缺氧微環(huán)境下仙連解毒方通過調(diào)控HIF-1α影響結(jié)直腸癌細(xì)胞遷移的作用及機(jī)制研究＊

姜瑞陽 ，徐長亮 ，2，程海波 ，2＊＊，沈衛(wèi)星 ，2，余成濤 ，2，譚佳妮 ，2，范旻旻 ，2

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院 南京 210023；2.江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心 南京 210023）

結(jié)直腸癌（CRC）是消化道最常見的惡性腫瘤之一，具有發(fā)病率高、死亡率高、預(yù)后差等特點(diǎn)[1]。在過去的十年里，由于早癌篩查、手術(shù)及治療水平的提高，CRC的存活率有所上升，但轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（Metastatic colorectal cancer）的預(yù)后較差，5年生存率在10%以下，主要由于術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移所致[2]。因此，探究結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子生物學(xué)機(jī)制至關(guān)重要。

在結(jié)直腸癌進(jìn)展至轉(zhuǎn)移的過程中，癌細(xì)胞被認(rèn)為獲得了間充質(zhì)表型，使其能夠離開原發(fā)部位，侵入周圍組織，并遷移到遠(yuǎn)端臟器組織[3]。接種后，這些細(xì)胞轉(zhuǎn)換回上皮表型并增殖形成轉(zhuǎn)移瘤，細(xì)胞在上皮和間充質(zhì)表型之間轉(zhuǎn)換的過程被稱為上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）[4]。低氧是多數(shù)實(shí)體瘤微環(huán)境的特征之一，在腫瘤細(xì)胞的血管形成、治療耐藥、細(xì)胞增殖等方面至關(guān)重要[5]。缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1α）是一種控制血管生成基因表達(dá)的高度保守的轉(zhuǎn)錄因子，通過激活轉(zhuǎn)錄程序，觸發(fā)關(guān)鍵基因如血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（GLUT1）等表達(dá)，從而促進(jìn)侵襲性腫瘤表型[6-7]。HIF介導(dǎo)的通路被認(rèn)為是缺氧誘導(dǎo)的EMT中最重要的通路之一，在早期的研究中，HIF-1α與肝纖維化過程中肝細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）的激活有關(guān)，TGF-β還可以抑制PHD2的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，從而增加HIF-1α的穩(wěn)定性[8-9]。此外，HIF-1α與腫瘤細(xì)胞中免疫抑制分子的表達(dá)有關(guān)，這可以通過激活TGF-β信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)EMT進(jìn)程[10]。

國醫(yī)大師周仲瑛教授首倡癌毒病機(jī)理論，癌毒病機(jī)理論認(rèn)為正氣虧虛，癌毒隨血脈流竄走注是癌癥轉(zhuǎn)移之因。因此確立“扶正培本、抗癌解毒”為惡性腫瘤的主要治法[11]，仙連解毒方是岐黃學(xué)者程海波教授基于“癌毒”病機(jī)理論創(chuàng)制的臨床驗(yàn)方，方由仙鶴草、黃連、炙黃芪、生薏苡仁等藥物組成，具有“清熱化濕、祛瘀解毒、健脾益氣”之功。本研究旨在探究缺氧微環(huán)境下仙連解毒方對結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116遷移能力的影響，并進(jìn)一步探究仙連解毒方調(diào)控HIF-1α，抑制TGF-β/smad信號通路，改善EMT的可能機(jī)制，以期為仙連解毒方治療轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌（Metastatic colorectal cancer）提供現(xiàn)代分子生物學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株

人結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116購自中科院上海細(xì)胞所。

1.2 藥品

仙連解毒方（仙鶴草12 g，黃連5 g，生薏苡仁30 g等）由南京中醫(yī)藥大學(xué)藥理教研室負(fù)責(zé)藥材鑒定與復(fù)方制備。以10倍和8倍體積的水煎煮兩次，每次2 h，減壓濃縮，水滴醇沉后抽濾濃縮至3 mg·mL-1，保存于-20℃?zhèn)溆?。處理?xì)胞前，將藥物置于4℃解凍并離心（9600r·min-1，10 min），取上清液并用0.22 μm濾膜過濾除菌。加入仙連解毒方后將培養(yǎng)基pH值調(diào)整至7.2-7.4。

