基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討七味白術(shù)散預(yù)防糖尿病腎病的作用機制＊

劉仕琦，王 艷，齊 錚，李 冀＊＊

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 哈爾濱 150040；2.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥與食品工程學(xué)院 晉中 030619；3.山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 太原 030024）

糖尿病腎?。╠iabetic nephropathy，DN）作為糖尿病患者常見的并發(fā)癥，出現(xiàn)尿白蛋白和腎功能下降的現(xiàn)象，在我國成人患者發(fā)病率較高，約有五分之一的糖尿病患者受到糖尿病腎病的困擾[1]。糖尿病腎病的發(fā)病機制較復(fù)雜，較難闡明，伴隨著糖脂代謝異常，氧化應(yīng)激、慢性炎癥反應(yīng)等病理進程也參與了這一疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。糖尿病腎病屬于中醫(yī)“水腫”“虛勞”“尿濁”“消渴腎病”的范疇[3]。

七味白術(shù)散（QWBZ）原方載于宋代錢乙《小兒藥證直訣·下卷》，該方由人參、茯苓、白術(shù)、甘草、木香、藿香、葛根七味藥組成，具有補脾益氣的功效，臨床采用QWBZ加減方從脾論治以健脾益氣，和胃生津的方法治療DN[4]。臨床研究表明，七味白術(shù)散加味可改善早期DN患者血漿內(nèi)β2-微球蛋白，胱抑素C及尿微量白蛋白的含量[5]。七味白術(shù)散聯(lián)合雷米普利聯(lián)合胰激肽原酶片治療DN患者體內(nèi)尿蛋白含量增高，療效顯著，安全性較高[6]。目前QWBZ加減方或輔以西藥治療DN的臨床療效顯著，但作用機制并不明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)采用“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網(wǎng)絡(luò)，系統(tǒng)綜合地分析藥物對疾病網(wǎng)絡(luò)的干預(yù)與影響，其研究策略符合中醫(yī)藥學(xué)理論對疾病整體性的認識觀，有利于篩選中藥的有效成分及闡釋中藥的作用機制[7-9]。

采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與糖尿病小鼠實驗藥理學(xué)相結(jié)合的方法，分析QWBZ的降糖作用，對氧化應(yīng)激因子表達以及腎組織相關(guān)蛋白表達量的影響，旨在探討七味白術(shù)散預(yù)防糖尿病腎病的潛在作用機制。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)

1.1 成分及疾病靶點獲取

利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）進行活性成分的篩選，以類藥性（DL）、口服生物利用度（OB）為篩選參數(shù)、將獲得的活性成分導(dǎo)入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）和 SWISS TARGET PRDEICTION（http://www.swisstargetprediction.ch/index.php）數(shù)據(jù)庫獲取成分靶點構(gòu)建藥效物質(zhì)[10-11]。

在Therapeutic Target Database（http://www.swisstarget prediction.ch/index.php）數(shù)據(jù)庫和 Gene Cards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫中輸入糖尿病腎病腎?。―iabetic Nephropathy），以“score≥50”進行篩選獲得疾病靶點。

1.2 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及分析

String數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org/）構(gòu)建蛋白間互作網(wǎng)絡(luò)（PPI）。用Cytoscape可視化軟件（http://www.cytoscape.org/）中merge工具做交集，再利用CytoNCA插件進行網(wǎng)絡(luò)評估分析，選擇Degree≥中位數(shù)的2倍靶點為核心靶點構(gòu)建核心靶點PPI圖。使用ClueGO插件對核心靶點進行富集分析[12]。

1.3 分子對接

將QWBZ中活性成分與預(yù)測關(guān)鍵通路中的蛋白進行分子對接，進一步驗證QWBZ對DN的調(diào)控作用，PBD數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）檢索Resolution（?）最小、結(jié)合率最高的蛋白結(jié)構(gòu)，ZINC數(shù)據(jù)庫（https://zinc.docking.org/）中下載化學(xué)成分的Mol2結(jié)構(gòu)，AutoDock軟件（https://autodock.scripps.edu/）分子對接。

2 藥理學(xué)實驗

2.1 材料

2.1.1 實驗動物及飼料

BALB/c小鼠，8周齡，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京維通利華實驗動物（SCXK（京）2016-0006），合格證11400700316274。D12492高脂飼料與普通飼料，北京蕙特比公司。

