基于微滴式數(shù)字PCR技術(shù)對乙型肝炎低病毒血癥患者血漿HBV DNA精準(zhǔn)檢測*

范子豪，田原，徐玲，曹亞玲，陳思思，潘楨楨，張向穎，段鐘平，任鋒(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，北京肝病研究所，北京 100069)

低病毒血癥是指HBV DNA定量持續(xù)或間歇大于檢測下限但小于2 000 IU/mL的一類HBV持續(xù)感染[1-2]。美國肝病研究學(xué)會(American Association for the Study of Liver Diseases，AASLD)慢性乙型肝炎(Chronic hepatitis B, CHB)診療指南和我國CHB診療指南關(guān)于病毒學(xué)應(yīng)答制定的標(biāo)準(zhǔn)均指出，低病毒載量血漿HBV DNA的精準(zhǔn)檢測十分重要[3-4]。隨著抗病毒藥物的廣泛應(yīng)用，乙型肝炎低病毒血癥及隱匿性感染患者數(shù)量趨于增多，這對HBV DNA檢測的靈敏度也提出了更高的要求[5-7]。故探求一種有效檢測低病毒載量HBV DNA的方法，對臨床抗病毒治療效果的評價和治療策略的調(diào)整具有重要意義。微滴式數(shù)字PCR(droplet digital PCR，ddPCR)技術(shù)作為新一代的PCR技術(shù)，能夠?qū)δ繕?biāo)核酸進(jìn)行絕對定量分析從而實現(xiàn)精準(zhǔn)檢測的目的。因此，本研究建立了檢測HBV DNA的ddPCR方法并對乙型肝炎低病毒血癥患者HBV DNA進(jìn)行絕對定量分析。

1 材料和方法

1.1樣本 收集2021年首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院19例乙型肝炎低病毒血癥患者血漿樣本進(jìn)行臨床檢測分析，以及HBV、丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)、丁型肝炎病毒(hepatitis D virus, HDV)和HIV感染患者血漿樣本各5份進(jìn)行特異性分析。乙型肝炎低病毒血癥患者的納入標(biāo)準(zhǔn)為：雅培M2000實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)HBV DNA檢測結(jié)果<10 IU/mL(含HBsAg陰性的隱匿型感染者)。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)(文件批號: 京佑科倫意[2021]365號)且取得患者知情同意。

1.2主要試劑與儀器 病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒(北京天根公司)，ddPCR Super Mix、微液滴樣本制備通用試劑盒(含微流控生物芯片)、微液滴檢測通用試劑盒(北京新羿生物公司)；T100熱循環(huán)PCR儀(美國Bio-Rad公司)，D-1微滴式數(shù)字PCR平臺：Drop Maker樣本制備儀、Chip Reader生物芯片分析儀(北京新羿生物公司)。

1.3引物和探針的設(shè)計與合成 ddPCR引物和熒光探針均由上海生工生物公司合成。引物及探針序列為：上游引物：5′-CTCTCTTTACGCGGTCTC-3′，下游引物：5′-GTCGTTGACATTGCTGAG-3′，熒光探針：5′-FAM-CCGTCTGTGCCTTCTCATCTGC-TAMRA-3′。

1.4構(gòu)建HBV DNA陽性對照質(zhì)粒 陽性對照質(zhì)粒為構(gòu)建的pUC57-HBV質(zhì)粒。陽性對照質(zhì)粒的構(gòu)建、純化和鑒定由北京博邁德基因技術(shù)有限公司完成，且質(zhì)粒原液濃度為1 357 ng/μL(約為4.23×1011copies/μL),于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5ddPCR反應(yīng)體系和條件 在D-1微滴式數(shù)字PCR平臺完成ddPCR反應(yīng)。根據(jù)微液滴樣本制備通用試劑盒說明書配制反應(yīng)體系。ddPCR反應(yīng)體系共30 μL，包括2×SuperMix 15 μL，模板5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.5 μL，探針0.6 μL，無酶無菌水6.4 μL。將30 μL PCR混合物和180 μL微液滴生成油在Drop Maker樣本制備儀上反應(yīng)，生成“油包水液滴”，然后用T100熱循環(huán)PCR儀對微液滴樣品進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)；12 ℃ 5 min。利用Chip Reader生物芯片分析儀檢測FAM信號并分析結(jié)果。