1.3 試劑與儀器

厭氧細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司，HERAcell 150i）；熒光倒置顯微鏡（日本Nikon公司，ECLIPSE Ti-5）；ProwerPacTM Basic 凝膠電泳儀（美國Bio-Rad公司）；Tanon-5500化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀器（天能科技有限公司）。RPMI-1640培養(yǎng)基（上海源培生物技術(shù)有限公司，貨號：L210KJ）；胎牛血清（美國Gibco公司，貨號：10099-141C）；（MTT，Sigma公司，貨號：SP1080）；RIPA細(xì)胞裂解液（Biosharp公司，貨號：6503595）；PAGE凝膠快速制備試劑盒（翌圣生物科技股份有限公司，貨號：20325ES），ECL化學(xué)發(fā)光超敏顯色試劑盒（翌圣生物科技股份有限公司，貨號：36222）；SYBR?Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit II（湖南艾科瑞生物，貨號：AG11702）Evo M-MLV Mix Kit with gDNA Clean for qPCR試劑盒（湖南艾科瑞生物，貨號：AG11728）；過表達(dá)慢病毒構(gòu)建（吉凱基因，訂單號：GXDL0244356）；Beta-Tubulin抗體（美國abcam公司，貨號：6046）、HIF-1α抗體（美國abcam公司，貨號：ab179483）、E-cadherin抗體（美國Santa Cruz公司，貨號：sc-8426）、N-cadherin抗體（美國Santa Cruz公司，貨號：sc-59987）、Vimentin抗體（美國abacm公司，貨號：ab92547）、p-Smad3抗體（美國abcam公司，貨號：ab52903）、Smad3抗體（美國CST公司，貨號：9523）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HCT-116細(xì)胞用RPMI-1640高糖培養(yǎng)基（培養(yǎng)基含10% FBS，100 U/mL青霉素及100 U/mL鏈霉素）培養(yǎng)，將細(xì)胞置于缺氧培養(yǎng)箱（該培養(yǎng)箱內(nèi)條件為95%N2和5% CO2，O2濃度維持在1%以下）中，以實(shí)現(xiàn)缺氧條件。

2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

取對數(shù)生長期的HCT-116細(xì)胞, 消化處理后配置細(xì)胞懸液并計數(shù)，取5×104個/孔細(xì)胞密度接種到24孔板上，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。細(xì)胞轉(zhuǎn)染前，更換孔內(nèi)培養(yǎng)基為含HitransG P的完全培養(yǎng)基（1∶24的比例稀釋HitransG P），24孔板每孔500 μL。據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果以MOI=100加入病毒，孵育12 h后棄掉上層轉(zhuǎn)染液，加入含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)。并根據(jù)細(xì)胞生長情況及時更換培養(yǎng)基，在培養(yǎng)72 h后，可在熒光顯微鏡下檢測細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率。

2.3 細(xì)胞形態(tài)觀察

將處于對數(shù)生長期的結(jié)腸癌細(xì)胞用胰酶消化后接種到培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后分別加入濃度為1.7 mg·mL-1、3.4 mg·mL-1、6.8 mg·mL-1的 XLJDF 醇提物，置于缺氧培養(yǎng)箱中，孵育48 h，倒置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2.4 MTT法檢測細(xì)胞活力