2.1.2 試藥

黨參（北京鶴延齡藥業(yè)發(fā)展有限公司批號：170851）；茯苓、炒白術(shù)、炙甘草、廣藿香、木香、葛根（安徽盛海堂中藥飲片有限公司批號：201710173、201711167、 201711160、 201711151、 201801070、201710150）均購自于同仁堂，由山西中醫(yī)藥大學(xué)王兵老師鑒定為正品。

丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）均購自南京建成生物工程研究所（批號分別為20200410、20200405、20200602）。鏈脲佐菌素（STZ，Lot：WXBC2044V，Sigma）、TGF-β1（BS-0086R，BIOSS）、ASK1（28201-1-aP，武漢三鷹）。ACTIN（GB12001）、β -actin（GB12001）、GAPDH（GB12002）、HRP標記山羊抗兔（GB23303）、HRP標記山羊抗鼠（GB23301），購于Servicebio。

2.1.3 儀器

Rt2100c酶標檢測儀（Rayto），Neofuge 13R冷凍離心機（Heal Force），KZ-II勻漿儀（Servicebio），DYCZ-24DN電泳儀和DYCZ-40D轉(zhuǎn)印儀（北京六一儀器），AlphaEaseFC灰度分析。

2.2 實驗方法

2.2.1 動物造模與分組

BALB/c雌雄小鼠各半，8周齡SPF級，4周D12492高脂飼料，腹腔注射80 mg·kg-1·d-1STZ，3天后測定血糖濃度超過11.1 mmol·L-1，判斷為是建模小鼠[13]。將建模成功的小鼠按血糖、體重，隨機分為模型組、QWBZ組，模型組小鼠、QWBZ組小鼠采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)，QWBZ組灌胃QWBZ煎劑18.7 g·kg-1·d-1，模型組灌胃等體積生理鹽水，給藥4周。空白組小鼠采用普通飼料喂養(yǎng)，灌胃等劑量生理鹽水。

2.2.2 氧化因子含量的表達

ELISA試劑盒檢測各組小鼠血清中SOD、MDA、GPX的含量。

2.2.3 腎臟組織TGF-β1和ASK1蛋白表達

提取腎組織總蛋白，BCA試劑盒測定腎組織蛋白濃度。上樣蛋白，室溫條件下進行不同組別之間蛋白電泳，加入冰盒控制電轉(zhuǎn)溫度，將轉(zhuǎn)好的膜于脫色搖床上用5%的脫脂牛奶封閉1 h。稀釋一抗（TGF-β1 1∶1000；ASK1 1∶1000；ACTIN 1∶1000），4℃條件封閉過夜。TBST清洗3次，每次5 min。孵育二抗30 min，TBST清洗3次。用ECL顯色液激發(fā)PVDF膜1-2 min，進行曝光，顯影，拍照，去色，分析不同組別兩個蛋白的目的條帶和光密度值。

2.2.4 統(tǒng)計分析

3 結(jié)果

3.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果

3.1.1 活性成分篩選

QWBZ中活性成分的篩選條件為DL≥0.18、OB≥30%（甘草為OB≥60%），黨參成分21個，茯苓成分15個，白術(shù)成分7個，甘草成分25個，葛根成分5個，藿香成分12個，木香成分8個（表1）。例如木犀草素（Luteolin）、槲 皮 素（Quercetin）、霍 香 黃 酮 醇（Pachypodol）、7-甲氧基-2-甲基異黃酮（7-Methoxy-2-methyl isoflavone）、黃豆黃素（Glycitein）等。

模型組大鼠黑色條狀潰瘍較多，為深層潰瘍，潰瘍得分為116。給予注射用雷貝拉唑鈉后，大鼠的胃損傷程度有所減輕，與模型組比較，0.5、1.0、2.0、4.0 mg/kg劑量組潰瘍得分均顯著降低（P＜0.05、0.01）。見表3。

3.1.2 PPI網(wǎng)絡(luò)與交集網(wǎng)絡(luò)

構(gòu)建的QWBZ成分-靶點PPI網(wǎng)絡(luò)（圖1），糖尿病腎病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)表示與DN有關(guān)的靶點蛋白之間的相互作用關(guān)系（圖2）。

成分與疾病靶點得分前15位的成分靶點（表2），內(nèi)皮生長因子受體（EGFR）和蛋白酪氨酸磷酸酶11（PTPN11）得分值高且頻率高，表明靶點結(jié)合度高且與多個節(jié)點具有相互作用關(guān)系，這些靶點可能是QWBZ發(fā)揮作用的關(guān)鍵靶點。胰島素樣生長因子I（IGF1）、胰島素樣生長因子1受體（IGF1R）和胰島素（INS）得分值和頻率均高，表示靶點結(jié)合度高，并且與多個節(jié)點具有相互作用關(guān)系，其在糖尿病腎病的發(fā)病及治療中起著重要的作用。

