基于HIF1α-Smad/Runx2/Osterix信號(hào)軸探討黃芪補(bǔ)腎活血湯治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制＊

張夢棣，時(shí)光喜，浦冬青，馮丹丹，李靜蔚

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院 濟(jì)南 250000；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院 濟(jì)南 250000；3.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 濟(jì)南 250000）

26%-50%乳腺癌患者的首發(fā)轉(zhuǎn)移為骨轉(zhuǎn)移，乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者比例高達(dá)73%[1]。骨轉(zhuǎn)移不僅會(huì)導(dǎo)致劇烈的骨痛，還會(huì)引起病理性骨折、高鈣血癥以及脊髓壓迫等骨相關(guān)事件[2]，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量、預(yù)后及總生存期。乳腺癌患者確診骨轉(zhuǎn)移后的5年生存率僅20%-30%[3]，不同亞型乳腺癌的預(yù)后及轉(zhuǎn)歸也有很大差異，其中以激素受體陽性者最容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，發(fā)生率為63.7%，其晚期乳腺癌患者中72.1%首次轉(zhuǎn)移的部位為骨[3]。內(nèi)分泌治療方案中的芳香化酶抑制劑和卵巢功能抑制劑可以抑制雌激素的產(chǎn)生、氟維司群可下調(diào)并降解ER、提高破骨細(xì)胞活性、抑制成骨細(xì)胞功能、促進(jìn)腫瘤骨轉(zhuǎn)移。同時(shí)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移易對(duì)治療產(chǎn)生抗性，疾病易進(jìn)一步進(jìn)展，晚期轉(zhuǎn)移很難治愈，此時(shí)主要治療目標(biāo)是減輕病痛、改善生活質(zhì)量和延長生存期[4]。

西醫(yī)的各種治療手段療效明顯，但伴有一定的副作用，如貧血、胃腸道反應(yīng)以及食欲下降等。臨床研究中越來越多的中藥方[5-7]被挖掘出具有治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移作用，同時(shí)可以抗癌止痛、減少副作用、提高身體機(jī)能狀態(tài)及生存質(zhì)量。本研究在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，總結(jié)臨床病例，提出在經(jīng)典方劑補(bǔ)腎活血湯基礎(chǔ)上增加補(bǔ)益正氣之黃芪用于乳腺癌骨轉(zhuǎn)移治療，從“補(bǔ)腎益氣”、“活血化瘀”論治，標(biāo)本兼治。通過體外實(shí)驗(yàn)探究黃芪補(bǔ)腎活血湯治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移提供更多的方藥選擇。

1 材料

1.1 細(xì)胞來源

乳腺癌細(xì)胞MCF-7、成骨細(xì)胞MC3T3-E1購于武漢塞維爾公司。

1.2 藥物與試劑

黃芪補(bǔ)腎活血湯中藥飲片由山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房采購并經(jīng)過藥學(xué)部主任馬傳江鑒定，均符合相應(yīng)要求。黃芪補(bǔ)腎活血湯制備：黃芪補(bǔ)腎活血湯的組成為：黃芪（Astragali Radix，12 g，產(chǎn)地內(nèi)蒙古自治區(qū)，批號(hào)2102230252），熟地（Rehmannia glutinosa，12 g，產(chǎn)地河南，批號(hào) 2007280222），補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifolia Linn，12 g，產(chǎn)地云南，批號(hào)1909030952），菟絲子（ Cuscuta chinensis Lam，12 g，產(chǎn)地內(nèi)蒙古自治區(qū)，批號(hào)2012300342），杜仲（Eucommia ulmoides Oliver，4 g，產(chǎn)地湖北，批號(hào)2012060152），枸杞（Lycium chinense，4 g，產(chǎn)地寧夏回族自治區(qū)，批號(hào)201201檢4），當(dāng)歸（Angelicae Sinensis Radix，4 g，產(chǎn)地甘肅，批號(hào)200901檢H），山萸肉（Cornus officinalis Sieb. et Zucc，4 g，產(chǎn)地浙江，批號(hào)2012150122），肉蓯蓉（Cistanches Herba，4 g，產(chǎn)地新疆維吾爾自治區(qū)，批號(hào)2011080252），獨(dú)活（Angelicae Pubescentis Radix，4g，產(chǎn)地湖北，2103070122），紅花（Carthamus tinctorius L，2 g，產(chǎn)地新疆維吾爾自治區(qū)，批號(hào)2103280012）。制藥后于冰箱中保存（4℃）。具體步驟如下：把煎藥器藥缸和蒸發(fā)濃縮設(shè)備用蒸餾水和75%酒精反復(fù)沖洗，將補(bǔ)腎活血中藥用煎藥器加水煎至生藥濃度為1.0 g·mL-1的水劑制成黃芪補(bǔ)腎活血湯藥母液，將濃縮好的湯液離心（3000 r·min-1，半徑16 cm）5 min 5次，濾紙過濾后采用高壓蒸氣滅菌法滅菌后使用0.22 μm無菌濾器過濾。取濾液備用。我們將水煎液的過程進(jìn)行了嚴(yán)格的程序化，以保證水煎液細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的可靠性和可重復(fù)性。經(jīng)過3次測試，結(jié)果均一致。

