β-葡聚糖酶降解黑木耳多糖工藝研究

吳迪，王旭升，于特，曹慧馨，趙競(jìng)，吳瓊*

（1.長春大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，吉林 長春 130022；2.長春市十一高中，吉林 長春 130000）

黑木耳（Auricularia auricula）又稱為黑菜、桑耳，木耳科木耳屬真菌[1]，是一種具有價(jià)值的食用菌[2]，其中的黑木耳多糖具有抗腫瘤、抗凝血、抗氧化、降血脂、降血糖等多種生物活性[3]。但天然的黑木耳多糖分子量大、形成的溶液黏度較大[4-5]，不利于黑木耳多糖的進(jìn)一步開發(fā)及利用，因此，將高分子量的黑木耳多糖降解成低分子量且溶解黏度小的酶解多糖[6]，對(duì)黑木耳多糖的應(yīng)用具有重要意義。研究表明，酶解后多糖的生物活性會(huì)得到明顯的提高[7]，多糖酶解主要是通過改變多糖的分子結(jié)構(gòu)、分子質(zhì)量、溶解度及取代基的種類、數(shù)量以實(shí)現(xiàn)其理化性質(zhì)的改變、生物活性的增強(qiáng)等效果[8-9]。

黑木耳多糖主要由水溶性β-D-葡聚糖、水不溶性β-D-葡聚糖和2種酸性雜多糖構(gòu)成[10-11]，且兩種β-D-葡聚糖都是由β-1，3-糖苷鍵連接而成。β-葡聚糖酶（β-glucanase） 是可降解 β-1，3-糖苷鍵、β-1，4-糖苷鍵的水解酶，可使多糖改性增溶[12-13]，基于此，本試驗(yàn)將β-葡聚糖酶作為外源酶酶解黑木耳多糖，并通過調(diào)節(jié)加酶量、酶解pH值、酶解時(shí)間和酶解溫度進(jìn)行試驗(yàn)，降低黑木耳多糖的分子量[14]，得到最佳降解效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑木耳：市售；氫氧化鈉、檸檬酸：北京化工廠；3-5二硝基水楊酸：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；β-葡聚糖酶（20 000 U/g）：河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；溴化鉀：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（SPD-20A）：島津儀器（蘇州）有限公司；紅外光譜儀（NICOLET iS5）：賽默飛世爾科技有限公司；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S）：鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；醫(yī)用離心機(jī)（3K15）：曦瑪離心機(jī)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 黑木耳多糖的提取

稱取黑木耳粉末40 g，采用水提醇沉法對(duì)黑木耳多糖進(jìn)行提取[15-16]，以料液比 1∶10（g/mL）加入 80%的乙醇溶液，70℃下浸提2次，每次2 h，將濾渣60℃烘干，以料液比1∶30（g/mL）稱取濾渣并加入蒸餾水，90℃下浸提2次，每次4 h，3 500 r/min離心20 min得上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至原體積的1/4，所得的濃縮溶液即為黑木耳粗多糖。向濃縮溶液中加入三氯乙酸，4℃冰箱中靜置24 h，4 000 r/min離心20 min得黑木耳多糖[17]，加入4倍體積的無水乙醇，將其放入4℃冰箱中靜置24 h，8 000 r/min離心20 min，所得沉淀凍干，得黑木耳多糖[18]。

1.3.2 黑木耳多糖的降解

取100 mL 10 mg/mL黑木耳多糖溶液，通過添加檸檬酸或 NaOH 調(diào)節(jié)酶解 pH 值 4.4、4.8、5.2、5.6、6.0，按加酶量 300、500、700 、900、1 100 U/g分別添加至配制好的多糖溶液中，在酶解溫度 10、20、30、40、50℃，酶解時(shí)間 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h 下，測(cè)定篩選最佳反應(yīng)條件。

在最佳工藝條件下制備黑木耳酶解多糖，通過添加檸檬酸或NaOH將黑木耳多糖溶液的pH值調(diào)至5.2，按加酶量700 U/g加入β-葡聚糖酶，置于30℃恒溫振蕩水槽中反應(yīng)2 h，反應(yīng)后沸水浴10 min滅活β-葡聚糖酶，6 000 r/min離心5 min，加入4倍體積無水乙醇，將其放入4℃冰箱中靜置24 h，8 000 r/min離心20 min，所得沉淀凍干，得黑木耳酶解多糖。

1.3.3 還原糖生成量測(cè)定

量取0.5 mL離心后的上清液放入試管中，加入1.5 mL二硝基水楊酸試劑，沸水浴5 min，加蒸餾水定容至10 mL。于540 nm處測(cè)定吸光度，3次平行試驗(yàn)，通過下式計(jì)算還原糖生成量。

1.3.4 溶解率的測(cè)定

取酶解前后的黑木耳多糖10 mg于EP管中，充分溶解，在8 000 r/min離心10 min，除去上清液，在50℃下烘至完全干燥，稱重，通過下式計(jì)算溶解率。