將上述PPI網(wǎng)絡(luò)做交集，設(shè)定篩選范圍為degree≥16，獲得33個核心靶點，PPI網(wǎng)絡(luò)如圖3所示。QWBZ聯(lián)合針灸治療糖尿病周圍神經(jīng)病變，可影響EGFR、IGF1等的表達水平[14]。葛根素能明顯降低大鼠肝臟蛋白酪氨酸磷酸酶1B的表達，與胰島素抵抗組相比減少了32.8%，說明葛根素的干預(yù)能夠改善機體的胰島素抵抗，可能是與降低PTP1B蛋白表達有關(guān)[15]。實驗和臨床依據(jù)為活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)，以及治療靶點-疾病網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建提供了一定的參考。

3.1.3 通路分析

將核心靶點的基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫進行GO分析和KEGG分析，對前10條通路在微生信平臺進行可視化分析（圖4-5）。

GO分析發(fā)現(xiàn)，七味白術(shù)散與葡萄糖穩(wěn)態(tài)負調(diào)控、凋亡過程正調(diào)控、磷脂酰肌醇3-激酶信號通路正調(diào)控、MAPK級聯(lián)正調(diào)控、細胞遷移正調(diào)控、蛋白代謝過程、細胞對胰島素刺激的反應(yīng)正調(diào)控、細胞增殖負調(diào)控、基因表達正調(diào)控、蛋白質(zhì)磷酸化的正調(diào)控等過程，QWBZ可能是通過調(diào)節(jié)多個生物過程而發(fā)揮降糖作用。

表1 QWBZ化學(xué)成分

續(xù)表

3.1.4 分子對接

圖1 QWBZ成分-靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖2 糖尿病腎病靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 核心靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 KEGG富集通路

圖5 GO富集通路

圖6 分子對接可視化圖

將QWBZ中活性核心成分luteolin、pachypodol、quercetin、7-Methoxy-2-methyl isoflavone、glycitein 與TGF-β1、AKT1、INS、ALB和EGFR蛋白進行分子對接，結(jié)合能小于-5 kcal表明成分與蛋白的結(jié)合效果好，且數(shù)值越小表明結(jié)合力越強。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，5種活性成分與5個核心靶點均有良好的結(jié)合效果，均小于-5 kcal（表3）。其中l(wèi)uteolin結(jié)合效果最佳，與TGF-β1的結(jié)合能為-8.0 kcal·mol-1，存在氫鍵締合，luteolin與EFGR結(jié)合能為-8.8 kcal·mol-1，luteolin是一種黃酮類化合物。分子對接部分可視化結(jié)果如圖6所示。

3.2 七味白術(shù)散對糖尿病小鼠的作用

3.2.1 對機體氧化應(yīng)激水平的影響

模型組小鼠SOD、MDA、GPX含量與空白組相比都有顯著性差異（P＜0.05），其中SOD含量呈現(xiàn)顯著降低（P＜0.05），MDA含量呈現(xiàn)顯著升高（P＜0.01），GPX含量呈現(xiàn)顯著降低（P＜0.05）。

QWBZ組SOD含量較模型組均呈現(xiàn)顯著升高（P＜0.05），MDA含量較模型組降低，GPX含量較模型組有顯著性差異（P＜0.01）（表4）。

3.2.2 對腎臟組織TGF-β1和ASK1蛋白表達的影響

模型組小鼠腎臟組織中TGF-β1和ASK1蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，QWBZ組小鼠腎臟組織中TGF-β1和ASK1蛋白表達明顯降低（P＜0.01，P＜0.05）（圖8、表5）。

表2 成分與疾病靶點得分值

表3 分子對接能量

表4 小鼠血清中氧化因子含量表達（，n=6）

表4 小鼠血清中氧化因子含量表達（，n=6）

注：與空白組比，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

GPX/ng·L-1 773.77±32.49 602.55±41.87**691.72±50.08▲▲組別空白組模型組QWBZ組SOD/U·mg-1 661.64±32.55 578.91±68.67*600.86±33.22▲MDA/nmol·mg-1 1.00±0.09 1.27±0.11**1.13±0.14