胎牛血清（Biological Industries公司，貨號(hào)04-001-1A)，DMEM高糖培養(yǎng)基（中科邁晨科技有限公司，貨號(hào)CM15019），胰蛋白酶（美國Gibco公司，貨號(hào)1798320），青-鏈霉素（中科邁晨科技有限公司，貨號(hào)cc004），細(xì)胞增殖與活性檢測（CCK-8）試劑盒（日本北仁，貨號(hào)CK04），EdU-555細(xì)胞增殖檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)C0075L），Annexin VFITC/PI Apoptosis Detection Kit（Vazyme，貨 號(hào) A211-02），缺氧誘導(dǎo)因子1α抗體（HIF1α）、內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、羊抗鼠疫球蛋白（Ig）G二抗、山羊抗兔（Ig）G二抗（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為20960-1-AP、66009-1-Ig、SA00001-1、SA00001-2）；Smad1、Smad5、Runx2、Osterix抗體（英國Abcam公司，貨號(hào)分別為ab33902、ab40771、ab192256、ab209484），BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠、SDSPAGE電泳液、一抗稀釋液、二抗稀釋液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)分別為P0010、P0012AC、p0562、P0023A、p0023D），電轉(zhuǎn)液（北京索萊寶科技有限公司，貨號(hào)P0021b）。

1.3 設(shè)備

Multiskan Go1510型酶標(biāo)儀、5424R型低速離心機(jī)（美國Thermo Fisher），DK-8D型電熱恒溫水浴鍋（上海比朗），LDZM-80KCS-Ⅱ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），SIM-F124型制冰機(jī)（日本SANYO），CascadaⅠ型純化水系統(tǒng)（美國 PALL），Axiovert 40型倒置顯微鏡（德國Carl zeiss）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將MCF-7細(xì)胞、MC3T3-E1細(xì)胞置于高糖DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)（含胎牛血清10%，青霉素-鏈霉素1%），37℃，5% CO2條件培養(yǎng)箱中孵育，隔日傳代1次。

2.2 共培養(yǎng)

采用Transwell培養(yǎng)板（美國康寧）構(gòu)建共培養(yǎng)體系，小室上室中鋪4×104個(gè)MCF-7細(xì)胞，下室中鋪4×106個(gè)MC3T3-E1細(xì)胞；Transwell小室中細(xì)胞培養(yǎng)24 h之后，向上室中的MCF-7細(xì)胞添加藥物，濃度分別0、20、40 mg·mL-1，培養(yǎng)48 h后，收取下室細(xì)胞，用于蛋白檢測。

2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞活力

取對(duì)數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞，胰蛋白酶消化，完全培養(yǎng)基終止消化。制作濃度為每毫升7×104個(gè)的單細(xì)胞懸液，加入96孔板中（每孔100 μL）。24 h后實(shí)驗(yàn)組加入黃芪補(bǔ)腎活血湯梯度質(zhì)量濃度（0、20、40、60、120、240 mg·mL-1），對(duì)照組加入唑來膦酸梯度質(zhì)量濃度（0、10、20、40、60 mg·mL-1）。實(shí)驗(yàn)藥物濃度每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)平行孔，培養(yǎng)48 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL，37℃恒溫培養(yǎng)40 min，酶標(biāo)儀探測450 nm波長處吸光度A。細(xì)胞增殖存活率通過GraphPad軟件計(jì)算。

