連續(xù)重復超數(shù)排卵、沖胚對引進品種肉羊快速擴繁的效果研究

岳永莉，包花拉，莫德日樂吐，李雪玲，王建國

（1.內蒙古大學/省部共建草食家畜生殖調控與繁育國家重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010070；2.內蒙古樂科生物技術有限公司，內蒙古 呼和浩特 010020）

內蒙古地區(qū)的肉羊生產(chǎn)處于全國領先水平，2020 年肉羊存欄量、產(chǎn)肉量均位列全國之首。 內蒙古地區(qū)的肉羊絕大多數(shù)具有蒙古羊血統(tǒng)，在不同的地理環(huán)境中逐漸形成了各具特色的烏珠穆沁羊、蘇尼特羊、烏冉克羊等優(yōu)質肉羊品種，21 世紀初將引進品種與當?shù)孛晒叛螂s交分別育成了巴美肉羊和昭烏達肉羊［1-2］。為了加快利用引進品種改良本地品種的生長速度及改善產(chǎn)肉性能等性狀，以超數(shù)排卵與胚胎移植技術（multiple ovulation and embryo transfer，MOET）為核心的現(xiàn)代生物繁育技術的產(chǎn)業(yè)化集成應用是一條高效途徑，并已成為良種擴繁和瀕危物種保護的有力輔助工具［3-4］。

現(xiàn)代生物繁育技術的基礎是超數(shù)排卵 （超排），通過對動物注射外源性促性腺激素以收獲更多的胚胎。 影響超排的因素分為動物因素和環(huán)境因素，動物因素主要包括個體的遺傳特性（品種）、年齡、生理狀態(tài)、營養(yǎng)狀況等，環(huán)境因素則包括外源性激素（質量、用量、方案）、季節(jié)、連續(xù)處理的間隔等［5-6］。 例如，大齡母羊的超排反應和胚胎產(chǎn)量顯著高于年輕母羊［7-8］。 熱暴露和營養(yǎng)不足的雙重作用引起母羊胚胎產(chǎn)量下降和大卵泡（無排卵）數(shù)量增加等應激反應［9］。 母羊重復超排間隔過短則導致回收總胚數(shù)減少［10］。因此，超排供體要選擇體況佳、營養(yǎng)狀況好、性成熟的母羊，連續(xù)超排時要選擇適合品種的超排方案、季節(jié)、時間間隔，這樣才能獲得理想的超排效果。

激素方案的優(yōu)化是改善超排及妊娠結果的重要途徑［5，11-12］。 在同期發(fā)情處理中，使用“醋酸甲羥孕酮+雌二醇”可以減少卵巢反應和處理結果的不穩(wěn)定性［13］； 若配以間隔注射2 劑前列腺素（prostaglandin，PG）（間隔12～16 d）后56 h 進行人工輸精，則有利于提高母羊的妊娠率［14］。常規(guī)的促排卵激素方案以促卵泡生成素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）遞減注射為主，有研究發(fā)現(xiàn)在同等FSH 劑量下增加注射次數(shù)， 可獲得更好的超排效果［15］。 另有報道稱為了促進同步排卵和增加排卵率，可以使用促性腺激素釋放激素（gonadotropinreleasing hormone，GnRH）+馬絨毛膜促性腺激素（equinechorionicgonadotropin，eCG）的激素方案［16-17］。此外，超排處理中使用褪黑激素對胚胎數(shù)量、質量和妊娠率也有積極影響［18］。

為了解引進品種肉羊的繁殖特性， 該研究對5 個進口品種母羊進行連續(xù)超排沖胚操作， 對比分析品種、 季節(jié)、 重復超排次數(shù)對胚胎生產(chǎn)的影響， 以期為合理安排生產(chǎn)及科學利用引進品種肉羊提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗時間及地點

該試驗于2016—2018 年在位于內蒙古呼和浩特市托克托縣的內蒙古樂科生物技術有限公司下屬羊場進行。

1.2 試驗材料

1.2.1 試驗動物

選取從澳大利亞引進的、 利用冷凍胚胎移植技術生產(chǎn)的純種母羊1 575 只， 包括澳洲白 （n=230）、白頭杜泊（n=228）、黑頭杜泊（n=541）、白頭薩?？耍╪=200）、黑頭薩?？耍╪=376）5 個品種。 所選母羊的年齡為1～4 歲，體況健康。種公羊是同品種的15～36 月齡的健康個體。