取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板，濃度為每毫升1×104個，每孔100 μL，并設(shè)立6個復(fù)孔，待細(xì)胞貼壁后加入XLJDF醇提物置于缺氧培養(yǎng)箱中48 h。藥物干預(yù)結(jié)束后，每孔加入20 μL MTT（5 mg·mL-1）試劑后繼續(xù)培養(yǎng)3 h。反應(yīng)結(jié)束后，吸取孔內(nèi)培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μL，用酶標(biāo)儀檢測490 nm波長處的吸光度（OD值），計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=1-（藥物處理組-空白組）/（對照組-空白組）×100%。

2.5 傷口愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell法檢測細(xì)胞遷移能力

傷口愈合實(shí)驗(yàn)：將細(xì)胞接種在6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為4 × 105個，置于缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞幾乎達(dá)到100%融合，使用10 μL槍頭在培養(yǎng)板底部劃線，使用PBS洗滌1-2次以去除細(xì)胞殘渣并添加不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基。然后在0 h、24 h和48 h的時間點(diǎn)觀察細(xì)胞并拍照。

Transwell實(shí)驗(yàn)：在上室加入200 μL無血清培養(yǎng)基懸浮的細(xì)胞，數(shù)量為3×104個，下室加入600 μL含10%FBS的完全培養(yǎng)基。細(xì)胞在缺氧培養(yǎng)箱中孵育48 h。4%多聚甲醛固定后，用結(jié)晶紫染料染色。使用棉簽輕輕去除內(nèi)室上的細(xì)胞。隨機(jī)選擇三個視野，使用光學(xué)顯微鏡拍照并計數(shù)。

2.6 qRT-PCR檢測基因mRNA的表達(dá)

收集HCT16細(xì)胞，TRIzol法提取樣品中的總RNA，測定RNA濃度后，使用Evo M-MLV RT Mix Kit with gDNA Clean for qPCR（AG11728，ACCURATE BIOTECHNOLOGY，HUNAN,Co.,Ltd）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，使用SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit（AG11701，ACCURATE BIOTECHNOLOGY，HUNAN,Co.,Ltd）進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。HIF-1α以betaactin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算HIF-1α的表達(dá)。所需引物序列如下： HIF-1α F：5'-GAACGTCGAAAAGA AAAGTCTCG-3'， R：5'-CCTTATCAAGATGCGAACTC ACA-3'；β-actin F：5'-TTTGTCAACCCTCAATCCCA-3'，R：5'-GCAACACTCAGTAACCTCCCAC-3'。

2.7 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測蛋白表達(dá)

取對數(shù)生長期的結(jié)腸癌HCT-116細(xì)胞，在缺氧環(huán)境下予仙連解毒方干預(yù)48 h后提取包漿總蛋白。每孔上樣量為20 μL進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白（80 V），接著將蛋白轉(zhuǎn)移至 PVDF膜（200 mA，90 min），5%脫脂牛奶于室溫下封閉2 h。然后將膜與特異性一抗4℃孵育過夜。將膜用PBST洗滌3次，與二抗（PBST稀釋，稀釋倍數(shù)為1∶10000）室溫孵育1 h。最后用PBST洗膜3次，通過化學(xué)發(fā)光檢測蛋白質(zhì)表達(dá)水平，Image J軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。

2.8 統(tǒng)計學(xué)分析

統(tǒng)計學(xué)處理使用Graph Pad Prism 8.0軟件，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 HIF-1α在缺氧CRC細(xì)胞中高表達(dá)

圖1 HIF-1α在缺氧CRC細(xì)胞HCT-116中高表達(dá)（，n=3）

缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）是一種由缺氧激活的轉(zhuǎn)錄因子，HIF-1由α和β兩個亞基組成[12]，HIF-1α亞基可受氧濃度調(diào)節(jié)，其表達(dá)與缺氧程度呈正相關(guān)[13]。基于此，研究結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116在常氧、缺氧條件下分別培養(yǎng)6 h、12 h、24 h，細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白的表達(dá)情況，Western blot結(jié)果顯示，與常氧組相比，缺氧條件下細(xì)胞內(nèi)HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）。與缺氧干預(yù)6 h組相比，缺氧干預(yù)12 h和24 h HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），呈時間依賴性。見圖1。

