間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)揮抗菌作用的機(jī)制研究進(jìn)展

李曉奇，王鳳武，韓健健

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.通遼市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000）

抗菌藥物耐藥性 （antimicrobial resistance，AMR） 是當(dāng)今社會(huì)受到廣泛關(guān)注的公共衛(wèi)生安全問題。 AMR 是由抗菌藥物濫用或低劑量持續(xù)使用引起的［1］。 近幾年，美國(guó)獸醫(yī)協(xié)會(huì)、歐洲獸醫(yī)聯(lián)合會(huì)發(fā)布了關(guān)于合理使用抗菌藥物的聯(lián)合聲明以及獸用抗菌劑使用指南。此外，世界各地的許多機(jī)構(gòu)正在努力減少抗菌藥物的總體使用量。 研發(fā)和設(shè)計(jì)替代抗生素的生物制劑治療病原微生物感染是當(dāng)前臨床的迫切需要。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）在再生醫(yī)學(xué)中被作為工程組織的原材料或作為治療炎癥疾病的免疫調(diào)節(jié)劑［2］。最近研究表明，MSCs已顯示出作為解決AMR 的問題的潛力。 MSCs 具有抗菌特性， 能夠分泌與病原體直接作用的抗菌分子以及增強(qiáng)宿主免疫細(xì)胞抗菌活性的因子［3-4］。研究證明，MSCs 與現(xiàn)有的抗菌藥物治療方法顯示出強(qiáng)大的協(xié)同作用，可以作為抗菌、抗病毒及抗寄生蟲藥物的替代物。MSCs 在體外和體內(nèi)均表現(xiàn)出一定的抗菌作用。 因供體物種和目標(biāo)細(xì)菌種類不同，關(guān)于MSCs 的抗菌作用，研究文獻(xiàn)中涉及許多不同的機(jī)制［5］。 此外， 其他因素會(huì)進(jìn)一步影響MSCs 表型。 研究人員采用多種預(yù)處理方法，包括缺氧、血清剝奪和暴露于拮抗物質(zhì)，以提高M(jìn)SCs分化或調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的能力。 目前研究主要通過MSCs 接觸細(xì)胞因子、目標(biāo)細(xì)菌、細(xì)菌成分、維生素和抗菌藥物探究其促進(jìn)抗菌活性的條件， 從而改善其直接和間接的抗菌效果［6］。如果MSCs 的抗菌特性可以轉(zhuǎn)化為可行的治療選擇， 它們就可以取代目前用于動(dòng)物的大部分抗菌藥物。筆者對(duì)MSCs影響細(xì)菌存活的作用機(jī)制以及抗菌藥物可能對(duì)MSCs 功能產(chǎn)生的影響等方面的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為進(jìn)一步闡明MSCs 抗菌作用機(jī)制、挖掘MSCs 作為治療細(xì)菌感染性疾病新方法的潛力提供參考。

1 MSCs 抗菌作用的直接機(jī)制

1.1 MSCs 分泌抗菌肽發(fā)揮抗菌作用

抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是MSCs發(fā)揮抗菌功效的關(guān)鍵組成部分。AMPs 是成簇共表達(dá)的短氨基酸鏈，對(duì)細(xì)菌、酵母菌、真菌和癌細(xì)胞具有天然防御功能。 目前存在超過1 200 種已知的AMPs， 它們由從原核生物到高等動(dòng)物的生物體產(chǎn)生。 AMPs 主要通過破壞微生物細(xì)胞膜殺滅微生物。此外，AMPs 還能調(diào)節(jié)宿主先天免疫細(xì)胞功能， 對(duì)微生物入侵進(jìn)行防御。 已鑒定出幾種AMPs 由MSCs分泌，主要有導(dǎo)管素（cathelicidins）、β-防御素（β-defensin）、 脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2 （lipocalin2） 以及吲哚胺2，3-雙加氧酶（indoleamine 2，3-dioxygenase，IDO）。