2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力

將細(xì)胞接種于6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約90%時(shí)，使用200 μL槍頭于細(xì)胞板上劃痕，PBS沖洗清除被劃下的貼壁細(xì)胞，然后加入無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。分別于劃痕后0 h、24 h時(shí)取樣并拍照記錄。最后使用Image J軟件測量劃痕面積，并計(jì)算細(xì)胞遷移率。

2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力

取750 μL完全培養(yǎng)基加入24孔板中，取適量細(xì)胞鋪入上室，滴加無血清培養(yǎng)基補(bǔ)全至200 μL。將上層小室中的培養(yǎng)基棄掉，并用PBS清洗，在新的孔中添加750 μL多聚甲醛，將上層小室轉(zhuǎn)移至多聚甲醛固定20 min。固定結(jié)束后，將小室取出，用PBS清洗，用棉簽將內(nèi)膜細(xì)胞輕輕旋轉(zhuǎn)擦拭，在新的孔中添加750 μL 10%結(jié)晶紫染色液，將上層小室轉(zhuǎn)移至其中染色20 min。取出小室，用PBS清洗，顯微鏡拍照。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

離心收集MCF-7細(xì)胞加入PBS重懸清洗細(xì)胞，然后先后加入FITC Annexin V及PI進(jìn)行染色，避光孵育15 min后，使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。

2.7 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆增殖能力

將細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿，置于恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)1-3周。有集落生成時(shí)，終止培養(yǎng)。使用PBS洗滌細(xì)胞2次后，分別以4%甲醇、10%結(jié)晶紫對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定與染色，作用時(shí)間均為20 min。PBS清洗，待干燥后在顯微鏡低倍鏡下觀察拍照并計(jì)數(shù)。其中，將超過10個(gè)細(xì)胞的集落作為一個(gè)有效克隆，以克隆數(shù)與接種細(xì)胞數(shù)的百分比表示各組細(xì)胞的克隆形成率。

2.8 Edu增殖實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力

將細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)24 h，棄去原培養(yǎng)基，加入500 μL 2x的EdU工作液繼續(xù)孵育2 h。EdU標(biāo)記細(xì)胞完成后，進(jìn)行細(xì)胞涂片，加入4%的多聚甲醛，室溫固定15 min。沖洗后，每孔用通透液室溫孵育15 min，再次沖洗后加入Click反應(yīng)液均勻覆蓋樣品，室溫避光孵育30 min。沖洗后吸除，每孔加11×Hoechst 33342溶液，室溫避光孵育10 min。吸除后洗滌，然后進(jìn)行熒光拍照檢測。

2.9 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)情況

細(xì)胞加藥分組處理48 h，取沉淀，各加含1%PMSF的裂解液約80-100 μL，取上清。BCA試劑盒測蛋白濃度。電泳，每個(gè)泳道上樣30 μg；轉(zhuǎn)膜，然后5%脫 脂 奶 粉 室 溫 封 閉 1 h。 HIF1α、Smad1、Smad5、Runx2、Osterix抗體在4℃下過夜孵育。二抗室溫孵育1 h，顯影。相對(duì)蛋白表達(dá)量=灰度值（目的）/灰度值（內(nèi)參）。

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS 26及GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及作圖，多組間比較使用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 黃芪補(bǔ)腎活血湯抑制MCF-7細(xì)胞活力

細(xì)胞系選取最容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的Luminal A型乳腺癌細(xì)胞MCF-7，在干預(yù)48 h時(shí)，CCK-8法檢測顯示在20-120 mg·mL-1黃芪補(bǔ)腎活血湯的干預(yù)下相對(duì)于空白組具有明顯抑制作用，特別是40-120 mg·mL-1劑量的藥物對(duì)MCF-7細(xì)胞抑制作用最明顯，得半數(shù)抑制濃度（IC50）為（28.58±1.79）mg·mL-1。唑來膦酸組顯示藥物濃度在10-40 mg·mL-1時(shí)相對(duì)于空白組抑制明顯。見圖1。