1.3.5 多糖的結(jié)構(gòu)分析

1.3.5.1 分子量測(cè)定

將樣品配制成5 mg/mL的溶液，0.22 μm微孔濾膜過濾后取20 μL溶液進(jìn)樣。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品分子量。采用高效液相色譜對(duì)酶解前后黑木耳多糖的分子量進(jìn)行測(cè)定，分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 分子量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve for molecular weight determination

以RID-10A示差折射檢測(cè)器，不銹鋼色譜柱7.8 mm×300 mm，柱溫為35℃，流動(dòng)相為超純水，流速為0.5 mL/min，分子量標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，以標(biāo)準(zhǔn)葡聚糖的分子量對(duì)數(shù)（lgMw）為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線 y=-0.191 4x+0.951 8，R2=0.995 4。

1.3.5.2 紅外光譜測(cè)定

在相對(duì)干燥環(huán)境下，取1 mg樣品與0.18 g溴化鉀混合研磨均勻，壓片，在波段400 cm-1～4 000 cm-1處進(jìn)行紅外光譜掃描[19]，檢測(cè)樣品中是否存在多糖的特征吸收峰。

1.3.5.3 紫外-可見光譜分析

用去離子水配制濃度為0.3 mg/mL的β-葡聚糖酶解黑木耳多糖溶液，以去離子水作為空白對(duì)照，在200 nm～800 nm內(nèi)進(jìn)行紫外全波段掃描，檢測(cè)樣品中是否具有核酸和蛋白質(zhì)的特征吸收峰。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 加酶量對(duì)還原糖生成量的影響

加酶量對(duì)還原糖生成量的影響如圖2所示。

圖2 加酶量對(duì)黑木耳多糖降解效率的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on the degradation efficiency of Auricularia auricula polysaccharide

還原糖生成量隨加酶量增加先增大后減小，這是由于當(dāng)加酶量大于一定值后，底物被充分利用，還原糖生成量不再增多，如果繼續(xù)增加β-葡聚糖酶的量會(huì)導(dǎo)致酶之間出現(xiàn)相互附著的情況，降低了酶與底物之間的作用效果，導(dǎo)致酶不能更好地分解黑木耳多糖，因此，在以還原糖的生成量為參考指標(biāo)時(shí)，最適加酶量在300 U/g～700 U/g。

2.1.2 酶解pH值對(duì)還原糖生成量的影響

酶解pH值對(duì)還原糖生成量的影響如圖3所示。

圖3 酶解pH值對(duì)黑木耳多糖降解效率的影響Fig.3 Effect of pH value on the degradation efficiency of Auricularia auricula polysaccharide

還原糖生成量會(huì)根據(jù)pH值的不同而變化，pH值過高或過低時(shí)還原糖生成量都較低，這是由于在多糖溶液中pH值大于或小于β-葡聚糖酶的最適pH值時(shí)，酶的活性被抑制，導(dǎo)致β-葡聚糖酶對(duì)黑木耳多糖分子的催化作用變?nèi)?，因此影響了?葡聚糖對(duì)黑木耳多糖的降解效率。因此，酶解最適pH值在4.8～5.6。

2.1.3 酶解時(shí)間對(duì)還原糖生成量的影響

酶解時(shí)間對(duì)還原糖生成量的影響如圖4所示。

圖4 酶解時(shí)間對(duì)黑木耳多糖降解效率的影響Fig.4 Effect of enzymolysis time on the degradation efficiency of Auricularia auricula polysaccharide

還原糖生成量隨著酶解時(shí)間的增加先增大后趨于平緩，這是因?yàn)殡S著酶解時(shí)間的延長，底物的多糖溶液在β-葡聚糖酶的作用下不斷減少，在2 h后底物被完全利用，曲線開始呈現(xiàn)平滑趨勢(shì)，因此，確定最佳酶解時(shí)間在2 h～3 h。

2.1.4 酶解溫度對(duì)還原糖生成量的影響

酶解溫度對(duì)還原糖生成量的影響如圖5所示。

圖5 酶解溫度對(duì)黑木耳多糖降解效率的影響Fig.5 Effect of enzymolysis temperature on the degradation efficiency of Auricularia auricula polysaccharide

還原糖的生成量隨著溫度的升高，先上升后下降，這是由于在30℃之前，隨著溫度的升高，黑木耳多糖分子以及β-葡聚糖酶分子之間的運(yùn)動(dòng)速度加快，相互接觸的機(jī)會(huì)增大[20]，使得反應(yīng)速率加快，因此曲線呈快速上升的趨勢(shì)，在30℃時(shí)達(dá)到最大值；當(dāng)反應(yīng)溫度大于30℃時(shí)，β-葡聚糖酶由于吸收了過多熱量，自身化學(xué)鍵不穩(wěn)定[21]，發(fā)生斷裂，最終導(dǎo)致酶活性降低甚至喪失，黑木耳多糖的降解效率也隨之降低，因此，最適酶解溫度在25℃～35℃。