導(dǎo)管素是一個(gè)主要的AMPs 家族， 在先天免疫中具有突出的作用。 導(dǎo)管素會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞膜破壞和細(xì)胞裂解［7］。導(dǎo)管素LL-37 與MSCs 對(duì)細(xì)菌的直接殺傷作用有關(guān)［8］。LL-37 具有殺菌特性以及在膿毒癥模型中降低細(xì)胞因子和內(nèi)毒素水平的能力。 研究顯示LL-37 對(duì)體內(nèi)外MSCs 抗菌活性至關(guān)重要。 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)， 脂肪來源的MSCs 的LL-37 活性依賴于1，25-二羥基VD3。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，相對(duì)于MSCs，1，25-二羥基VD3補(bǔ)充劑增強(qiáng)了LL-37 的產(chǎn)生， 而用VD 受體抑制劑處理會(huì)使抗菌反應(yīng)無效。 同種異體小鼠MSCs 的體內(nèi)研究也表明導(dǎo)管素是殺死細(xì)菌的關(guān)鍵AMPs 之一［9］。導(dǎo)管素通過TLR2/4-IRAK4 依賴性途徑起作用，以建立有效殺死分枝桿菌的方法［10］，但是，結(jié)核分枝桿菌已經(jīng)產(chǎn)生一種生存機(jī)制， 可以通過下調(diào)CAMP 基因表達(dá)破壞該途徑， 并抑制骨髓來源MSCs 的抗菌作用。

β-防御素是富含半胱氨酸的陽(yáng)離子蛋白，大小從18 到145 個(gè)氨基酸不等。這些分子在細(xì)菌細(xì)胞膜中形成孔，導(dǎo)致細(xì)菌裂解［11］。 在人源MSCs 的研究中并不總是能夠檢測(cè)到β-防御素。 研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 暴露于銅綠假單胞菌、 金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌后不存在β-防御素2 或β-防御素3，所有殺菌作用歸因于LL-37 的釋放。相反，Sung等［12］在銅綠假單胞菌刺激和未刺激的MSCs 中鑒定出了人類β-防御素2。其他研究人員通過TLR-4 信號(hào)傳導(dǎo)從人源MSCs 中發(fā)現(xiàn)β-防御素分泌是大腸桿菌暴露后旁分泌體外抗菌作用的關(guān)鍵機(jī)制。 研究還顯示在小鼠模型中經(jīng)大腸桿菌處理的MSCs 可分泌類似的β-防御素。在奶牛中，除NK-賴氨酸外，β-防御素4A（bBD-4A）的AMPs 相關(guān)基因（NK1）表達(dá)在胎兒MSCs 中被發(fā)現(xiàn)，但未發(fā)現(xiàn)導(dǎo)管素2、鐵調(diào)素和IDO 的基因表達(dá)［13］。 MSCs 與金黃色葡萄球菌共培養(yǎng)增加了bBD-4A 和NK1 基因表達(dá)。

脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2 是一種AMPs，通過螯合含鐵載體發(fā)揮作用，剝奪細(xì)菌的鐵質(zhì)并限制其生長(zhǎng)。在革蘭陰性細(xì)菌性肺炎小鼠模型體內(nèi)， 脂質(zhì)運(yùn)載蛋白獲得高表達(dá)。 當(dāng)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2 被阻斷時(shí)，MSCs 的細(xì)菌清除作用消失。脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2 的表達(dá)可以通過利用LPS 和TNFα 激活MSCs 而上調(diào)。研究發(fā)現(xiàn)LPS 刺激可導(dǎo)致MSCs 中脂質(zhì)運(yùn)載蛋白2 的表達(dá)增加［14］。 雖然AMPs 對(duì)MSCs 發(fā)揮抗菌作用很重要，但它們并不是唯一起作用的機(jī)制。