3.2 黃芪補(bǔ)腎活血湯有效抑制MCF-7遷移

遷移實(shí)驗(yàn)顯示，黃芪補(bǔ)腎活血湯（20 mg·mL-1、40 mg·mL-1）組 細(xì) 胞 遷 移 率 分 別 為（22.2±4.1）% 、（17.3±3.4）%，與control組（30.0±7.9）%相比，遷移率明顯降低（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1和圖2。

3.3 黃芪補(bǔ)腎活血湯顯著抑制MCF-7細(xì)胞侵襲

Transwell檢測結(jié)果顯示，黃芪補(bǔ)腎活血湯（20 mg·mL-1、40 mg·mL-1）組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為 414.7±34.0、374.7±58.6，與control組（514.7±24.11）相比，明顯減少（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1和圖3。

3.4 黃芪補(bǔ)腎活血湯明顯促進(jìn)MCF-7細(xì)胞凋亡

圖1 CCK-8 法檢測不同質(zhì)量濃度黃芪補(bǔ)腎活血湯、唑來膦酸干預(yù)MCF-7細(xì)胞48 h后的活力變化

圖2 遷移實(shí)驗(yàn)檢測不同質(zhì)量濃度黃芪補(bǔ)腎活血湯干預(yù)MCF-7細(xì)胞24 h后的遷移變化

圖3 Transwell檢測不同質(zhì)量濃度黃芪補(bǔ)腎活血湯干預(yù)MCF-7細(xì)胞的侵襲變化

流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，黃芪補(bǔ)腎活血湯（20 mg·mL-1、40 mg·mL-1）組細(xì)胞凋亡率分別為（6.3±0.1）%、（6.2±0.1），較 control組（3.8±0.2）%明顯升高（P＜0.05），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1和圖4。

3.5 黃芪補(bǔ)腎活血湯有效抑制MCF-7細(xì)胞克隆增殖能力

平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測MCF-7細(xì)胞黃芪補(bǔ)腎活血湯（20 mg·mL-1、40 mg·mL-1）組的細(xì)胞克隆個(gè)數(shù)分別為392.0±51.1、325.3±50.3，與control組（437.3±31.1）相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1和圖5。

表1 不同質(zhì)量濃度黃芪補(bǔ)腎活血湯對(duì)MCF-7細(xì)胞遷移、凋亡、侵襲、克隆的影響

3.6 黃芪補(bǔ)腎活血湯明顯降低EDU細(xì)胞陽性率

EDU增殖實(shí)驗(yàn)檢測黃芪補(bǔ)腎活血湯對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖的影響，control組、黃芪補(bǔ)腎活血湯（20 mg·mL-1、40 mg·mL-1）組的 EDU 細(xì)胞陽性率分別為（22.4±1.5）%、（21.9±1.6）%、（20.2±0.6）%，3 組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1和圖6。

3.7 黃芪補(bǔ)腎活血湯抑制HIF1α、Osterix的蛋白表達(dá)，提高Smad1、Smad5、Runx2的蛋白表達(dá)

乳腺癌細(xì)胞選取最容易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移的Luminal A型乳腺癌細(xì)胞MCF-7，骨細(xì)胞選取成骨細(xì)胞MC3T3-E1，共培養(yǎng)后收取蛋白。根據(jù)IC50，分別選取低、高質(zhì)量濃度20、40 mg·mL-1用于Western blot中檢測黃芪補(bǔ)腎活血湯對(duì)HIF1α、Osterix、Smad1、Smad5和Runx2蛋白表達(dá)的影響，見圖6。結(jié)果提示與空白組相比，20 mg·mL-1組和40 mg·mL-1組HIF1α、Osterix的表達(dá)均明顯降低（P＜0.05），Smad1、Smad5、Runx2的表達(dá)明顯升高（P＜0.05），且 40 mg·mL-1組作用更明顯。見表 2和圖7。