1.2.2 藥品及試劑

孕酮海綿栓以及FSH、 孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）、PG、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）等激素均購自寧波三生生物科技有限公司。 Holding 液購自新西蘭ICPbio 公司。

1.3 試驗方法

1.3.1同期發(fā)情和超排處理

將在母羊陰道放置孕酮海綿栓的當天記為0 d， 從第10 天的19：00 開始每隔12 h 劑量遞減注射FSH（總劑量330～450 IU），共計6 次。首次注射75 IU FSH 的同時注射200～300 IU PMSG，然后第5 次注射FSH 的同時撤栓， 并注射0.1 mg PG。至少間隔30 d 再進行下一次同期發(fā)情和超排處理。 試驗方案見圖1。

圖1 試驗方案

1.3.2 人工授精和沖胚

撤栓24 h 后試情，發(fā)情母羊在撤栓36 h 后進行腹腔內窺鏡輸精， 每只羊的每側子宮角輸精量為1∶5 稀釋后的新鮮采集精液0.20～0.25 mL（約含1.5 億個精子）， 輸精同時再靜脈注射一針150～280 IU LH。 輸精后第6 天手術打開腹腔，選擇卵巢上有排卵點的一側取出子宮角， 于子宮角基部穿透子宮壁送入沖胚管， 注入空氣待氣囊充盈至緊密貼合子宮內壁后， 用套管針插入子宮角的尖端推注預熱的沖卵液PBS（每側20 mL/次），從沖胚管端回收胚胎于集卵皿的Holding 液中，體視鏡下觀察胚胎狀態(tài)并記錄胚胎總數(shù)、胚胎等級（A 級和B 級為可用胚）和未受精卵的數(shù)量。

1.3.3 胚胎冷凍和胚胎移植

大部分優(yōu)質胚胎參考文獻［19］中的方法進行了玻璃化冷凍。另有少部分胚胎進行了鮮胚移植。取同步進行同期發(fā)情處理的受體母羊， 手術打開腹腔，觀察卵巢上的黃體發(fā)育情況，在有黃體一側的輸卵管內放入1～2 枚胚胎， 移植后45～50 d，采用B-型超聲波孕檢并記錄妊娠情況。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用GraghPad Prism 8.0 軟件的One-Way ANOVA 方法進行分析，應用Tukey 法進行多重比較，P＜0.05 認為有顯著差異。

2 結果與分析

2.1 同期發(fā)情和胚胎生產(chǎn)情況

2.1.1 小規(guī)模同期發(fā)情處理情況

2016 年統(tǒng)計的同期發(fā)情結果顯示 （見表1），春季母羊發(fā)情率為92.5%（124 只/134 只），秋季母羊發(fā)情率為94.9%（129 只/136 只），證明同期發(fā)情方案可以用于繁殖季節(jié)和非繁殖季節(jié)的超排處理。

表1 小規(guī)模同期發(fā)情處理結果

2.1.2 小規(guī)模重復超排沖胚的可用胚回收情況

在前期小規(guī)模重復超排沖胚試驗中，20 只同期發(fā)情處理后的供體有17 只對超排處理有反應。由表2 可知，在間隔30 d 的2 次重復超排沖胚試驗中， 初次處理平均每只羊獲得9.6 枚可用胚（164 枚/17 只）， 第2 次處理后獲得5.7 枚可用胚（97 枚/17 只），合計收獲15.3 枚可用胚（261 枚/17只）。 該結果證明間隔30 d 的重復超排沖胚試驗方案可行。

表2 小規(guī)模重復超排沖胚的可用胚回收結果

2.1.3 大規(guī)模重復超排沖胚試驗總體情況

隨后開展了大規(guī)模連續(xù)超排沖胚試驗，主要集中于2017 年（從1 320 只母羊上獲得可用胚10 720 枚）。 在整個試驗期內，該研究從5 個品種共1 575 只母羊回收18 496 枚胚胎，其中，14 971枚胚胎是質量屬A 級或B 級的可用胚（見表3）。

