基于炎癥、細(xì)胞凋亡、血小板聚集、蛋白質(zhì)合成過程的追風(fēng)傘抑制骨關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜損傷的研究＊

李煦照，李紅美，張帥男

（貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 貴陽(yáng) 550025）

骨關(guān)節(jié)炎是一種慢性退行性關(guān)節(jié)疾病。其全球發(fā)病率為2%-6%，70歲以上的人群發(fā)病率超過40%[1]。關(guān)節(jié)滑膜損傷是骨關(guān)節(jié)炎的重要病理特征之一，涉及了多種病理機(jī)制，如炎癥、血小板的聚集、細(xì)胞凋亡、生長(zhǎng)因子失調(diào)，蛋白質(zhì)合成功能障礙等[1-3]?；ぱ装Y影響了骨關(guān)節(jié)炎的癥狀和發(fā)病進(jìn)程[4]。此外，血小板聚集是該疾病滑膜中的重要炎癥標(biāo)志物[5]。多種生長(zhǎng)因子從血小板中釋放出來，并參與了病變組織的修復(fù)和再生[3]。在骨關(guān)節(jié)炎中，細(xì)胞凋亡和蛋白質(zhì)的合成過程也參與了滑膜組織的修復(fù)和再生[3,6]。

追風(fēng)傘是報(bào)春花科植物狹葉落地梅Lysimachia paridiformisFranch. var.stenophyllaFranch 的干燥全草，具有祛風(fēng)通絡(luò)、活血止痛的功效，可以用于風(fēng)濕痹痛、四肢拘攣、半身不遂等[7]。前期生物標(biāo)簽研究表明[2-3]，追風(fēng)傘影響了關(guān)節(jié)滑膜中一些與炎癥、細(xì)胞凋亡、血小板聚集和蛋白質(zhì)合成過程相關(guān)的內(nèi)源性靶點(diǎn)的表達(dá)。這些靶點(diǎn)參與了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制[2-3]。因此，我們推測(cè)，追風(fēng)傘可以通過調(diào)節(jié)這些病理過程來減輕骨關(guān)節(jié)炎的滑膜損傷。

1 材料和方法

1.1 追風(fēng)傘提取物的制備

追風(fēng)傘提取物的制備方法已在本課題組的前期研究中進(jìn)行描述[3]。追風(fēng)傘飲片粉碎后使用10倍量的蒸餾水進(jìn)行回流提取，總共提取3次，每次2 h，合并提取液，進(jìn)行凍干，得到凍干粉，得率為12.65%。

1.2 試劑

碘乙酸鈉（I2512，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；雙氯芬酸鈉（D6899，美國(guó)Sigma-Aldrich公司）；前列腺素E1（PGE1）酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒（E-EL-0052c，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；花生四烯酸（AA）酶聯(lián)免疫吸附分析試劑盒（E-EL-0051c，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司）；整合素α2b抗體（Itga2b，PB9647，武漢博士德生物工程有限公司）；整合素β抗體（Itgb3，BM4120，武漢博士德生物工程有限公司）；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A抗體（VEGFA，BA0407，武漢博士德生物工程有限公司）；胰島素樣生長(zhǎng)因子1抗體（IGF 1，BA0939，武漢博士德生物工程有限公司）；成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2抗體（FGF-2，PB0619，武漢博士德生物工程有限公司）；肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子抗體（HGF，BA0911，武漢博士德生物工程有限公司）；腫瘤壞死因子α抗體（TNF-α，PB0082，武漢博士德生物工程有限公司）；血小板衍生生長(zhǎng)因子A抗體（PDGF-A，bs-0196R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1抗體（TGFβ1，bs-0086R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；延伸因子1-α2抗體（eEF1A2，bs-13054R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；翻譯起始因子2B亞基β抗體（EIF2B2，bs-14536R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；真核翻譯起始因子4B抗體（EIF4B，bs-4103R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶2A 56 kDa調(diào)節(jié)亞基抗體（PPP2R5C，bs-11991R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）；脆性X智力低下綜合征相關(guān)蛋白1抗體（FXR1，bs-5528R，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.3 儀器

數(shù)字游標(biāo)卡尺（德國(guó)Preisser公司）；RM2235石蠟切片機(jī)（德國(guó)LEICA公司）；DM3000顯微鏡（德國(guó)LEICA公司）。