表1 仙連解毒方對缺氧CRC細(xì)胞活力的影響（，n=3）

表1 仙連解毒方對缺氧CRC細(xì)胞活力的影響（，n=3）

注：與空白對照組相比，1)P＜0.05，2)P＜0.01。

組別空白時間48 h濃度/mg·mL-1 IC50/mg·mL-1仙連解毒方48 h 0 2 4 6 8 1 0 6.75±0.93 12 14 16存活率/%100±4.82 95.99±1.842）70.99±2.512）68.81±4.082）58.98±5.412）53.75±3.072）37.75±1.292）30.00±1.481）29.34±0.761）

3.2 仙連解毒方對缺氧CRC細(xì)胞活力的影響

MTT結(jié)果示：缺氧培養(yǎng)箱XLJDF干預(yù)48 h后，在2、4、6、8、10、12、14、16 mg·mL-1濃度下均可抑制缺氧HCT-116細(xì)胞活力（P＜0.05或P＜0.01），IC50=6.75 mg·mL-1，因此選用低、中、高濃度分別為1.7 mg·mL-1、3.4 mg·mL-1、6.8 mg·mL-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見表1。

3.3 仙連解毒方對缺氧CRC細(xì)胞形態(tài)的影響

如鏡下所示：空白對照組HCT-116細(xì)胞生長良好，形態(tài)舒展，輪廓清晰規(guī)則，呈多邊形分布，細(xì)胞間有相互重疊、連接生長，密度較大。給藥后細(xì)胞形態(tài)變尖，部分細(xì)胞變圓皺縮，細(xì)胞密度降低，漂浮細(xì)胞數(shù)量增多。隨著藥物濃度的增加變化較為顯著。見圖2。

圖2 仙連解毒方對缺氧CRC細(xì)胞HCT-116細(xì)胞形態(tài)的影響

圖3 仙連解毒方對HCT-116細(xì)胞遷移的影響

3.4 仙連解毒方在體外抑制缺氧CRC細(xì)胞遷移

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)示（圖3A、3B），與對照組相比，XLJDF各濃度組干預(yù)48 h后，細(xì)胞遷移率顯著減弱（P＜0.05或P＜0.01），Transwell遷移實(shí)驗(yàn)示（圖 3C、3D），與對照組相比，XLJDF給藥組細(xì)胞遷移到下室的數(shù)量明顯減少（P＜0.05或P＜0.01）。

3.5 仙連解毒方調(diào)控CRC細(xì)胞的EMT

已有研究證明，缺氧通過HIF-1α上調(diào)E-鈣粘蛋白（E-cadherin）的轉(zhuǎn)錄抑制因子，誘導(dǎo)EMT，促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展及轉(zhuǎn)移[14]。在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步研究以驗(yàn)證XLJDF是否能夠通過調(diào)節(jié)HIF-1α，影響EMT進(jìn)程，從而抑制CRC轉(zhuǎn)移。Western blot檢測結(jié)果顯示，與缺氧空白對照組相比，XLJDF低、中、高濃度給藥組能顯著抑制HIF-1α、N-鈣粘蛋白（N-cadherin）的蛋白表達(dá)水平，升高E-鈣粘蛋白（E-cadherin）的表達(dá)水平，（P＜0.05或P＜0.01）；XLJDF中、高劑量組能降低波形蛋白Vimentin的蛋白表達(dá)水平（P＜0.05）。這些結(jié)果表明，XLJDF抑制了CRC細(xì)胞轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與抑制HIF-1α，改善缺氧微環(huán)境，逆轉(zhuǎn)EMT過程有關(guān)。見圖4。