MSCs 中IDO 的表達(dá)參與對(duì)細(xì)菌的反應(yīng)。 IDO的作用是降低局部色氨酸水平， 從而誘導(dǎo)廣譜抗菌活性。 經(jīng)炎性細(xì)胞因子TNFα、IL1β 和IFNγ 刺激的MSCs，其IDO 表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致細(xì)菌生長(zhǎng)減少。單獨(dú)使用TNFα 或IL1β 刺激MSCs 未能限制細(xì)菌生長(zhǎng)，但2 種細(xì)胞因子都上調(diào)了IFNγ 介導(dǎo)的IDO活性。值得注意的是，添加IDO 抑制劑或色氨酸恢復(fù)了細(xì)菌的生長(zhǎng)， 證實(shí)了IDO 是MSCs 發(fā)揮抗菌作用的關(guān)鍵機(jī)制。 體內(nèi)研究尚未發(fā)現(xiàn)小鼠MSCs的IDO 表達(dá)。 由于缺乏IDO，鼠類MSCs 無法抑制金黃色葡萄球菌的細(xì)胞外生長(zhǎng)， 但可有效抑制金黃色葡萄球菌的細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)。 巨細(xì)胞病毒能夠抑制IFN-γ 通路， 所以該病毒感染能夠抑制MSCs對(duì)細(xì)菌和寄生蟲的殺傷能力［15］。 另有研究發(fā)現(xiàn)，IDO 表達(dá)的上調(diào)可以通過暴露于TLR3 激動(dòng)劑poly I:C 實(shí)現(xiàn)［16］。

1.2 MSCs 直接降解細(xì)菌生物膜提高抗菌藥物的效果

生物膜是細(xì)菌產(chǎn)生的聚合物基質(zhì)， 導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)消毒劑、抗菌藥物和免疫細(xì)胞的抵抗力增強(qiáng)。在臨床上， 生物膜使細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐受性提高了100～1 000 倍。 最近研究表明，MSCs 具有分解生物膜的潛力。 MSCs 可通過降解生物膜層和增加抗菌藥物滲透提高常規(guī)抗菌藥物的功效。 Marx等［17］研究了MSCs 條件培養(yǎng)基對(duì)多種細(xì)菌的體外作用，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生物膜形成和菌體生長(zhǎng)受到抑制。 進(jìn)一步研究表明， 在MSCs 條件培養(yǎng)基中檢測(cè)到了半胱氨酸蛋白酶， 發(fā)現(xiàn)其通過減少細(xì)胞外蛋白質(zhì)含量抑制生物膜形成， 并允許常規(guī)抗菌藥物更好地滲透。 這些研究揭示了MSCs 與抗菌藥物聯(lián)合治療細(xì)菌感染性疾病的潛力。

2 MSCs 抗菌作用的間接機(jī)制

2.1 MSCs 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞間接促進(jìn)抗菌作用

MSCs 被證明具有通過旁分泌因子與宿主免疫系統(tǒng)相互作用的能力。 巨噬細(xì)胞是關(guān)鍵的免疫參與者，在組織修復(fù)、體內(nèi)平衡維護(hù)和細(xì)菌自噬中發(fā)揮作用。 此外，巨噬細(xì)胞可被誘導(dǎo)為抗炎M2樣表型或促炎M1 樣表型。研究證實(shí)，受感染組織中激活的同種異體小鼠MSCs 具有誘導(dǎo)M2 樣巨噬細(xì)胞的能力， 而未經(jīng)處理的受感染組織具有M1 樣顯性巨噬細(xì)胞群。 對(duì)細(xì)菌的殺傷作用歸因于MSCs 誘導(dǎo)M1 樣巨噬細(xì)胞表型的能力。 未激活的MSCs 可誘導(dǎo)M1 樣和M2 樣巨噬細(xì)胞的混合群體。 未激活的人源MSCs 能夠以同樣的方式影響巨噬細(xì)胞表型， 在大鼠模型中誘導(dǎo)M2 樣和M1 樣巨噬細(xì)胞的混合群體。 MSCs 通過前列腺素E2（PGE2）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3Ks）對(duì)人巨噬細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)，加強(qiáng)其對(duì)細(xì)菌的有效吞噬作用［18］。研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 與巨噬細(xì)胞接觸可以優(yōu)化線粒體轉(zhuǎn)移， 盡管由于存在外泌體介導(dǎo)的線粒體轉(zhuǎn)移， 但通過細(xì)胞松弛素B 阻斷MSCs 間超細(xì)細(xì)胞質(zhì)橋梁 （TNT） 的形成并沒有完全消除線粒體轉(zhuǎn)移。體內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)，TNT 形成是MSCs 發(fā)揮抗菌功效所必需的，這意味著細(xì)胞接觸依賴性轉(zhuǎn)移是巨噬細(xì)胞極化的關(guān)鍵。 在使用人源MSCs 的嚙齒類動(dòng)物模型中觀察到類似的結(jié)果，MSCs 增強(qiáng)了巨噬細(xì)胞對(duì)大腸桿菌的吞噬作用，并且添加內(nèi)毒素和TNFα 后巨噬細(xì)胞的吞噬活性進(jìn)一步增強(qiáng)。Lee等［19］提出了另一種巨噬細(xì)胞刺激機(jī)制：在離體肺模型的單核細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)同種異體人源MSCs 將角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子（KGF）釋放到人單核細(xì)胞的KGF 受體上，從而增強(qiáng)細(xì)菌清除能力，并減少細(xì)胞凋亡。 其他研究確定了體外MSCs 釋放的高水平趨化因子CCL2 會(huì)誘導(dǎo)炎癥單核細(xì)胞的募集。 與未激活的MSCs 相比， 經(jīng)poly I:C 激活的MSCs 釋放了更高水平的CCL2。