1.4 動(dòng)物與分組

60只雄性Sprague-Dawley大鼠，清潔級(jí)，體質(zhì)量250 ± 20 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，許可證號(hào)：SCXK（津）2014-0002。大鼠飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，12 h光照、12 h避光循環(huán)飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度為（22 ± 1）℃，相對(duì)濕度40%-50%，飼喂標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水。

將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽(yáng)性藥治療組、追風(fēng)傘低劑量組、追風(fēng)傘中劑量組、追風(fēng)傘高劑量組，每組10只。模型組、陽(yáng)性藥治療組和追風(fēng)傘治療組麻醉后，使用26G針頭將50 μL的碘乙酸鈉（3 mg）生理鹽水溶液通過髕韌帶注入膝關(guān)節(jié)中[3]?？瞻捉M注射0.9%無菌生理鹽水。造模24 h后，追風(fēng)傘低劑量組、追風(fēng)傘中劑量組、追風(fēng)傘高劑量組分別灌胃給予相當(dāng)于人生藥量0.143、0.288、0.428 g·kg-1的追風(fēng)傘提物，每天1次，連續(xù)30天。陽(yáng)性藥治療組給予10 mg·kg-1的雙氯芬酸鈉，每天1次，連續(xù)30天。空白組和模型組給予等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)30天。

1.5 關(guān)節(jié)腫脹度分析和樣本收集

最后一次給藥24 h后，用數(shù)字游標(biāo)卡尺測(cè)量大鼠關(guān)節(jié)的直徑。隨后，收集各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織樣本，用于組織病理學(xué)、免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附分析和Western blot分析。

1.6 組織病理學(xué)和免疫組學(xué)分析

將關(guān)節(jié)滑膜組織樣本置于4%的多聚甲醛中固定過夜，隨后包埋在石蠟中，用石蠟切片機(jī)切成5 mm的石蠟切片。一部分組織切片使用蘇木精和伊紅染色進(jìn)行組織病理學(xué)分析；另一部分組織切片根據(jù)Elivsion二步法進(jìn)行免疫組化染色，用于分析Itga2b（抗體稀釋比例1∶100）、Itgb3（抗體稀釋比例1∶100）、eEF1A2（抗體稀釋比例1∶400）、EIF2B2（抗體稀釋比例1∶400）和EIF4B（抗體稀釋比例1∶400）的表達(dá)。在200倍顯微鏡視野下進(jìn)行圖像采集，隨后運(yùn)用Image Pro Plus軟件（6.0版本，美國(guó)Media Control Netics公司）來計(jì)算靶蛋白的積分光密度（IOD）。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附分析

將關(guān)節(jié)滑膜組織樣本置于冰冷的PBS中進(jìn)行勻漿，將勻漿液在4℃下，2500 r·min-1離心10 min，取出上清液置于離心管中。隨后根據(jù)說明書操作，使用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒分析組織勻漿中的AA和PGE1的水平。

1.8 Western blot分析

運(yùn)用Western blot分析關(guān)節(jié)滑膜組織中的PDGFA（抗體稀釋比例1∶500）、VEGFA（抗體稀釋比例1∶500）、IGF 1（抗體稀釋比例1∶200）、FGF-2（抗體稀釋比例 1∶100）、HGF（抗體稀釋比例1∶300）、TGFβ1（抗體稀釋比例1∶500）、PPP2R5C（抗體稀釋比例1∶600）、FXR1（抗體稀釋比例1∶500）和TNF-α（抗體稀釋比例1∶500）的表達(dá)量，步驟已在本課題組的前期研究中進(jìn)行描述[3]。

圖1 關(guān)節(jié)腫脹度分析（A）及AA（B）和PGE1（C）的酶聯(lián)免疫吸附分析（n=10）

圖2 大鼠關(guān)節(jié)滑膜的組織病理學(xué)分析（n=10，200×）。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 關(guān)節(jié)腫脹度分析

與空白組相比（如圖1A），模型組大鼠關(guān)節(jié)直徑顯著增加（P＜0.05）。與模型組相比，陽(yáng)性藥治療組和追風(fēng)傘治療組的大鼠關(guān)節(jié)直徑顯著減?。≒＜0.05）。中、高劑量組之間存在顯著性差異。