3.6 仙連解毒方通過抑制HIF-1α的表達(dá)抑制缺氧CRC細(xì)胞遷移

3.6.1 HIF-1α過表達(dá)細(xì)胞株的構(gòu)建

基因名稱：HIF1A(NM_001530)，物種：Human，載體名稱：GV358，元件順序：Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin。載體圖譜見圖5A。RT-PCR（圖5B）和Western blot（圖5C、5D）結(jié)果顯示，與空載體組相比，HIF-1α過表達(dá)組細(xì)胞HIF-1α mRNA和蛋白表達(dá)均顯著上調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）。

3.6.2 XLJDF減弱HIF-1α過表達(dá)細(xì)胞的遷移能力

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)（圖5E、圖5F）和Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)（圖5G、圖5H）結(jié)果顯示，與空載體組相比，HIF-1α過表達(dá)組細(xì)胞傷口愈合速率和遷移到下室的細(xì)胞數(shù)顯著上調(diào)（P＜0.05），與HIF-1α過表達(dá)組對比，XLJDF+HIF-1α組細(xì)胞遷移速率和遷移到下室的細(xì)胞數(shù)均降低（P＜0.05）。提示XLJDF逆轉(zhuǎn)了上調(diào)的HIF-1α在促進(jìn)HCT-116細(xì)胞遷移中的作用。

3.7 仙連解毒方對TGF-β/smad信號通路的影響

Western blot檢測結(jié)果顯示，與空白對照組相比，XLJDF各濃度干預(yù)后，HCT-116細(xì)胞內(nèi)TGF-β、p-Smad3/Smad3的比值顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01），XLJDF高濃度組干預(yù)后Smad3表達(dá)量降低（P＜0.05），中、低濃度組表達(dá)無明顯改變（P＞0.05）。見圖6。

圖4 缺氧微環(huán)境下仙連解毒方對EMT過程的影響

圖5 仙連解毒方通過抑制HIF-1α的表達(dá)抑制HCT-116細(xì)胞遷移

圖6 仙連解毒方對TGF-β/smad通路相關(guān)蛋白的影響

4 討論

目前，中醫(yī)對于腫瘤轉(zhuǎn)移的病機(jī)理論研究尚不成熟。郭子瑗等[15]認(rèn)為三焦形質(zhì)異常是腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素，張玉人[16]認(rèn)為“伏毒”學(xué)說與腫瘤轉(zhuǎn)移的病機(jī)聯(lián)系緊密。腫瘤中晚期，人體臟腑功能減退，氣血陰陽失調(diào)，正氣虧虛，而癌毒日盛，突破正氣束縛，隨經(jīng)絡(luò)、血脈等流竄走注，并于最虛之處停積，形成腫瘤的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移?！鞍┒尽辈C(jī)理論認(rèn)為，“正氣虧虛，癌毒流注”是腫瘤轉(zhuǎn)移的基本病機(jī)，從而確立了“扶正培本，抗癌解毒”為防治腫瘤轉(zhuǎn)移的主要治法[17]。

上皮細(xì)胞通常被定義為具有分泌功能的表面屏障細(xì)胞，顯示出由粘附和緊密連接建立的不同頂端與基底外側(cè)極化。間充質(zhì)細(xì)胞具有“錨定”功能，通常具有更高的“流動性”，在組織修復(fù)和傷口愈合中起重要作用。胚胎發(fā)育過程中，分化的極化上皮細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞外信號，發(fā)生形態(tài)的改變，統(tǒng)稱為EMT，癌癥發(fā)展過程中的EMT促使腫瘤細(xì)胞更具侵襲性表型。在分子水平上，EMT的顯著特點(diǎn)是上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-鈣粘蛋白（E-cadherin）下調(diào)，間充質(zhì)標(biāo)志物如N-鈣粘蛋白（N-cadherin）上調(diào)[18-19]。

