甘草附子湯治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析＊

張冬雪，曲 帥，董 凱，徐 晨，闞 鴻＊＊

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院 長(zhǎng)春 130118；2.吉林省生物研究所藥用真菌研究室 長(zhǎng)春 130012）

類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種受多種內(nèi)源性和外源性因素影響的自身免疫性疾病，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)發(fā)炎、劇痛、僵硬、疲勞、畸形和身體損傷[1]，常引起免疫功能紊亂或低下[2]，其特點(diǎn)是軟骨和骨質(zhì)的破壞[3]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織數(shù)據(jù)，我國(guó)RA發(fā)病率約為0.4%，患者數(shù)量隨年齡增長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)[4]。當(dāng)合并其他疾病時(shí)，患者的死亡率較高[5]。目前RA治療主要通過(guò)控制炎癥反應(yīng)和減輕關(guān)節(jié)疼痛，西醫(yī)治療通常選取甾體抗炎藥、非甾體抗炎藥、免疫抑制藥等。然而，化學(xué)藥物易引發(fā)不良反應(yīng)，特別是嚴(yán)重毒性，如肝、腎、胃腸道和惡性感染等[6]。因此中藥復(fù)方在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎治療中的應(yīng)用呈上升趨勢(shì)，RA患者更傾向于選擇其作為補(bǔ)充藥物進(jìn)行治療[7]。

中醫(yī)認(rèn)為寒冷、潮濕、勞累等為RA的相關(guān)致病因素，將RA歸屬于“歷節(jié)病”的范疇，屬痹癥。甘草附子湯出自《傷寒論》，由甘草、附子、白術(shù)、桂枝四味藥材組成，為表里陽(yáng)虛、風(fēng)濕在表的配方。方中君藥附子溫經(jīng)散寒、祛除筋骨之風(fēng)濕；佐藥桂枝散寒解表祛濕、發(fā)汗消腫，強(qiáng)化附子的解濕邪作用；白術(shù)健脾去濕，兼走表里，增強(qiáng)附子和桂枝的功效。使藥炙甘草溫和、補(bǔ)中緩急，配以祛風(fēng)除濕、強(qiáng)筋健骨之藥，使藥力更佳。臨床使用歷史悠久。曹江山[8]在研究關(guān)節(jié)炎中發(fā)現(xiàn)，運(yùn)用甘草附子湯治療RA效果良好，尤其是對(duì)風(fēng)寒痹阻型RA患者，可提高患者關(guān)節(jié)活動(dòng)能力，降低實(shí)驗(yàn)室炎癥指標(biāo)。任慧[9]通過(guò)選用加味甘草附子湯對(duì)57例類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎寒濕痹阻證的患者進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)加味甘草附子湯可有效緩解RA患者的癥狀體征，減少關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)壓痛、關(guān)節(jié)腫脹個(gè)數(shù)，從而減輕患者痛苦，且臨床安全性良好。馮亞兵[10]應(yīng)用甘草附子湯治療RA，結(jié)果顯示總有效率達(dá)76.2%，明顯高于西藥對(duì)照組，且能夠顯著降低類(lèi)風(fēng)濕因子水平。而辨證論治的加減藥味變化導(dǎo)致中藥復(fù)方組合方式多樣，藥味含有大量復(fù)合化合物過(guò)于繁雜，無(wú)法僅通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)，整體物質(zhì)基礎(chǔ)及多重作用機(jī)制難以闡明[11-12]。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)利用網(wǎng)絡(luò)大數(shù)據(jù)的分析可以廣泛應(yīng)用于探索藥物和中藥的活性成分，解釋整體作用機(jī)制，分析藥對(duì)和組方的配伍規(guī)律[13-14]，為中醫(yī)藥從經(jīng)驗(yàn)醫(yī)學(xué)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化為循證醫(yī)學(xué)系統(tǒng)提供了一種新的研究范式[15]。因此本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法首先采用TCMSP、BATMAN-TCM和ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)篩選了甘草附子湯的有效成分；隨后分析總結(jié)了活性成分的靶點(diǎn)；再利用藥物-疾病靶點(diǎn)、基因本體（GO）和生物途徑（KEGG）功能富集；最后，通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)加以驗(yàn)證。為探討甘草附子湯治療RA的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1.1 甘草附子湯中化學(xué)成分檢索