圖4 流式凋亡術(shù)檢測不同質(zhì)量濃度黃芪補(bǔ)腎活血湯干預(yù)MCF-7細(xì)胞的凋亡變化

圖5 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測不同質(zhì)量濃度黃芪補(bǔ)腎活血湯干預(yù)MCF-7細(xì)胞克隆的變化

圖6 EDU增殖實(shí)驗(yàn)檢測不同質(zhì)量濃度有效黃芪補(bǔ)腎活血湯抑制MCF-7細(xì)胞增殖

表2 黃芪補(bǔ)腎活血湯對(duì)HIF1α、Osterix、Smad1、Smad5、Runx2蛋白表達(dá)的影響（）

表2 黃芪補(bǔ)腎活血湯對(duì)HIF1α、Osterix、Smad1、Smad5、Runx2蛋白表達(dá)的影響（）

注：與control組比較，1）P=0.05，2）P＜0.05，3）P＜0.01。

Smad5 0.90±0.11 1.53±0.143）1.56±0.123）組別Control黃芪補(bǔ)腎活血湯組 20 mg·mL-1 40 mg·mL-1蛋白相對(duì)表達(dá)量HIF1α 1.07±0.02 0.84±0.042）0.60±0.133）Osterix 1.16±0.13 0.68±0.121）0.61±0.153）Runx2 0.71±0.12 1.06±0.023）1.66±0.143）Smad1 0.44±0.006 0.84±0.083）1.01±0.023）

圖7 Western blot檢測低、高濃度黃芪補(bǔ)腎活血湯抑制MCF-7細(xì)胞HIF1α、Osterix蛋白表達(dá)，促進(jìn)smad1、smad5、Runx2蛋白表達(dá)

4 討論與結(jié)論

乳腺癌骨轉(zhuǎn)移是一個(gè)多種因子參與、多步驟和連續(xù)性的級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程[8]，分為局部浸潤、進(jìn)入脈管系統(tǒng)、在脈管系統(tǒng)中存活、到達(dá)轉(zhuǎn)移組織或器官、逸出循環(huán)系統(tǒng)、形成轉(zhuǎn)移灶和形成克隆轉(zhuǎn)移灶等過程[9]。轉(zhuǎn)移至骨骼的乳腺癌細(xì)胞會(huì)通過干擾破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成而打破正常骨骼重塑的平衡[10]。目前主要從抑制骨轉(zhuǎn)移灶中腫瘤細(xì)胞的生長和抑制破骨細(xì)胞的活性兩方面來減少骨相關(guān)事件的發(fā)生，常用藥物有雙膦酸鹽、地諾單抗等[9]，但遠(yuǎn)期療效仍不理想，且伴有嚴(yán)重的副作用。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為“腎損”是乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的主要病因，癌癥日久，復(fù)經(jīng)手術(shù)、放化療等，損傷正氣，耗竭腎精，腎主骨生髓，腎精虧虛則骨空髓枯，邪氣乘虛而入，凝結(jié)于骨，阻滯經(jīng)絡(luò)，引起疼痛[11-12]。治療上強(qiáng)調(diào)整體觀念，根據(jù)各個(gè)患者不同的臨床癥狀，調(diào)整機(jī)體陰陽、氣血、臟腑功能的平衡，標(biāo)本兼治，扶正祛邪，從而減少腫瘤的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移以及延長生存期與提高生活質(zhì)量。

近年來，中醫(yī)藥治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移在作用機(jī)制探索、臨床療效觀察上的研究均取得了重要進(jìn)展[13]。馮丹丹等[2]研究證明小金丸通過HIF、VEGF等相關(guān)信號(hào)通路作用于AR、MMP-9等主要靶點(diǎn)蛋白，改善腫瘤微環(huán)境缺氧，抑制血管生成，降低細(xì)胞侵襲性和細(xì)胞活力。賴琦等[14]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)白術(shù)附子湯中的核心藥對(duì)“白術(shù)-附子”通過AKT1、IL6、MAPK3等核心靶點(diǎn)及雌激素信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化通路、HIF-1信號(hào)通路等治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移。楊爭等[15]基于循證醫(yī)學(xué)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)中藥聯(lián)合唑來膦酸在改善乳腺癌骨轉(zhuǎn)移病灶、緩解疼痛、提高生活質(zhì)量、減少不良反應(yīng)方面優(yōu)于單用唑來膦酸的效果。目前對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的研究主要是抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移、緩解骨轉(zhuǎn)移引起的骨相關(guān)事件，較少的目光集中在骨轉(zhuǎn)移形成后新骨形成和骨骼重塑[16]。本研究主要探究體外實(shí)驗(yàn)探究黃芪補(bǔ)腎活血湯通過HIF1α-Smad/Runx2/Osterix信號(hào)軸抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移、促進(jìn)骨骼重塑的作用機(jī)制。