缺氧是實(shí)體瘤微環(huán)境的特征之一，缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）的表達(dá)增加是其標(biāo)志之一。在正常組織中，氧分壓為通常為10-80 mmHg，而腫瘤組織中通常包含嚴(yán)重缺氧（＜0.5 mmHg）和中度缺氧（0.5-20 mmHg）的低氧濃度區(qū)域，這與腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥、放射抗性、不良預(yù)后密切相關(guān)[20]。缺氧可穩(wěn)定誘導(dǎo)HIF-1α，已知HIF-1α介導(dǎo)TGF-β1依賴性途徑，而TGF-β是EMT的廣泛誘導(dǎo)劑[21]。TGF-β信號傳導(dǎo)在細(xì)胞形態(tài)改變、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、再生和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[22]。癌細(xì)胞來源的TGF-β可以通過觸發(fā)血管生成、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）系統(tǒng)來促進(jìn)腫瘤生長，從而促進(jìn)ECM降解[23]。有文獻(xiàn)報道[24-25]，TGF-β信號傳導(dǎo)促進(jìn)了促腫瘤微環(huán)境的生成，Smad3是經(jīng)典TGF-β信號通路的關(guān)鍵介質(zhì)，在TGF-β1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用[26]。

本研究通過缺氧培養(yǎng)條件下的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，探討仙連解毒方抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116遷移的有效性及可能機(jī)制。用MTT比色法驗(yàn)證仙連解毒方醇提物對缺氧條件下HCT-116細(xì)胞活性的抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）。已有廣泛研究表明，缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α在缺氧CRC中高表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116在缺氧條件下干預(yù)6 h、12 h、24 h時細(xì)胞內(nèi)HIF-1α的蛋白表達(dá)情況，缺氧組HIF-1α蛋白表達(dá)水平顯著高于常氧組，且24 h內(nèi)隨時間的延長而增加（P＜0.05或P＜0.01）。傷口愈合實(shí)驗(yàn)和Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了仙連解毒方醇提物對缺氧CRC細(xì)胞遷移能力的影響，遷移能力隨作用時間的延長而增加（P＜0.05或P＜0.01）；EMT在結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中意義重大，因此推測仙連解毒方是否通過EMT過程影響缺氧CRC細(xì)胞遷移能力，通過Western blot實(shí)驗(yàn)檢測EMT相關(guān)的關(guān)鍵指標(biāo)——E-cadherin、N-cadherin、Vimentin，結(jié)果示缺氧條件下仙連解毒方可以逆轉(zhuǎn)EMT進(jìn)程。構(gòu)建HIF-1α過表達(dá)細(xì)胞株，通過Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和傷口愈合實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HIF-1α過表達(dá)增強(qiáng)了缺氧HCT16細(xì)胞的遷移能力，接著給予XLJDF中劑量（3.4 mg·mL-1）組干預(yù)，逆轉(zhuǎn)了這一過程。缺氧條件下TGF-β/smad通路與EMT密切相關(guān)，因此用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測TGF-β/smad通路相關(guān)蛋白，結(jié)果提示仙連解毒方可以抑制TGF-β/smad信號通路。

課題組前期采用中藥復(fù)方含藥血清[27]及水滴醇沉劑[28-29]，在體外初步探討仙連解毒方的作用及機(jī)制。長期以來，中藥復(fù)方細(xì)胞實(shí)驗(yàn)給藥方法在學(xué)術(shù)界存在爭議，本實(shí)驗(yàn)采用水滴醇沉法給藥，也具有一定局限性。Huang等[30-31]采用含藥血清去蛋白離體方法學(xué)進(jìn)行中藥復(fù)方離體實(shí)驗(yàn)，減少粗制劑中金屬離子、雜質(zhì)等對結(jié)果的影響，消除了氧化應(yīng)激源H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞對藥物體外假陽性反應(yīng)，具有廣泛借鑒意義。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，我們將進(jìn)一步開展實(shí)驗(yàn)研究，不斷完善給藥方式，深入探討仙連解毒方抑制結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制。

綜上，XLJDF通過調(diào)控 HIF-1α，抑制 TGF-β/smad信號通路，影響EMT進(jìn)程，從而在體外抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。