1.6標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限分析 以梯度濃度稀釋的HBV陽性對照質(zhì)粒為模板，對該方法進(jìn)行準(zhǔn)確性和靈敏度的評價。構(gòu)建的陽性對照質(zhì)粒按1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100copies/μL的濃度進(jìn)行梯度稀釋和上機(jī)檢測。通過陽性對照質(zhì)粒的拷貝數(shù)和檢測結(jié)果的拷貝數(shù)計算線性方程。

1.7特異性試驗 對5例已知為HBV陽性臨床樣本按照病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行HBV DNA提取,濃度分別為1.8×103、2.3×103、1.7×103、1.1×102、3.5×102copies/μL。同時對已知為HCV、HDV、HIV陽性的臨床樣本(各5例)進(jìn)行核酸提取后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，均對其進(jìn)行ddPCR檢測。

1.8重復(fù)性試驗 選擇低拷貝數(shù)的HBV陽性對照質(zhì)粒(1×102、1×101、1×100copies/μL)進(jìn)行ddPCR重復(fù)性檢測。每一樣品均重復(fù)檢測3次，統(tǒng)計檢測結(jié)果并計算變異系數(shù)(coefficients of variation，CV)。

1.9臨床樣本的檢測 按照病毒基因組 DNA/RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行HBV DNA提取。采用ddPCR法對納入研究的19例乙型肝炎低病毒血癥患者的臨床樣本進(jìn)行檢測和結(jié)果分析。

2 結(jié)果

2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限分析 ddPCR檢測梯度稀釋陽性對照質(zhì)粒的結(jié)果見圖1，線性范圍在1×105～1×100copies/μL且檢出限低至1 copy/μL(陽性質(zhì)粒稀釋法)。陽性對照質(zhì)粒濃度與ddPCR檢測結(jié)果濃度取對數(shù)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示，線性方程為y=1.039 2x+0.099 5(y為質(zhì)粒濃度轉(zhuǎn)換為log10，x為檢測濃度轉(zhuǎn)換為log10)，R2值為0.999 5。

注：藍(lán)色點代表陽性信號；紅線代表陽性閾值判斷。

圖2 ddPCR檢測陽性對照質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2特異性分析 對已知為HBV陽性的臨床樣本進(jìn)行ddPCR檢測，結(jié)果均為陽性。同時對已知為HCV、HDV和HIV患者的臨床樣本進(jìn)行核酸提取逆轉(zhuǎn)錄后的ddPCR檢測，結(jié)果均為陰性，見圖3。

2.3重復(fù)性分析 對低拷貝數(shù)的HBV陽性對照質(zhì)粒1×102、1×101、1×100copies/μL進(jìn)行ddPCR重復(fù)性檢測，結(jié)果見表1，計算各自CV值分別為18.8%、9.9%、9.7%。

注：藍(lán)色點代表陽性信號；紅線代表陽性閾值判斷。

表1 低拷貝數(shù)HBV陽性對照質(zhì)粒重復(fù)性試驗結(jié)果

2.4乙型肝炎低病毒血癥患者HBV DNA臨床樣本的檢測 采用ddPCR法對納入研究的19例乙型肝炎低病毒血癥患者的臨床樣本進(jìn)行絕對定量檢測，結(jié)果見圖4。在低于qRT-PCR檢測下限乙型肝炎低病毒血癥患者血漿中均檢測出一定量的HBV DNA，若以上述檢出限結(jié)果1 copy/μL為臨界值，19例乙型肝炎低病毒血癥患者HBV DNA陽性13例，檢出率為68.42%。