有720 只母羊（45.7%）由于生理條件或手術后粘連等原因只進行了1 次超排處理， 共獲得3 905 枚胚胎，包含3 129 枚可用胚，占可用胚總數(shù)的20.9%；有838 只母羊（53.2%）進行了2～5 次超排，共獲得13 894 枚胚胎，包含11 276 枚可用胚， 占可用胚總數(shù)的75.3%； 另外17 只母羊（1.1%）進行了6～7 次超排，共獲得697 枚胚胎，包含566 枚可用胚，占可用胚總數(shù)的3.8%。

有1 只白頭薩?？搜蚝? 只黑頭薩?？搜蜻M行了多達7 次的超排處理，共獲得107 枚胚胎，包含91 枚可用胚。 最高紀錄是1 只黑頭薩?？搜颍M行了5 次超排，獲得83 枚胚胎，包含81 枚可用胚，它也創(chuàng)造了單次排卵紀錄——27 枚。

在此超排方案下， 從只均總胚數(shù)和只均可用胚數(shù)看（見表3），胚胎生產(chǎn)能力的順序為白頭薩?？耍壑痪偱邤?shù)為6.1 枚/（只·次），只均可用胚數(shù)為5.1 枚/（只·次）］＞黑頭薩福克［只均總胚數(shù)為5.9 枚/（只·次），只均可用胚數(shù)為4.8 枚/（只·次）］＞黑頭杜泊［只均總胚數(shù)為5.8 枚/（只·次），只均可用胚數(shù)為4.5 枚/（只·次）］＞澳洲白［只均總胚數(shù)為5.2 枚/（只·次），只均可用胚數(shù)為4.3 枚/（只·次）］＞白頭杜泊［只均總胚數(shù)為4.6 枚/（只·次），只均可用胚數(shù)為3.7 枚/（只·次）］。 白頭杜泊的只均總胚數(shù)顯著（P＜0.05）低于其他4 個品種，白頭薩?？撕秃陬^薩?？说闹痪偱邤?shù)顯著（P＜0.05）高于澳洲白；白頭杜泊的只均可用胚數(shù)顯著（P＜0.05）低于白頭薩?？?、黑頭薩福克、黑頭杜泊，白頭薩?？说闹痪捎门邤?shù)顯著（P＜0.05）高于澳洲白。

表3 大規(guī)模重復超排沖胚試驗總體結果（2016—2018 年）

有效超排比例（單次生產(chǎn)胚胎≥5 枚）也顯示相同的規(guī)律： 白頭薩?？?（59.7%）＞黑頭薩福克（53.5%）＞黑頭杜泊（51.8%）＞澳洲白（47.3%）＞白頭杜泊（41.5%）。但是不同品種的平均可用胚數(shù)占總胚數(shù)的比例為75%～80%， 其中， 澳洲白最高（79.6%），黑頭杜泊最低（75.0%）。

2.2 不同品種重復超排沖胚效果比較

從重復超排的只均總胚數(shù)和只均可用胚數(shù)結果看（見表4）， 除了白頭杜泊第2 次超排比第1次超排有一定的下降， 其他品種的前2 次超排結果差異不大。之后隨著超排次數(shù)的增加，每個品種的只均總胚數(shù)和只均可用胚數(shù)持續(xù)上升， 除了白頭杜泊因為樣本量的關系以上2 個指標只持續(xù)上升至第4 次處理， 其他品種的數(shù)據(jù)均持續(xù)上升至第5 次處理后。 超排5 次以上則由于樣本量的減少導致數(shù)據(jù)變異性增大。

表4 不同品種的重復超排沖胚結果（2016—2018 年）

從品種間差異看，在第1 次超排處理中，白頭薩?？撕秃陬^杜泊的只均總胚數(shù)顯著（P＜0.05）高于白頭杜泊，5 個品種的只均可用胚數(shù)無顯著（P＞0.05）差異；在第2 次超排處理中，黑頭杜泊、白頭薩?？?、黑頭薩?？说闹痪偱邤?shù)顯著（P＜0.05）高于白頭杜泊， 白頭薩?？撕秃陬^薩福克的只均可用胚數(shù)顯著（P＜0.05）高于白頭杜泊；第3～5 次超排處理中，5 個品種的只均總胚數(shù)和只均可用胚數(shù)均無顯著（P＞0.05）差異。