4.1 黃芪補(bǔ)腎活血湯通過抑制HIF1α的表達(dá)進(jìn)而抑制乳腺癌的轉(zhuǎn)移

腫瘤內(nèi)缺氧是轉(zhuǎn)移性癌癥的常見表現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）是缺氧的標(biāo)志，腫瘤內(nèi)缺氧可導(dǎo)致HIF-1的激活。HIF-1是由HIF1α和HIF-1β兩個(gè)亞基組成的異源二聚體，α-亞基是HIF-1的主要活性成分，介導(dǎo)對(duì)缺氧的適應(yīng)性反應(yīng)。HIF1α與原發(fā)性乳腺癌預(yù)后不良和化療耐藥性相關(guān)，HIF1α過表達(dá)會(huì)激活血管生成、厭氧糖酵解、侵襲和轉(zhuǎn)移等一系列過程，導(dǎo)致乳腺癌患者腫瘤轉(zhuǎn)移和死亡的風(fēng)險(xiǎn)增加[17]。而骨髓是一種缺氧的微環(huán)境，富含生長因子和血管，并且很容易被乳腺癌來源的腫瘤細(xì)胞定植。骨基質(zhì)是生長因子的儲(chǔ)存庫，以及成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞，都分泌細(xì)胞因子和趨化因子。骨髓內(nèi)的低氧水平誘導(dǎo)HIF1α，不僅對(duì)惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移有影響，還對(duì)骨骼發(fā)育、重塑有深遠(yuǎn)的影響[18]。

4.2 黃芪補(bǔ)腎活血湯上調(diào)Smad1、Smad5誘導(dǎo)成骨形成

Smad1、Smad5屬于由BMP激活的R-Smads蛋白家族，參與BMP所介導(dǎo)的成骨信號(hào)通路[19]。在該信號(hào)通路中，Smads及其轉(zhuǎn)錄因子對(duì)成骨誘導(dǎo)至關(guān)重要。Smads家族的蛋白質(zhì)之間相互作用導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄活性復(fù)合物的形成，這些復(fù)合物具有調(diào)節(jié)各種發(fā)育和生物過程的潛力[20]。在軟骨形成的整個(gè)過程中，Smad蛋白在軟骨細(xì)胞中普遍表達(dá)。軟骨內(nèi)骨形成中的大多數(shù)BMP信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是由典型的Smad1/5通路而不是非典型通路介導(dǎo)的，Smad1、Smad5的缺失導(dǎo)致凝結(jié)階段的軟骨形成完全停滯[21]。激活的Smad1/5可以調(diào)節(jié)目標(biāo)基因—Runx2[22]。在成骨誘導(dǎo)過程中，Runx2通過直接結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活復(fù)合物與Smads一起發(fā)揮作用[23]。Smad1/5和Runx2的聯(lián)合作用已在多種細(xì)胞系統(tǒng)中得到廣泛研究。Runx2的羧基末端通過與核基質(zhì)靶向信號(hào)（NMTS）重疊的Smad相互作用域（SMID）與R-Smads相互作用[24]。Smad1/5是Runx2的上游調(diào)節(jié)因子[25]，與Runx2共同作用可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞中成骨細(xì)胞特異性基因表達(dá)，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化[26]。目前研究發(fā)現(xiàn)Smad1/5在細(xì)胞成骨的各個(gè)周期都發(fā)揮重要作用，比如骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的成骨、增殖等，并與下游的Runx2產(chǎn)生協(xié)同作用，從而上調(diào)其他成骨關(guān)鍵基因，達(dá)到促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的目[21]。研究表明，Smads在亞核基因座中的定位由Runx2調(diào)節(jié)激活，亞核結(jié)構(gòu)域中的Smads與Runx2形成共調(diào)節(jié)復(fù)合物以調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[24]。Smad/Runx2復(fù)合物誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化[27]，并調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞中RANKL的表達(dá)[20]?？紤]到抑制這種轉(zhuǎn)錄因子作為調(diào)節(jié)事件上游的治療策略的潛力，這有助于治療機(jī)制復(fù)雜的骨轉(zhuǎn)移。