2.2 MSCs 分泌細(xì)胞因子增強(qiáng)免疫細(xì)胞功能

研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 通過分泌IL-6、IL-8 和MIF細(xì)胞因子增強(qiáng)多形核中性粒細(xì)胞（PMN）對(duì)細(xì)菌的攝取。這些分子與中性粒細(xì)胞上的受體CXCR1 和CXCR2 結(jié)合，介導(dǎo)PMN 的募集和激活。 中性粒細(xì)胞還會(huì)產(chǎn)生中性粒細(xì)胞胞外陷阱（NET），這有助于防止細(xì)菌傳播和介導(dǎo)殺傷作用。 Chow 等［20］將未激活的或小鼠模型中的MSCs 與對(duì)照中性粒細(xì)胞相比，發(fā)現(xiàn)與經(jīng)poly I:C 激活的人源MSCs 條件培養(yǎng)基共孵育后，每個(gè)細(xì)胞產(chǎn)生的NET 面積增加。

2.3 MSCs 增強(qiáng)其他免疫細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)特性

MSCs 已被證明可以增強(qiáng)其他免疫細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)特性。 經(jīng)牙齦卟啉單胞菌總蛋白提取物（PgPE）刺激的人牙周膜衍生MSCs（PDLSCs）能夠分泌炎癥標(biāo)志物和趨化因子， 包括RANTES、eotaxin、IFNγ、誘導(dǎo)蛋白10（IP-10）、IL-6、IL-8 和白細(xì)胞介素受體拮抗劑蛋白（IL-1ra）［21］。通過上述研究得出結(jié)論，PDLSCs 是將免疫細(xì)胞募集到受感染組織的關(guān)鍵因素， 而未受刺激的MSCs 分泌的趨化因子水平可忽略。MSCs 暴露于鼠傷寒沙門菌和嗜酸乳桿菌也可導(dǎo)致免疫調(diào)節(jié)基因COX2、IL-6和IL-8 轉(zhuǎn)錄水平提高以及PGE2分泌增加。 除了表達(dá)AMPs，研究人員還發(fā)現(xiàn)感染細(xì)菌后，MSCs 中的免疫調(diào)節(jié)基因MCP-1、IL-6、IL-8 和CCL5 表達(dá)上調(diào)， 表明免疫細(xì)胞募集和激活是MSCs 殺滅微生物的機(jī)制。 研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，MSCs 在暴露于米諾環(huán)素后，其免疫調(diào)節(jié)活性增加。米諾環(huán)素能誘導(dǎo)人源MSCs 中核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）的磷酸化，導(dǎo)致LL-37 含量減少、IL-6 含量增加、 金黃色葡萄球菌負(fù)荷總體凈減少。