借助TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcmspw.com/tcmsp.php）以“甘草”、“附子”、“白術(shù)”、“桂枝”為關(guān)鍵詞檢索甘草附子湯的化學(xué)成分。在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中依據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)ADME原則，以口服生物利用度（OB ≥3 0%），類(lèi)藥性指數(shù)（DL ≥ 0.18）為條件對(duì)其活性成分進(jìn)行篩選。BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bionet.ncpsb.org/batmantcm/）按照Score cutoff ≥ 20檢索四味藥成分及相關(guān)靶點(diǎn)，ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）中截取QED得分＞0.67，對(duì)活性成分及其靶點(diǎn)進(jìn)行補(bǔ)充，保證預(yù)測(cè)全面性，并通過(guò)文獻(xiàn)驗(yàn)證數(shù)據(jù)庫(kù)檢索化學(xué)成分的準(zhǔn)確性。

1.1.2 活性成分靶點(diǎn)篩選和“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

基于Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org/），查找1.1.1中篩選出活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)及其相應(yīng)的基因名，刪除重復(fù)靶點(diǎn)、無(wú)對(duì)應(yīng)基因名的蛋白。用Cytoscape3.7.2軟件可視化分析藥物、成分、靶點(diǎn)之間的交互作用。

1.1.3 RA治療靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

以“Rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞搜索人類(lèi)基因注釋的一站式搜索平臺(tái)Gene cards 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/)、OMIM 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/）、Drugbank數(shù)據(jù)庫(kù)（https://go.drugbank.com/），查找疾病相關(guān)基因，利用多個(gè)公認(rèn)疾病數(shù)據(jù)庫(kù)保證收集靶點(diǎn)的全面和準(zhǔn)確。將甘草附子湯活性成分的靶點(diǎn)與RA的靶點(diǎn)進(jìn)行映射分析，得到潛在作用靶點(diǎn)。

1.1.4 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（Protein-protein interaction，PPI）

將1.1.3中得到的甘草附子湯治療RA的靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.string-db.org/），選擇研究物種為人類(lèi)，將獲取蛋白互作關(guān)系的結(jié)果以TSV格式導(dǎo)出，再導(dǎo)入Cytoscape3.7.2中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩苑治?，篩選核心靶點(diǎn)。

1.1.5 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO和KEGG分析

本研究通過(guò)Meta scape數(shù)據(jù)庫(kù)（https://metascape.org/），利用注釋基因和分析基因生物學(xué)過(guò)程的主要生物信息學(xué)工具GO，以及從高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)產(chǎn)生的大規(guī)模分子數(shù)據(jù)集KEGG進(jìn)行富集分析。運(yùn)用微生信等平臺(tái)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行氣泡圖可視化處理。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

1.2.1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

炙甘草、桂枝、白術(shù)、附子購(gòu)于藥店；大鼠腫瘤壞死因子-α酶聯(lián)免疫試劑盒（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6酶聯(lián)免疫試劑盒（IL-6）購(gòu)于南京建成生物工程研究所；大鼠AKT-1蛋白酶聯(lián)免疫試劑盒（Akt-1）購(gòu)于上海江萊生物科技有限公司。

Wistar大鼠，雄性30只，體質(zhì)量（180±20）g，購(gòu)于長(zhǎng)春生物制品研究所有限責(zé)任公司（SCXK（吉）-2017-0005），實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)7天。

冷凍離心機(jī)（Eppendorf，美國(guó)）；酶標(biāo)儀（Tecan，澳大利亞）；足趾容積測(cè)量?jī)x（PV-200，成都泰盟軟件有限公司）。

1.2.2 甘草附子湯供試品的制備

以處方比例稱(chēng)取炙甘草、附子、白術(shù)、桂枝四種藥材，參照文獻(xiàn)方法[16]制備甘草附子湯供試品溶液，冷凍干燥后低溫儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 甘草附子湯對(duì)大鼠佐劑型關(guān)節(jié)炎的影響

（1）踝關(guān)節(jié)組織學(xué)檢查

取大鼠的右后足踝關(guān)節(jié)，固定于福爾馬林溶液中，脫鈣處理后，按照文獻(xiàn)方法[17]進(jìn)行HE染色，分別從炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生、軟骨破壞和骨侵蝕程度對(duì)各組佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的關(guān)節(jié)切片進(jìn)行評(píng)分，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)癥狀得0分，輕度癥狀得1分，中度癥狀得2分，重度癥狀得3分，總得分為12分[18]。