圖4 乙型肝炎低病毒血癥患者臨床樣本ddPCR檢測結(jié)果

3 討論

HBV DNA的定量檢測在判斷HBV的復(fù)制水平、傳染性程度以及在評價抗病毒療效等方面均有重要意義。但隨著抗病毒藥物的普遍推廣和應(yīng)用，長期進(jìn)行抗病毒治療的患者中往往存在低濃度的HBV DNA，病毒載量甚至低于現(xiàn)有檢測方法的檢出限[8]。與此同時，隱匿性感染者以及乙型肝炎低病毒血癥患者數(shù)量不斷上升，越來越多HBV感染患者體內(nèi)存在不易檢出的低濃度HBV DNA，這對輸血、透析、移植等都造成嚴(yán)重的安全隱患[9-10]。近期有研究表明，低濃度的HBV DNA持續(xù)存在已經(jīng)成為晚期肝病的獨立危險因素[11]。

目前臨床上常用的HBV DNA檢測方法是qRT-PCR。而qRT-PCR定量是通過使用外標(biāo)法來定量目標(biāo)DNA的未知濃度，并獲得循環(huán)定量(CQ)值。CQ值根據(jù)閾值設(shè)置的不同而不同，有主觀或經(jīng)驗性，并且CQ值不能提供精確的臨界值[12]。此外，qRT-PCR在HBV DNA拷貝數(shù)差異不大的樣本中很難區(qū)分，特別是在拷貝數(shù)低的樣本中，缺乏一定精確性[13]。因此，急需探尋一種靈敏度更高的技術(shù)來滿足低病毒量的定量檢測。

ddPCR作為新一代的PCR技術(shù)，是一種以核酸擴(kuò)增為基礎(chǔ)對目標(biāo)核酸進(jìn)行不依賴標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線的絕對定量分析技術(shù)[14]。其與需要標(biāo)準(zhǔn)曲線的qRT-PCR不同，ddPCR提供了絕對結(jié)果。通過對樣品的微滴化處理將含有核酸分子的反應(yīng)體系分成成千上萬個納升級的微滴，其中每個微滴不含或者含有一個至數(shù)個靶分子。經(jīng)PCR擴(kuò)增后，對微滴逐個進(jìn)行檢測，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例即可得出靶分子的起始拷貝數(shù)或濃度。目前ddPCR已經(jīng)被用于多種臨床樣本及多種病原體的多樣化檢測[15-17]。在HBV檢測方面，也利用其高靈敏的特點應(yīng)用于長期抗病毒治療患者的HBV DNA分析[18]。盡管如此，ddPCR針對HBV DNA的檢測研究還是相對缺乏。

本研究首先評估了ddPCR對HBV DNA絕對定量的能力，對構(gòu)建的陽性對照質(zhì)粒的檢測在具有較高的擬合優(yōu)度(R2=0.999 5)的同時具有較高準(zhǔn)確度和特異性，證明其可以成為一般病毒學(xué)研究可靠、準(zhǔn)確和靈敏的工具。在方法的建立中，通過對HBV陽性質(zhì)粒梯度稀釋得到ddPCR檢測HBV DNA的檢出限低至1 copy/μL，但該檢出限有待進(jìn)一步的研究和驗證。在ddPCR檢測梯度稀釋的HBV陽性質(zhì)粒過程中，當(dāng)模板量大于105copies/μL時檢測結(jié)果的實際值偏離理論值(該部分結(jié)果未展示)，這可能是由于高目標(biāo)濃度下的液滴飽和度使泊松統(tǒng)計量失效所造成[19]，進(jìn)一步說明ddPCR更適用于低病毒載量的檢測。對低于臨床檢出限的乙型肝炎低病毒血癥患者HBV DNA絕對定量后發(fā)現(xiàn)，均檢測出一定量的HBV DNA。當(dāng)以1 copy/μL為臨界值，患者HBV DNA的檢出率為68.42%，且這一數(shù)值極有可能隨著標(biāo)本基數(shù)的增加而增加。由此可見，在隱匿性感染或HBsAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換這類乙型肝炎低病毒血癥患者中，仍存在一定量的HBV DNA，這為部分患者發(fā)生病毒學(xué)突破提供了有力的理論支撐。

總之，本研究建立并評估了ddPCR檢測低病毒載量HBV DNA的方法，其能夠高準(zhǔn)確、高靈敏和高特異地對乙型肝炎低病毒血癥患者HBV DNA實現(xiàn)絕對定量。這將有助于開展乙肝精準(zhǔn)抗病毒治療，保證乙肝低病毒血癥治療的安全有效。