2.3 季節(jié)對不同品種超排沖胚的影響

按照胚胎回收時的月份記錄分析不同季節(jié)的超排沖胚結果（見表5、表6）。澳洲白在春季（2—4月）表現(xiàn)出最好的超排沖胚效果，在春季的只均總胚數(shù)和只均可用胚數(shù)均高于夏季（P＞0.05）、秋季（P＜0.05）、冬季（P＞0.05）；3 月的超排沖胚效果最好，只均總胚數(shù)為6.2 枚/（只·次），只均可用胚數(shù)為5.1 枚/（只·次）。

表5 不同季節(jié)的胚胎回收情況（2016—2018 年）

表6 不同月份的胚胎回收情況（2016—2018 年）

其余4 個品種總體上均表現(xiàn)出冬季（11 月至次年1 月）的超排沖胚效果最好，但是品種間有差異。 白頭杜泊冬季的只均總胚數(shù)和只均可用胚數(shù)均高于春季（P＞0.05）、夏季（P＜0.05）、秋季（P＜0.05）；11 月和12 月的超排沖胚效果最好，二者的只均總胚數(shù)和只均可用胚數(shù)基本相同。 黑頭杜泊在冬季的只均總胚數(shù)高于春季（P＞0.05）、夏季（P＞0.05）、秋季（P＜0.05），只均可用胚數(shù)高于夏季（P＞0.05）、秋季（P＜0.05）；12 月的超排沖胚效果最好。白頭薩?？嗽诙镜闹痪偱邤?shù)高于春季 （P＞0.05）、夏季（P＞0.05）、秋季（P＜0.05），只均可用胚數(shù)也高于春季（P＜0.05）、夏季（P＞0.05）、秋季（P＜0.05）；1 月的超排沖胚效果最好， 只均總胚數(shù)為7.5 枚/（只·次），只均可用胚數(shù)為6.9 枚/（只·次）。黑頭薩?？硕镜闹痪偱邤?shù)高于春季 （P＜0.05）、夏季（P＞0.05）、秋季（P＜0.05），只均可用胚數(shù)也高于春季（P＜0.05）、夏季（P＜0.05）、秋季（P＜0.05）；12 月的超排沖胚效果最好， 只均總胚數(shù)為8.7 枚/（只·次），只均可用胚數(shù)為7.6 枚/（只·次）。

白頭杜泊在夏季（主要是5 月）進行超排處理后胚胎回收的情況雖然最差，但是樣本量較?。?5只），除5 月外胚胎回收情況較差的是9 月。 其余4 個品種均表現(xiàn)出秋季的超排沖胚效果最差：澳洲白、 黑頭杜泊和黑頭薩?？说闹痪偱邤?shù)和只均可用胚數(shù)在9 月均為最低值， 白頭薩?？藙t是10 月最低。

2.4 胚胎冷凍和胚胎移植結果

2016—2018 年回收的14 971 枚可用胚胎，先后冷凍11 048 枚。 另有3 923 枚胚胎移植到同期發(fā)情處理后的受體母羊，B-型超聲波孕檢顯示有2 737 只懷孕， 受胎率為69.8%（2 737 只/3 923枚），懷孕到期產(chǎn)羔2 552 只，產(chǎn)羔率93.2%（2 552只/2 737 只）（見表7）。

表7 胚胎移植及受胎、產(chǎn)羔結果

3 討論

在肉羊品種改良領域，MOET 技術是高效生產(chǎn)優(yōu)質羔羊的最佳選擇， 同時可以實現(xiàn)對母羊遺傳資源最大限度的利用。 該研究是對MOET 技術的連續(xù)超排沖胚處理產(chǎn)業(yè)化應用的初步嘗試。 國內外連續(xù)超排沖胚處理絕大多數(shù)在3 次以內，而該研究多達7 次的連續(xù)超排沖胚處理尚屬首次報道。該研究于2016—2018 年選用5 個進口品種純種肉羊作為供體， 從1 575 只母羊回收14 971 枚可用胚胎， 其中，2017 年共處理1 320 只母羊，獲得10 720 枚可用胚胎。 根據(jù)受胎率（69.8%）和產(chǎn)羔率（93.2%），預測1 只母羊1 年內經(jīng)過超排沖胚與胚胎移植可獲得5 只羊羔， 充分驗證了MOET技術產(chǎn)業(yè)化應用的可觀經(jīng)濟效益。