（2）甘草附子湯對(duì)AIA大鼠作用靶點(diǎn)的驗(yàn)證

將30只大鼠隨機(jī)分為空白組（HG）、模型組（AIAG）、給藥組（GFDG），模型組和給藥組在大鼠左后足足趾處皮內(nèi)注射0.1 mL含10 mg·mL-1滅活的結(jié)合分枝桿菌的完全弗氏佐劑，空白組在相同部位注射等量的生理鹽水，共注射2周，建立佐劑型關(guān)節(jié)炎模型。模型建立后，給藥組連續(xù)灌胃給藥甘草附子湯（給藥劑量按照臨床計(jì)量折算，6.5 g生藥·kg體質(zhì)量-1），空白組和模型組給予等量的生理鹽水。連續(xù)給藥3周后，處死取血，4℃下離心3000 r·min-110 min獲得血清，保存于-80℃待用。將大鼠的踝關(guān)節(jié)組織去掉皮肉，用勻漿器與生理鹽水以1∶10的比例在冰浴中研磨，再將組織研磨液以3000 r·min-1低溫離心，得到上清液作為關(guān)節(jié)組織勻漿液，保存于-80℃待用。

分別按照試劑盒的方法檢測(cè)大鼠血清中的TNF-α、IL-6及踝關(guān)節(jié)組織中的 TNF-α、IL-6、Akt-1的表達(dá)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 23軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差（），組間比較用單因素方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甘草附子湯中活性化合物的篩選

從TCMSP、BATMAN-TCM、ETCM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索可得到甘草附子湯中活性物質(zhì)共623種?；钚猿煞趾Y選以O(shè)B＞30%，DL＞0.18或Score cutoff ≥20或QED得分＞0.67為標(biāo)準(zhǔn)，共篩選出136種，其中甘草101種，白術(shù)7種，附子21種，桂枝7種。甘草附子湯中部分有效成分的相關(guān)信息如表1所示。

2.2 “藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

采用Cytoscape3.7.2軟件對(duì)甘草附子湯中各藥味的成分、靶點(diǎn)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析，得到的“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示。

2.3 甘草附子湯-RA交集靶點(diǎn)

將篩選后的甘草附子湯有效活性成分靶點(diǎn)與RA的潛在靶點(diǎn)取交集，運(yùn)用Venny繪圖，得到交集靶點(diǎn)127個(gè)，見(jiàn)圖2。

表1 甘草附子湯中部分有效成分的基本信息

圖1 草附子湯治療RA“藥物-化合物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖

圖2 甘草附子湯成分靶點(diǎn)與RA相關(guān)靶點(diǎn)關(guān)系的Venn圖

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

將甘草附子湯治療RA的127個(gè)潛在靶點(diǎn)基因輸入到STRING平臺(tái)中，進(jìn)行PPI分析，通過(guò)Cytoscape對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治觯W(wǎng)絡(luò)中共包含127個(gè)節(jié)點(diǎn)，2607條邊，平均度值44.1。顏色的深淺隨度值增加而增加，度值越大與其他蛋白聯(lián)系越密切，作為潛在治療靶標(biāo)的可能性越大（見(jiàn)圖3），主要蛋白資料見(jiàn)表2。

2.5 GO富集分析及KEGG通路分析

通過(guò)Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)甘草附子湯治療RA的作用靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，以P＜0.01為條件。GO分析結(jié)果顯示：檢索出748項(xiàng)與分子功能（Molecular，MF）相關(guān)，可體現(xiàn)在熱休克蛋白結(jié)合、抗氧化活性等功能上；參與生物過(guò)程（Biological process，BP）的4849項(xiàng)，包括對(duì)生長(zhǎng)因子、創(chuàng)傷的反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱpri-miRNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控等主要過(guò)程；得到440個(gè)細(xì)胞組分（Cellular components，CC）條目，主要以神經(jīng)元、髓鞘、滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為主。對(duì)MF、BP、CC中P值排名前5的條目進(jìn)行可視化分析（圖4）。KEGG分析得到247項(xiàng)，涉及癌癥的途徑、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、NF-κB信號(hào)通路等。將KEGG分析得到的前20條通路進(jìn)行可視化處理，結(jié)果如圖5所示。部分蛋白靶點(diǎn)與信號(hào)通路之間的聯(lián)系如表3所示，進(jìn)一步建立“靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)（圖6）。