圖3 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表達(dá)水平（n=10，200×）

2.2 關(guān)節(jié)滑膜組織中的AA和PGE1的水平

與空白組相比（如圖1B和C），模型組關(guān)節(jié)滑膜組織中的AA和PGE1的水平分別增加了55%和減少了41.7%。與模型組相比，陽(yáng)性藥治療組關(guān)節(jié)滑膜組織中的AA和PGE1的水平分別減少了53.0%和增加了92.4%，追風(fēng)傘低劑量組關(guān)節(jié)滑膜組織中的AA和PGE1的水平分別減少了12.8%和增加了25.2%，追風(fēng)傘中劑量組關(guān)節(jié)滑膜組織中的AA和PGE1的水平分別減少了27.7%和增加了49.0%，追風(fēng)傘高劑量組關(guān)節(jié)滑膜組織中的AA和PGE1的水平分別減少了22.5% 和增加了71.9%。對(duì)于AA，各治療組之間無顯著性差異；對(duì)于PGE1，低、高劑量組之間存在顯著性差異。

圖4 大鼠關(guān)節(jié)滑膜中PDGF-A（A）、VEGFA（B）、IGF 1（C）、FGF-2（D）、HGF（E）、TGFβ1（F）、PPP2R5C（G）、FXR1（H）和TNF-α（I）的表達(dá)水平（n=10）

2.3 大鼠滑膜組織的病理學(xué)分析

組織病理學(xué)分析（如圖2）表明，在空白組的關(guān)節(jié)滑膜組織中，細(xì)胞單層排列且未發(fā)現(xiàn)異常的炎性細(xì)胞。模型組的大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中發(fā)生了嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，滑膜明顯增生，細(xì)胞排列不規(guī)則，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。陽(yáng)性藥治療組和追風(fēng)傘治療組的滑膜損傷較輕，滑膜增生被抑制，炎癥反應(yīng)被逆轉(zhuǎn)。

2.4 大鼠關(guān)節(jié)滑膜組織中 Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表達(dá)水平

與空白組相比（如圖3），模型組中的Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表達(dá)水平分別增加了2913.0%、154992.0%、11280.0%、380.5% 和 213499.5%。與模型組相比，陽(yáng)性藥治療組中的Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表達(dá)水平分別減少了97.7%、95.1%、99.6%、78.9%和67.4%，追風(fēng)傘低劑量組中的Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表達(dá)水平分別減少了58.3%、29.0%、96.9%、22.0%和20.2%，追風(fēng)傘中劑量組中的 Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表達(dá)水平分別減少了79.5%、56.1%、96.6%、53.5%和91.7%，追風(fēng)傘高劑量組中的Itga2b、Itgb3、eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表達(dá)水平分別減少了98.7%、79.5%、77.1%、98.4%和98.6%。對(duì)于Itga2b、Itgb3及EIF4B，各治療組之間有顯著性差異；對(duì)于eEF1A2和EIF2B2，高劑量組分別與低中劑量組之間存在顯著性差異。

2.5 大鼠關(guān)節(jié)滑膜中PDGF-A、VEGFA、IGF 1、FGF-2、HGF、TGFβ1、PPP2R5C、FXR1和 TNF-α 的表達(dá)水平

與空白組相比（如圖4），模型組的PDGF-A、IGF 1、PPP2R5C和TNF-α的表達(dá)水平分別增加了197.1%、170.7%、208.7%和151.0%，模型組的VEGFA、FGF-2、HGF、TGFβ1和FXR1的表達(dá)水平分別減少了83.2%、60.6%、65.3%、61.4%和69.0%。與模型組相比，陽(yáng)性藥治療組的PDGF-A、IGF 1、PPP2R5C和TNF-α的表達(dá)水平分別減少了53.0%、58.5%、60.7%和54.1%，陽(yáng)性藥治療組的VEGFA、FGF-2、HGF、TGFβ1和FXR1的表達(dá)水平分別增加了379.4%、130.8%、139.4%、103.5%和129.9%，追風(fēng)傘低劑量組的PDGF-A、IGF 1、PPP2R5C和TNF-α的表達(dá)水平分別減少了24.3%、10.8%、16.2%和20.3%，追風(fēng)傘低劑量組的VEGFA、FGF-2、HGF、TGFβ1和FXR1的表達(dá)水平分別增加了135.8%、34.0%、42.9%、2.8%和46.3%，追風(fēng)傘中劑量組的PDGF-A、IGF 1、PPP2R5C和TNF-α的表達(dá)水平分別減少了38.3%、21.5%、29.1%和31.4%，追風(fēng)傘中劑量組的VEGFA、FGF-2、HGF、TGFβ1和FXR1的表達(dá)水平分別增加了241.1%、77.6%、76.1%、45.3%和66.2%，追風(fēng)傘高劑量組的PDGF-A、IGF 1、PPP2R5C和TNF-α的表達(dá)水平分別減少了46.4%、50.8%、50.1%和47.9%，追風(fēng)傘高劑量組的VEGFA、FGF-2、HGF、TGFβ1和FXR1的表達(dá)水平分別增加了348.2%、100.2%、138.2%、88.9% 和 124.3%。對(duì)于 PDGF-A、VEGFA、HGF、TGFβ1、PPP2R5C、FXR1和 TNF-α，低、高劑量組之間存在顯著性差異；對(duì)于IGF 1，高劑量組分別與低中劑量組之間存在顯著性差異；對(duì)于FGF-2，各治療組之間無顯著性差異。