超排是MOET 技術產(chǎn)業(yè)化應用的重要影響因素， 而品種的繁殖特性是影響超排效果的主要內因。 在該研究制定的超排方案下，5 個品種的胚胎生產(chǎn)性能比較結果顯示， 白頭薩?？?、 黑頭薩福克、黑頭杜泊的繁殖性能較好，澳洲白次之，白頭杜泊最差。研究顯示，薩福克羊的這兩個品種的超排沖胚性能是較優(yōu)的。張秀陶等［20］研究表明，與道賽特和特克賽爾羊相比， 白頭薩?？顺藕蟮狞S體數(shù)和可用胚數(shù)是最高的。郭延華等［21］研究表明，黑頭薩?？撕桶最^薩?？说呐咛ドa(chǎn)能力優(yōu)于白頭杜泊和道賽特。 此外，Bergstein-Galan 等［22］的研究證明黑頭杜泊的超排沖胚效果優(yōu)于白頭杜泊。上述研究與該研究均顯示白頭杜泊胚胎生產(chǎn)能力最差，與該品種繼承了美利奴的基因殘余有關［23］。

連續(xù)重復超排沖胚是繁育技術產(chǎn)業(yè)化集成應用提高肉羊養(yǎng)殖效益的關鍵。該研究結果提示，連續(xù)重復超排沖胚過程中只要保證供體羊的規(guī)模，每只羊每次處理后回收的只均總胚數(shù)和可用胚數(shù)能夠持續(xù)增長，至少可以增長到第4 次處理之后。因此， 推斷有部分母羊在多次超排沖胚處理過程中，排卵數(shù)和胚胎數(shù)是增加的。已報道的重復超排研究由于肉羊品種、試驗設計、樣本量等的差異所得結論有所不同。張果平等［24］對17 只杜泊羊連續(xù)3 次超排處理的結果顯示總胚數(shù)和可用胚數(shù)逐漸遞減。 祖爾東·熱合曼等［25］對10 只薩福克羊進行間隔1 年的重復超排處理， 平均排卵率雖無顯著差異， 但第3 年的可用胚數(shù)量顯著低于前兩次。Bruno-Galarraga 等［10］報道了對10 只美利奴肉羊的連續(xù)3 次超排結果， 回收的總胚數(shù)和可用胚數(shù)也都呈現(xiàn)下降趨勢。 但是，吳姣等［26］將30 只小尾寒羊根據(jù)首次超排后的黃體狀態(tài)調整后續(xù)超排的FSH 注射方案，有12 只黃體狀態(tài)正常的母羊連續(xù)3 次超排回收的卵子數(shù)量無顯著差異。 張良［27］統(tǒng)計了77 只不同品種的羊進行2 次超排的結果，第2 次超排的效果好于第1 次。 張帆等［28］對經(jīng)產(chǎn)的30 只黑頭杜泊羊間隔1 年重復超排的試驗結果顯示，第2 次效果略好于第1 次，同時，強調了手術時盡量減少出血點、 適當灌注含林可霉素的生理鹽水避免粘連， 羊只重復超排的效果是可以得到保證的。上述研究與該研究提示，雖然有些母羊由于個體、 術后粘連等原因影響了連續(xù)超排沖胚的效果，但當供體羊群體達到一定規(guī)模時（如20只以上），還是能夠保證重復超排沖胚效果。