圖3 甘草附子湯治療RA的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)篩選圖

表2 甘草附子湯治療RA中的重要靶點(diǎn)

2.6 甘草附子湯對(duì)RA損傷模型的保護(hù)作用

2.6.1 各組大鼠右后足關(guān)節(jié)的組織病理學(xué)分析

如圖7所示，HG大鼠右后關(guān)節(jié)切片無(wú)炎癥特征（圖7A），而AIA模型組大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的骨破壞、軟骨侵蝕、滑膜增生和炎癥浸潤(rùn)（圖7B）。與AIA模型組相比，甘草附子湯組切片中組織水腫或滑膜肥大得到明顯緩解，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況也有所減輕（圖7C）。AIA模型組和甘草附子湯組的病理學(xué)得分圖如圖7D所示，甘草附子湯組對(duì)AIA大鼠表現(xiàn)出明顯的治療作用。

2.6.2 甘草附子湯對(duì)AIA大鼠的影響

圖8顯示了各組大鼠足腫脹率，空白組大鼠的足腫脹率由于大鼠飼養(yǎng)5周體質(zhì)量增加而略有增加，模型組的足腫脹率較高，達(dá)到了44.93±2.09%，給藥組在甘草附子湯治療3周后，與AIA模型組大鼠相比，大鼠足腫脹率顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，甘草附子湯可使大鼠足腫脹得到緩解。模型組大鼠的血清中TNF-α和IL-6水平顯著升高，表明了炎癥的發(fā)生。經(jīng)甘草附子湯治療3周后，給藥組血清中TNF-α和IL-6的濃度較炎癥組明顯降低（圖9）。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測(cè)可知，Akt-1、TNF-α和IL-6在甘草附子湯治療RA中起到了重要的作用，因此，對(duì)大鼠關(guān)節(jié)組織中選取Akt-1、TNFα和IL-6進(jìn)行分析驗(yàn)證。如圖10所示，經(jīng)甘草附子湯治療后，AIA大鼠關(guān)節(jié)中的Akt-1、TNF-α和IL-6表達(dá)均有所降低，表明甘草附子湯可通過(guò)以上3個(gè)靶點(diǎn)，在TNF信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、HIF-1等信號(hào)通路中起到治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的作用[6,19]。

圖4 甘草附子湯治療RA的GO富集條目氣泡圖

圖5 甘草附子湯治療RA的KEGG通路富集氣泡圖

表3 甘草附子湯治療RA部分蛋白靶點(diǎn)與信號(hào)通路信息

圖6 甘草附子湯治療RA靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖

圖7 各組大鼠關(guān)節(jié)組織學(xué)檢查（放大100倍）（）

圖8 給藥3周后大鼠足腫脹率（）

3 討論

RA是一種慢性疾病，早期常見(jiàn)癥狀是晨起之后關(guān)節(jié)僵硬，足關(guān)節(jié)等四肢小關(guān)節(jié)的對(duì)稱(chēng)性疼痛、紅腫熱痛，并伴隨有低熱、免疫功能下降等，嚴(yán)重可致關(guān)節(jié)畸形[20]。該疾病因其高致殘率嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。中藥復(fù)方具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，構(gòu)成了一個(gè)可以協(xié)同發(fā)揮作用的整體，具有療效明確、安全性高、副作用少的優(yōu)點(diǎn)，對(duì)于這種需長(zhǎng)期服藥的疾病治療效果較好[21-22]。甘草附子湯是其中最有效的方劑之一[23]，在RA的防治中引起了越來(lái)越多的關(guān)注。