2.2 正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)結(jié)果為依據(jù)，設(shè)計(jì)以加酶量、酶解pH值、酶解時(shí)間、酶解溫度的正交試驗(yàn)。各因素水平設(shè)置如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Orthogonal experimental design

極差分析結(jié)果表明，對(duì)β-葡聚糖酶活力影響的主次順序：加酶量＞酶解pH值＞酶解時(shí)間＞酶解溫度，最佳酶解條件為加酶量700 U/g，酶解pH值5.2，酶解時(shí)間2h，酶解溫度30℃，即最優(yōu)參數(shù)組合為A3B3C2D1。通過驗(yàn)證試驗(yàn)，在最佳條件下，還原糖生成量為42.64 mg/g，證實(shí)正交試驗(yàn)結(jié)果可信。

2.3 溶解率

酶解前后黑木耳多糖干物質(zhì)重分別為0.026 6、0.0243g，酶解前后黑木耳多糖的溶解率分別為37.96%、41.56%，酶解前后黑木耳多糖溶解率提高了3.6%。

2.4 分子量分析

酶解前后黑木耳多糖分子量圖譜如圖6所示。

圖6 酶解前后黑木耳多糖分子量圖譜Fig.6 Molecular weight map of Auricularia auricula polysaccharide before and after enzymolysis

由圖6可知，采用凝膠色譜法測(cè)定各標(biāo)準(zhǔn)樣品的保留時(shí)間與分子量之間的關(guān)系，由圖6可知，黑木耳多糖及其酶解多糖的保留時(shí)間分別是9.823、13.209 min，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出其分子量分別為131 300、3 388 Da，分析結(jié)果表明，酶解后黑木耳多糖保留時(shí)間延后，酶解前后分子量降低了127 912 Da，說明酶解對(duì)多糖分子量的降低具有很好的作用。

2.5 紅外光譜分析

紅外光譜掃描結(jié)果如圖7所示。

圖7 酶解多糖的紅外光譜圖Fig.7 Infrared spectrum of enzymolysis polysaccharide

由圖7可知，黑木耳酶解多糖在3 404、2 929、1 729、1 622、1 375、1 250、1 038 cm-1的附近存在吸收峰，在3 404 cm-1處的強(qiáng)吸收是-OH的伸縮振動(dòng)峰，在2 929 cm-1處的峰是CH3和-CH2-中C-H鍵的伸縮振動(dòng)峰[22]，1 375 cm-1處的吸收峰為C-H鍵的變角振動(dòng)，其與C-H的伸縮振動(dòng)構(gòu)成了糖環(huán)的吸收[23]，1 729 cm-1處的吸收峰表明多糖中含有糖醛酸，1 622 cm-1處的吸收峰是分子內(nèi)氫鍵的特征峰[24]，在1 250 cm-1處的振動(dòng)是由于O-H的拉伸和振動(dòng)造成的，可以推斷，黑木耳酶解多糖具有多糖的特征吸收峰[25]。

2.6 紫外-可見光譜分析結(jié)果

紫外光譜掃描結(jié)果如圖8所示。

圖8 酶解前后黑木耳多糖的紫外全波段掃描圖Fig.8 UV scanning of Auricularia auricula polysaccharide before and after enzymolysis

由圖8可知，最大吸收峰比較集中，黑木耳多糖的成分較為單一，吸收峰主要在250 mm～280 nm，說明酶解前后的黑木耳多糖可能含有少量的蛋白質(zhì)或核酸等成分[26-27]。

3 結(jié)論

本研究以水提醇沉法提取黑木耳多糖，并用β-葡聚糖酶酶解，得酶解最佳條件，即在加酶量700 U/g、酶解pH值5.2、酶解時(shí)間2 h、酶解溫度30℃的條件下，得到的還原糖生成量為42.64 mg/g，并對(duì)酶解前后樣品的溶解率、分子量、紅外光譜以及紫外全光譜進(jìn)行測(cè)定，對(duì)黑木耳多糖酶解前后的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，酶解前后黑木耳多糖的溶解率分別37.96%、41.56%，酶解后溶解率提高了3.6%，說明酶解使黑木耳多糖的溶解率得到提高；酶解前后的黑木耳多糖分子量分別為131 300、3 388 Da，酶解后分子量降低了127 912 Da，表明酶解有效降低了黑木耳多糖的分子量；通過FTIR分析發(fā)現(xiàn)，酶解前后黑木耳多糖的主要吸收峰沒有變化，說明酶解對(duì)黑木耳多糖的主要結(jié)構(gòu)沒有影響。研究表明，將黑木耳多糖從高分子量降低成低分子量，可以提高其生物活性，并且低分子多糖更易被人體吸收，因此，本項(xiàng)研究對(duì)黑木耳多糖降解工藝的研究具有一定的推動(dòng)作用。