圖8 小鼠腎臟組織中TGF-β1和ASK1蛋白表達（，n=3）

4 討論

七味白術(shù)散功用為健脾益氣，解決了DN患者脾氣虛弱的病癥。課題組前期研究表明QWBZ可以控制血糖，降低不良反應(yīng)的發(fā)生[16]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究表明，該方中君藥黨參成分中α-菠甾醇、豆甾醇、菠菜甾醇具有改善細胞凋亡、血管生成、炎癥等作用[17]。川芎哚及其類似物具有抗凝血、改善血液流變學(xué)，降低血液粘度的作用。黃豆黃素有抑制血管再生，抑制癌細胞，誘導(dǎo)細胞凋亡等作用[18]。QWBZ成分靶點中PTPN11基因?qū)儆诶野彼崃姿崦讣易澹c酪氨酸磷酸酶ShP2相互作用構(gòu)成磷酸化調(diào)控細胞信號傳導(dǎo)的基礎(chǔ)，如影響絲裂原活化從而影響炎性介質(zhì)的釋放發(fā)揮對糖尿病大血管病變的保護作用，進而改善糖尿病[19]。血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）可介導(dǎo)血管新生，并提高微血管滲透性，促進毛細血管穿透侵入組織內(nèi)，可以改善糖尿病腎病中的血管性病變，改善微血管病變[20]。疾病靶點中胰島素通過激活磷脂酰肌醇-3激酶的活性，促進蛋白激酶B磷酸化，進而增加GLUT-4轉(zhuǎn)位，促進葡萄糖攝取與利用[21]。IGF-1R可通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT調(diào)控Ras和Raf蛋白，進而激活有絲分裂原激活蛋白激酶，使得IGF-1R與其特異性抗體相結(jié)合，作用于IGF-1R進而對糖類代謝產(chǎn)生影響[22]。

表5 小鼠腎臟組織中TGF-β1和ASK1蛋白表達（，n=3）

表5 小鼠腎臟組織中TGF-β1和ASK1蛋白表達（，n=3）

注：與空白組比， **P＜0.01；與模型組比，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別空白組模型組QWBZ組ASK1 0.905±0.100 1.270±0.156**1.012±0.180▲TGF-β1 0.116±0.016 0.522±0.092**0.390±0.094▲▲

DN是糖尿病晚期腎功能衰竭、死亡的主要因素之一，表現(xiàn)為腎小球的病理損傷，發(fā)生機理很復(fù)雜，而氧化應(yīng)激是它發(fā)生的最重要的原因之一[23]。高糖會誘導(dǎo)線粒體過度共作產(chǎn)生過量的活性氧及自由基，是糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生的初步機理。血清SOD、MDA和GPX水平反映出機體的氧化應(yīng)激狀況，實驗結(jié)果顯示七味白術(shù)散降低糖尿病小鼠的血清MDA濃度，通過提高SOD、GPX的濃度降低了機體氧化反應(yīng)水平、從而提高了機體對由于糖脂代謝紊亂而形成過量ROS的降解能力，進而減輕了糖尿病腎病的病情。

絲裂原活化蛋白激酶信號通路參與了DN的發(fā)生與發(fā)展，被高血糖、前炎癥因子、氧化應(yīng)激等多種因素誘導(dǎo)激活；經(jīng)過活化后的下游信號通路，通過直接刺激下游α-受體平滑肌肌動蛋白、纖維連接蛋白以及間層纖維黏連蛋白過度氧化合成，促進急性糖尿病以及腎臟纖維化[24-25]。凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1（ASK1）是MAPK家族的重要一員，多種應(yīng)激損傷和促炎因子可激活A(yù)SK1進而MAPK通路對應(yīng)激作出應(yīng)答或促使細胞凋亡。ASK1在腎臟炎癥，凋亡及纖維化發(fā)生的過程中起重要作用，研究表明阻斷ASK1的激活，可減輕腎小球硬化和腎小球損傷[26]。轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1）是引起腎小球細胞外基質(zhì)的產(chǎn)生、腎小管上皮間質(zhì)化、腎臟組織纖維化的重要因素，降低TGF-β1水平可改善腎小球硬化和小管間質(zhì)的纖維化，延緩腎病的進程[27]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)實驗結(jié)果表明七味白術(shù)散在治療糖尿病腎病過程中涉及MAPK信號通路的調(diào)節(jié)作用；實驗藥理學(xué)結(jié)果表明七味白術(shù)散對糖尿病小鼠腎臟組織中TGFβ1和ASK1蛋白表達有降低的作用，提示其對DN的防治作用與調(diào)節(jié)腎組織中TGF-β1和ASK1表達水平有關(guān)，共同揭示七味白術(shù)散對糖尿病腎病的調(diào)控作用。