本研究運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法共檢索出甘草附子湯中623個(gè)化合物，結(jié)合當(dāng)前對(duì)甘草附子湯化學(xué)成分進(jìn)行探索的文章[24]，采用TCMSP、BATMAN-TCM和ETCM等數(shù)據(jù)庫(kù)盡可能全面的囊括甘草附子湯中的化學(xué)成分，彌補(bǔ)目前檢測(cè)方法對(duì)中藥復(fù)方復(fù)雜體系分析的局限性。根據(jù)目前實(shí)驗(yàn)報(bào)道[16]，甘草附子湯在合煎與分煎過(guò)程中，并未產(chǎn)生化學(xué)成分種類(lèi)的變化，數(shù)據(jù)庫(kù)信息具有代表性，本論文采用ADME原則作為篩選條件，對(duì)“甘草附子湯”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析。通過(guò)篩選可得甘草附子湯有效成分共136個(gè)，其中以甘草和附子成分為主，白術(shù)和桂枝較少，與文獻(xiàn)中報(bào)道成分分布一致[25-26]，將136個(gè)有效成分的靶點(diǎn)進(jìn)一步通過(guò)與RA疾病的221個(gè)作用靶點(diǎn)進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步得到甘草附子湯治療RA的潛在作用靶點(diǎn)127個(gè)?；钚猿煞?靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析預(yù)測(cè)顯示，甘草附子湯可通過(guò)槲皮素（Quercetin）、β 谷 甾 醇（Beta-sitosterol）、紫 杉 醇（Taxifolin）、甘草素（Glycyrrhizin）和烏頭堿（Aconitine）等活性成分發(fā)揮作用。黃酮類(lèi)化合物槲皮素可通過(guò)兩種途徑減輕炎癥：①可使IL-6、IL-1β、IL-10等炎癥因子的表達(dá)水平降低；②通過(guò)減少炎癥細(xì)胞向關(guān)節(jié)部位的募集來(lái)緩解局部的炎癥[27]。β-谷甾醇可通過(guò)抑制表皮細(xì)胞中炎癥小體的激活，減少細(xì)胞中TNF-α、IL-8的生成發(fā)揮抗炎作用；還可以調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的功能，減輕小鼠的類(lèi)風(fēng)濕炎癥[28-29]。紫杉醇通過(guò)靶向MAPK和AKT/mTOR信號(hào)通路抑制RA的滑膜細(xì)胞的遷移和炎癥介質(zhì)（TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8）的產(chǎn)生[30]。甘草素能降低促炎細(xì)胞因子TNF-α表達(dá)水平，抑制小鼠骨關(guān)節(jié)炎軟骨破壞[31-32]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，制附子主要活性成分烏頭堿可能通過(guò)降低血清NO、IL-1β水平、從而調(diào)控相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)從而起到抗炎和消除關(guān)節(jié)腫脹的作用[33]。