4.3 黃芪補(bǔ)腎活血湯上調(diào)Runx2表達(dá)發(fā)揮腫瘤抑制作用并促進(jìn)新骨形成

Runx2是屬于Runx家族的成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子，在骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨分化過程中表達(dá)相對(duì)較早，是成骨過程中最具特異性的基因。Runx2的表達(dá)往往標(biāo)志著成骨分化的開始，通過調(diào)控成骨基因的轉(zhuǎn)錄來影響成骨細(xì)胞的成熟水平[28]。Runx2促進(jìn)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞成骨分化，促進(jìn)骨骼發(fā)育和促進(jìn)骨再生，但同時(shí)也對(duì)骨髓間充質(zhì)細(xì)胞的遷移也有一定的影響。Runx2是一種在成骨中起主要作用的轉(zhuǎn)錄因子，但也在人類乳腺癌中表達(dá)，可以使乳腺癌細(xì)胞與骨微環(huán)境相互作用[29]。在ER陽性乳腺癌中，Runx2顯示出腫瘤抑制特性，這與其在三陰性乳腺癌中的作用相反[30]。在某些細(xì)胞中，已知Runx2在乳腺癌期間會(huì)被雌激素抑制，否則會(huì)作為抗轉(zhuǎn)移因子發(fā)揮作用[31]。骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞釋放骨微環(huán)境蛋白并由Runx2控制的骨代謝的典型細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，在缺氧下的骨轉(zhuǎn)移細(xì)胞中可以觀察到Runx2下調(diào)[32]。根據(jù)以往的研究報(bào)道，有許多成骨相關(guān)基因在骨再生過程中起關(guān)鍵作用，Runx2就是其中之一[33]。Runx2可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖和由未連接的間充質(zhì)細(xì)胞組成的凝聚細(xì)胞層的骨形成[34]，并通過Wnt和轉(zhuǎn)錄因子的相互調(diào)節(jié)發(fā)揮多種功能[35]。

4.4 黃芪補(bǔ)腎活血湯下調(diào)Osterix表達(dá)抑制乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移

Osterix（OSX）是一種鋅指轉(zhuǎn)錄因子，可以通過增加S100A4基因的表達(dá)來促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移和腫瘤血管生成，這表明Osterix參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，并可能作為乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。在轉(zhuǎn)移級(jí)聯(lián)反應(yīng)的早期和晚期通過上調(diào)Osterix蛋白來促進(jìn)乳腺癌的骨轉(zhuǎn)移。Osterix上調(diào)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，對(duì)總生存期有負(fù)面影響。通過敲低Osterix下調(diào)參與侵襲、血管生成和骨溶解的相關(guān)蛋白可以抑制乳腺癌的侵襲和溶骨性轉(zhuǎn)移[36]。

目前，針對(duì)乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的藥物和治療主要集中在抑制乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，關(guān)于骨轉(zhuǎn)移后的新骨形成和骨骼重塑等方面仍缺乏針對(duì)性的有效藥物。本研究通過體外實(shí)驗(yàn)探索經(jīng)典方加減的黃芪補(bǔ)腎活血湯基于HIF1α-Smad/Runx2/Osterix信號(hào)軸抑制乳腺癌轉(zhuǎn)移及促進(jìn)新骨形成、骨骼重塑的潛在機(jī)制，論證了補(bǔ)腎活血法治療腎虛血瘀型乳腺癌骨轉(zhuǎn)移患者的可行性，期望可以為乳腺癌骨轉(zhuǎn)移治療提供新的治療靶點(diǎn)和思路，未來將通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床證據(jù)進(jìn)一步證明黃芪補(bǔ)腎活血湯治療乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的確切療效。