3 討論

關(guān)節(jié)內(nèi)注射碘乙酸鈉是一種常用的骨關(guān)節(jié)炎模型的造模方式[8]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，碘乙酸鈉可以對(duì)關(guān)節(jié)滑膜造成嚴(yán)重?fù)p傷。前期研究已經(jīng)表明，碘乙酸鈉能誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜中的炎癥、細(xì)胞凋亡和血小板聚集[3,9-10]。

3.1 追風(fēng)傘抑制骨關(guān)節(jié)炎中的滑膜炎癥

骨關(guān)節(jié)炎是一種發(fā)生在滑膜關(guān)節(jié)的炎癥疾病。碘乙酸鈉促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到關(guān)節(jié)滑膜中，并誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，從而進(jìn)一步導(dǎo)致滑膜增生和關(guān)節(jié)腫脹。追風(fēng)傘可以減輕炎癥細(xì)胞在滑膜中的浸潤(rùn)，從而減輕隨后由炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)的滑膜和關(guān)節(jié)病變。此外，前期生物標(biāo)簽研究也表明了，AA是追風(fēng)傘在滑膜細(xì)胞中的敏感靶點(diǎn)[2]。AA的異常表達(dá)能引起滑膜炎癥，并易于誘發(fā)骨關(guān)節(jié)炎[11]。追風(fēng)傘治療組具有能抑制滑膜中AA表達(dá)的趨勢(shì)。

3.2 追風(fēng)傘調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎滑膜細(xì)胞凋亡

細(xì)胞凋亡在骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制中起到關(guān)鍵的作用[1]。前期的研究發(fā)現(xiàn)[3]，F(xiàn)XR1和TNF-α的異常表達(dá)參與了碘乙酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的過程。然而，在模型組中，PPP2R5C（一種抗凋亡蛋白）也發(fā)生高表達(dá)，這可能是滑膜細(xì)胞抵抗碘乙酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的自我保護(hù)機(jī)制。追風(fēng)傘可以逆轉(zhuǎn)這些蛋白質(zhì)的異常表達(dá)，這有助于骨關(guān)節(jié)炎滑膜中的抗凋亡和促凋亡過程恢復(fù)平衡。

3.3 追風(fēng)傘抑制骨關(guān)節(jié)炎滑膜中血小板的聚集

骨關(guān)節(jié)炎滑膜中血小板的數(shù)量增加及激活是炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物[5]。激活的血小板能誘導(dǎo)滑膜微循環(huán)血栓的形成及軟骨損傷[12]。前期研究表明，追風(fēng)傘干預(yù)的關(guān)節(jié)滑膜中的4個(gè)生物標(biāo)簽與血小板聚集過程有緊密聯(lián)系[2-3]。Itga2b和Itgb3主要在血小板中表達(dá)，它們的表達(dá)水平可以代表血小板的數(shù)量[3]。與此同時(shí)，這兩個(gè)蛋白質(zhì)的過表達(dá)也可以促進(jìn)血小板聚集[3]，這與前期研究的結(jié)果是相一致的[3]。前期研究也表明了，追風(fēng)傘可以增加滑膜中PGE1的表達(dá)水平，這有助于抑制碘乙酸鈉誘導(dǎo)的血小板聚集[2]。在本研究中，追風(fēng)傘可以逆轉(zhuǎn)上述由碘乙酸鈉誘導(dǎo)的生物標(biāo)簽的異常表達(dá)。此外，AA也可以誘導(dǎo)血小板聚集[13]。追風(fēng)傘對(duì)AA表達(dá)的抑制也有助于減輕碘乙酸鈉誘導(dǎo)的血小板聚集。