圖9 給藥35天后大鼠血清中TNF-α（A）和IL-6（B）的水平（）

圖10 給藥35天后大鼠關(guān)節(jié)組織中TNF-α（A）、IL-6（B）和Akt-1（C）的表達(dá)水平（）

經(jīng)網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治霭l(fā)現(xiàn)甘草附子湯治療RA發(fā)揮作用的主要靶點(diǎn)集中在炎癥和腫瘤相關(guān)的基因，由于炎癥與腫瘤存在錯(cuò)綜復(fù)雜的關(guān)系[34]，因此交叉的通路中可能存在假陽(yáng)性的可能。根據(jù)目前文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)一步篩選，認(rèn)為甘草附子湯治療RA的關(guān)鍵靶點(diǎn)為Akt1、TNF-α、IL-6、VEGFA、JUN、IL-1β、PTGS2、STAT3。Akt1是PI3K/AKT信號(hào)通路中重要的下游靶激酶，可通過(guò)多種途徑控制凋亡[35-36]。Akt1表達(dá)水平下調(diào)，造成促炎因子IL-1β、TNF-α的表達(dá)減少，抗炎因子IL-10表達(dá)增加，從而減少炎癥反應(yīng)[37]。TNF-α在誘導(dǎo)類(lèi)風(fēng)濕性滑膜細(xì)胞中起主導(dǎo)作用，在RA患者的關(guān)節(jié)液和滑膜中表達(dá)，一方面可以介導(dǎo)白細(xì)胞在關(guān)節(jié)處聚集，刺激破骨細(xì)胞的形成和軟骨的降解，有效地誘導(dǎo)其他促炎介質(zhì)的釋放[38]，另一方面直接通過(guò)刺激關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中膠原酶的合成，促進(jìn)滑膜炎癥[39]。目前抗風(fēng)濕類(lèi)藥物中，單克隆抗體英夫利昔單抗和阿達(dá)木單抗為阻斷TNF-α的免疫藥物，但此類(lèi)藥物存在免疫抑制副作用，同時(shí)易于使患者出現(xiàn)針對(duì)藥物的抗體而影響藥物的活性[40]。在先天免疫方面，多效促炎細(xì)胞因子IL-6促進(jìn)中性粒細(xì)胞遷移和單核細(xì)胞浸潤(rùn)是RA發(fā)病的重要機(jī)制[41]。在RA患者受累關(guān)節(jié)的血清和滑液中，發(fā)現(xiàn)IL-6和TNF-α的水平升高[42]。研究發(fā)現(xiàn)IL-6、TNF-α、Akt的主要功能是刺激B細(xì)胞增殖以產(chǎn)生免疫球蛋白，并刺激滑膜以產(chǎn)生類(lèi)風(fēng)濕因子。因此，降低其表達(dá)水平可有效治療RA[43]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGFA）可促進(jìn)血管生成，在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)的缺氧狀態(tài)和抗炎細(xì)胞因子中表達(dá)水平上調(diào)[44]。JUN是JAKSTAT信號(hào)通路上的快速反應(yīng)基因，可促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化和骨細(xì)胞特異基因的表達(dá)[45]。關(guān)節(jié)中IL-1β的增加會(huì)加劇滑膜炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，促進(jìn)血管痙攣的形成，最終導(dǎo)致軟骨和骨骼的破壞[19,46]。前列腺素內(nèi)環(huán)氧化合物合成酶2（PTGS2）是前列腺素合成的限速酶，可通過(guò)NF-κB通路激活并誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞產(chǎn)生IL-6，造成軟骨損傷，抑制PTGS2的表達(dá)可減輕炎癥[47]。STATs是一類(lèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子，STAT家族中STAT3活性最強(qiáng)，可調(diào)節(jié)炎癥因子表達(dá)，對(duì)RA發(fā)揮正反饋促進(jìn)作用[48]。Oike等[49]通過(guò)構(gòu)建可行的STAT3條件性敲除成年小鼠（Stat3 cKO），解決了Stat3 global KO小鼠顯示的早期胚胎致死性，并發(fā)現(xiàn)這種敲除小鼠能夠顯著抵抗膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎，與降低血清中IL-6和IL-17水平在體內(nèi)拮抗關(guān)節(jié)炎癥有關(guān)。在KEGG通路富集分析中治療靶標(biāo)主要富集在HIF-1、NF-κB、JAK-STAT等多條信號(hào)通路中。PI3K/Akt磷酸化[50]、NF-κB通路活化[51]可激活I(lǐng)L-1β誘導(dǎo)促炎因子TNF-α、IL-6的表達(dá)，介導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎癥的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)JAK1/STAT3信號(hào)可使促炎細(xì)胞因子減少、MMPs抑制、炎性標(biāo)記物減弱和炎性細(xì)胞凋亡，從而減輕RA臨床癥狀[52]。HIF-1在炎癥/先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用[53]，HIF-1通路激活引起NF-κB、促炎性細(xì)胞因子表達(dá)下調(diào)，起到炎癥保護(hù)作用[54]。因此甘草附子湯治療RA的機(jī)制與上述炎癥相關(guān)通路相關(guān)，與臨床或?qū)嶒?yàn)研究相吻合[55]。本實(shí)驗(yàn)根據(jù)以上分析結(jié)果，將度值＞90的關(guān)鍵靶點(diǎn)以佐劑型關(guān)節(jié)炎大鼠為模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明甘草附子湯通過(guò)下調(diào)大鼠體內(nèi)各通路中的Akt-1、TNF-α、IL-6表達(dá)發(fā)揮對(duì)RA的治療作用。

綜上所述，本文參考《網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)評(píng)價(jià)方法指南》，運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究藥物與靶蛋白或基因與疾病之間的代謝途徑，從信息學(xué)的角度描述生物系統(tǒng)、藥物和疾病之間的復(fù)雜性[56]，適用于類(lèi)風(fēng)濕性疾病等發(fā)病機(jī)制尚不清晰的疾病，與多成分多靶點(diǎn)交互作用的中藥復(fù)方。通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)甘草附子湯治療RA的作用效果和潛在的信號(hào)通路進(jìn)行驗(yàn)證，為甘草附子湯的廣泛應(yīng)用提供了理論支撐。但一方面由于有效成分為預(yù)測(cè)值，缺乏藥代動(dòng)力學(xué)的相關(guān)體內(nèi)參數(shù)，另一方面，中藥復(fù)方存在多組分、多途徑、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，預(yù)測(cè)的關(guān)鍵靶點(diǎn)并不能完全代表中藥的整體觀，需要進(jìn)一步完善甘草附子湯在體內(nèi)藥效成分的探究，運(yùn)用強(qiáng)大的信息化技術(shù)科學(xué)、系統(tǒng)地闡釋傳統(tǒng)中醫(yī)藥。