(dāng)酵解型肌纖維含量高時(shí)會(huì)使肉的保水性下降，不利于改善肉質(zhì)[31]。王莉[32]試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，牦牛肉Ⅰ型肌纖維比例與剪切力呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，即Ⅰ型肌纖維比例越高，剪切力越低，嫩度也就越好。在新疆褐牛與安格斯牛研究表明[33]，3、7、12、24月齡新疆褐牛Ⅰ型肌纖維密度隨著年齡的增大而減少，安格斯牛Ⅰ型肌纖維密度的變化趨勢(shì)與新疆褐牛相同，但ⅡB型肌纖維密度隨著年齡變化呈現(xiàn)無(wú)規(guī)律變化。此外發(fā)現(xiàn)，1～6歲伊犁馬隨著年齡的增大，三角肌及背闊肌部位肌纖維橫截面積、平均直徑增大，單位面積內(nèi)肌纖維的個(gè)數(shù)隨之減少，失水率變小，剪切力增加[34]。其他試驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)，犢牦牛背最長(zhǎng)?、裥秃廷駻型肌纖維直徑顯著低于成年牦牛，ⅡB型肌纖維也呈現(xiàn)低于成年牦牛趨勢(shì)，但差異不顯著，同時(shí)犢牦牛背最長(zhǎng)肌Ⅰ型、ⅡA型ⅡB型肌纖維橫切面積均顯著低于成年牦牛，但肌纖維密度則呈現(xiàn)相反趨勢(shì)[35]。以上研究均說(shuō)明酵解型肌纖維含量與肌肉品質(zhì)呈負(fù)相關(guān)，肌纖維類(lèi)型受年齡的影響較大。本試驗(yàn)得出黑藏羊在成年前可以降低酵解型纖維的比例，揭示年齡會(huì)影響黑藏羊肌纖維類(lèi)型的轉(zhuǎn)化，從而影響肌肉的生長(zhǎng)發(fā)育。另外本試驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)，粗脂肪和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶與MyHCⅠ基因表達(dá)豐度呈顯著正相關(guān)，而粗蛋白質(zhì)與MyHCⅡA基因表達(dá)豐度亦呈顯著正相關(guān)。由此可見(jiàn)，肌纖維組織形態(tài)學(xué)特性與其肉品質(zhì)具有緊密的的聯(lián)系。動(dòng)物出生后肌纖維數(shù)量不再發(fā)生改變，但在年齡影響下肌纖維類(lèi)型卻可發(fā)生明顯的轉(zhuǎn)化[36]。在蘇尼特羊上試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MyHCⅠ、MyHCⅡA基因表達(dá)量分別與其Ⅰ型和ⅡA型肌纖維的數(shù)量比例呈正相關(guān)關(guān)系，MyHCⅡB表達(dá)量與ⅡB型肌纖維的數(shù)量比例呈正相關(guān)關(guān)系[37]，本試驗(yàn)結(jié)果也驗(yàn)證了這一觀點(diǎn)。

4 結(jié) 論

綜上所述，在本試驗(yàn)條件下，隨著年齡的增長(zhǎng)，黑藏羊背最長(zhǎng)肌肌纖維類(lèi)型由氧化型纖維(MyHCⅠ和MyHCⅡA)向酵解型纖維(MyHCⅡB)轉(zhuǎn)化，在一定程度上影響了機(jī)體的生長(zhǎng)發(fā)育。