血小板會(huì)釋放一些生長(zhǎng)因子，它們?cè)诠顷P(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程中表達(dá)異常[14]。在本研究中，碘乙酸鈉在誘導(dǎo)滑膜中血小板聚集的同時(shí)，也影響了其中6種生長(zhǎng)因子的表達(dá)。骨關(guān)節(jié)炎中PDGF-A和IGF1的表達(dá)上調(diào)在促進(jìn)滑膜增生和增強(qiáng)滑膜細(xì)胞對(duì)炎癥介質(zhì)的反應(yīng)中發(fā)揮作用[15-16]。前期研究表明，HGF和VEGFA的表達(dá)呈正相關(guān)性，且兩者都是重要的血管生成因子[17]。血管生成是創(chuàng)傷愈合過程中的關(guān)鍵步驟[18]。因此，模型組中HGF和VEGFA的表達(dá)不足不利于滑膜損傷的修復(fù)?；ぜ?xì)胞中的；TGFβ1和FGF-2具有軟骨保護(hù)作用[19-20]，它們能促進(jìn)軟骨的修復(fù)。模型組中的；TGFβ1和FGF-2的表達(dá)不足不利于骨關(guān)節(jié)炎軟骨損傷的修復(fù)。追風(fēng)傘能逆轉(zhuǎn)由碘乙酸鈉誘導(dǎo)的生長(zhǎng)因子的失調(diào)，這有助于骨關(guān)節(jié)炎中滑膜和軟骨損傷的修復(fù)。

3.4 追風(fēng)傘調(diào)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎滑膜中的蛋白質(zhì)合成功能障礙

前期生物標(biāo)簽研究結(jié)果顯示，eEF1A2、EIF2B2和EIF4B是追風(fēng)傘干預(yù)關(guān)節(jié)滑膜的敏感靶點(diǎn)[3]。EIF2B2和EIF4B是蛋白質(zhì)合成過程中的翻譯起始因子，eEF1A2是翻譯延伸因子[3]。有研究表明，eEF1A2和EIF4B的異常表達(dá)參與了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制[21-22]。在骨關(guān)節(jié)炎的滑膜和軟骨中，蛋白質(zhì)合成異常[23-24]。本研究表明，碘乙酸鈉可以引起滑膜中上述蛋白質(zhì)的表達(dá)失調(diào)，因此，碘乙酸鈉也可以用于骨關(guān)節(jié)炎中滑膜的蛋白質(zhì)合成功能障礙的機(jī)制和治療的研究。

在本研究中，碘乙酸鈉上調(diào)了eEF1A2、EIF2B2和EIF4B的表達(dá)水平，這有利于蛋白質(zhì)的合成?？赡苁怯捎诘庖宜徕c誘導(dǎo)關(guān)節(jié)滑膜損傷后，滑膜細(xì)胞產(chǎn)生的自我保護(hù)機(jī)制，從而增加蛋白質(zhì)合成過程的效率，促進(jìn)細(xì)胞和組織的修復(fù)和重建[3]。以上內(nèi)容提示了，追風(fēng)傘可通過多種途徑來減輕碘乙酸鈉誘導(dǎo)的滑膜損傷，進(jìn)一步減少滑膜組織的自我修復(fù)和自我重建的需求，因此緩解了蛋白質(zhì)的過度合成。追風(fēng)傘抑制了這些蛋白質(zhì)的表達(dá)。

4 結(jié)論

本研究表明，追風(fēng)傘可以減輕碘乙酸鈉誘導(dǎo)的骨關(guān)節(jié)炎模型的關(guān)節(jié)腫脹和滑膜損傷。其機(jī)制可能涉及炎癥、細(xì)胞凋亡、血小板聚集和蛋白質(zhì)合成功能障礙，這為后續(xù)追風(fēng)傘治療骨關(guān)節(jié)炎的物質(zhì)基礎(chǔ)的研究奠定基礎(chǔ)，為其在骨關(guān)節(jié)炎的臨床應(yīng)用提供了重要的依據(jù)。