重復超排沖胚還受到激素質量、術后粘連、供體年齡等因素的影響。 目前國內普遍采用性價比較高的國產(chǎn)激素替代進口激素［29］，該研究也采用了國產(chǎn)激素，效果是比較穩(wěn)定的。尹啟寶等［30］連續(xù)4 年每年對同一群薩?？四秆蜻M行超排處理，使用國產(chǎn)激素的第3 年較前兩年效果顯著下降，認為是產(chǎn)生了激素免疫而影響了超排效果， 第4 年換用進口激素后效果恢復。 朱芳賢等［31］對蘭州大尾羊分別間隔2 個月和4 個月連續(xù)進行3 次超排，發(fā)現(xiàn)隨著超排次數(shù)的增加，母羊發(fā)生術后粘連的比例增加，粘連程度也加重，從而造成可用胚數(shù)顯著下降。 傅文棟等［32］證明大齡（7～9 歲）薩?？搜蜻M行連續(xù)3 次超排回收的總胚數(shù)和可用胚數(shù)均逐漸下降。

地形地貌、 光照和氣溫等自然環(huán)境條件對母羊的生殖內分泌造成一定影響，超排的月份/季節(jié)對不同地區(qū)、不同品種母羊的影響也有差異。該研究結果顯示，除澳洲白以外，其他品種的超排效果均表現(xiàn)為冬季較好、秋季較差，因此，可根據(jù)每個品種超排效果較好的月份提前安排同期發(fā)情與超排處理，而且最好避開8 月與9 月初處理。筆者所在研究團隊在內蒙古四子王旗開展試驗獲得的黑頭杜泊羊超排沖胚數(shù)據(jù)也顯示10—12 月的效果顯著優(yōu)于4—6 月［33］。在新疆阿克蘇地區(qū)開展的薩?？搜虺旁囼灲Y果顯示，9 月中旬至10 月中旬的效果好于前后2 個月［25］。 在新疆哈密地區(qū)開展的薩?？搜虺旁囼灲Y果顯示，12 月的效果好于4 月［34］。 黑頭薩福克羊在甘肅隴東地區(qū)的超排處理效果在9 月比3 月更好［35］。在該研究中，秋季超排效果較差的原因可能是處于繁殖期的卵巢在激素處理前就已存在大卵泡， 抑制了母羊對外源FSH 的反應［36］。

超排效果不穩(wěn)定始終是阻礙其產(chǎn)業(yè)化應用的瓶頸問題。排除術后粘連或者卵巢過大、傘部硬化等情況，在相同超排條件下，群體中仍有部分母羊對超排處理無反應、不排卵，這很可能與個體遺傳差異或個體對激素刺激的敏感性差異有關。 研究顯示體重因素和包括HOX 基因家族在內的11 個基因對薩?？搜虻某沤Y果存在影響［6，37］。 此外，該研究中還有少部分個體出現(xiàn)了在數(shù)次成功超排處理中有1 次無反應的現(xiàn)象。因此，利用技術手段提前預測超排效果是提高其產(chǎn)業(yè)化應用效率的發(fā)展趨勢，例如，通過前一次同期發(fā)情處理后卵泡波中的卵泡數(shù)量預測下一次的超排反應效果［38］；利用直腸卵巢超聲波觀察排卵后的黃體數(shù)目， 提前評估超排效果，避免不必要的沖胚手術［39］。趙冰茹等［40-41］研究發(fā)現(xiàn)，回收胚胎數(shù)與超排前1 天外周血血清中的蛋白質濃度呈負相關， 與FSH、LH、AMH 激素的濃度呈正相關， 從而推導出回歸模型，可對胚胎回收數(shù)進行預測評估。利用非手術手段進行預測， 對于提高母羊超排沖胚效果以及提升動物福利水平具有重要意義。

4 結論

大規(guī)模母羊連續(xù)超排沖胚試驗中， 在半數(shù)母羊進行了2 次以上超排的情況下，獲得了接近10倍于供體數(shù)目的可用胚胎， 當供體數(shù)量達到一定規(guī)模（如20 只以上）時，每只母羊回收的只均總胚數(shù)和可用胚數(shù)基本保持持續(xù)增長趨勢。 在供體母羊的營養(yǎng)管理到位、避免術后粘連的情況下，全年連續(xù)進行超排沖胚處理是可行的。 該種技術模式有利于提高優(yōu)質、純種母羊的利用效率，從而縮短肉羊養(yǎng)殖的資金回報周期。