3 抗菌藥物對(duì)MSCs 功能的影響

3.1 抗菌藥物對(duì)MSCs 具有抑制作用

抗菌藥物不僅在臨床醫(yī)學(xué)中用于治療細(xì)菌感染性疾病， 還用于預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)的微生物污染。 抗菌藥物可以在培養(yǎng)過程中對(duì)MSCs 產(chǎn)生影響， 甚至在使用抗菌藥物治療后對(duì)局部組織細(xì)胞也有影響。因此，MSCs 對(duì)細(xì)菌感染性疾病的治療效果可能會(huì)受到一些抗菌藥物的影響。研究發(fā)現(xiàn)， 不同類別的抗菌藥物對(duì)不同來源的MSCs有顯著影響?？蒲腥藛T對(duì)氨基糖苷類藥物是否對(duì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)具有負(fù)面作用進(jìn)行了研究。當(dāng)以劑量依賴性方式與慶大霉素一起培養(yǎng)時(shí)，人源MSCs 的成骨和軟骨形成顯著減少；當(dāng)藥物濃度大于2 000 μg/mL 時(shí)， 在被其他氨基糖苷類藥物處理的成骨細(xì)胞中也觀察到了這一點(diǎn)， 例如妥布霉素和阿米卡星。在馬源MSCs 中，慶大霉素對(duì)體外細(xì)胞活力沒有影響，但在較高濃度（500 μg/mL）時(shí)降低了總RNA 水平，即蛋白質(zhì)表達(dá)受到了不同程度的抑制。在同一研究中，氟喹諾酮類藥物（如恩諾沙星）也導(dǎo)致MSCs活力和總RNA 水平顯著降低。 兩性霉素等抗生素會(huì)在培養(yǎng)24 h 內(nèi)影響MSCs 的生長(zhǎng)和分化［22］，在使用氯霉素時(shí)也觀察到了這種情況。

3.2 抗菌藥物對(duì)MSCs 具有促分化作用

盡管許多抗菌藥物對(duì)MSCs 具有抑制作用，但也有一些抗菌藥物可以增強(qiáng)MSCs 分化。 四環(huán)素類藥物， 如強(qiáng)力霉素， 被證明可以增強(qiáng)人源MSCs 的軟骨形成和分化，這在體內(nèi)研究中得到了進(jìn)一步證實(shí)。此外，土霉素可促進(jìn)前軟骨細(xì)胞系中的軟骨分化，以劑量依賴性方式促進(jìn)軟骨形成。桿菌肽等多肽類抗生素以劑量依賴性方式增強(qiáng)人源MSCs 的成骨分化， 并上調(diào)成骨基因表達(dá)水平［23］。與對(duì)照和經(jīng)青霉素—鏈霉素處理的MSCs 相比，經(jīng)兩性霉素B（AmB）和AmB-Cu 處理的MSCs 在存在成骨誘導(dǎo)因子（包括地塞米松、β-甘油磷酸和抗壞血酸）的情況下成骨。

3.3 抗菌藥物對(duì)MSCs 免疫調(diào)節(jié)作用的影響

抗菌藥物也被證明有可能誘導(dǎo)MSCs 的免疫調(diào)節(jié)作用。 在經(jīng)米諾環(huán)素處理的人源MSCs 中觀察到了這一點(diǎn)，這種效應(yīng)在后期開展的一項(xiàng)體內(nèi)研究中也得到證實(shí)。 在大鼠傷口模型中，與單獨(dú)使用水凝膠相比，載有米諾環(huán)素的水凝膠增強(qiáng)了培養(yǎng)體系中人源MSCs 的傷口愈合表型。 500 μg/mL 以上的頭孢噻呋等頭孢菌素類抗菌藥物會(huì)導(dǎo)致MSCs 的總RNA 減少，提示毒性作用。 在同一項(xiàng)研究中，不同濃度的青霉素總體上對(duì)MSCs 沒有顯著影響。

青霉素—鏈霉素的組合經(jīng)常用于細(xì)胞培養(yǎng)以避免污染，包括旨在研究MSCs 抗菌作用的試驗(yàn)。盡管假設(shè)二者對(duì)細(xì)胞的影響可以忽略不計(jì)， 但已證明青霉素—鏈霉素會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞基因表達(dá)、 細(xì)胞調(diào)節(jié)和細(xì)胞生長(zhǎng)速率發(fā)生顯著變化。 這種影響可以直接干擾細(xì)胞對(duì)體外不同刺激的反應(yīng)， 從而影響試驗(yàn)結(jié)果［24］。

4 小結(jié)與展望

在原理驗(yàn)證研究和小型臨床案例研究中，MSCs 在治療感染性疾病方面顯示出一定的潛在功效，因此，有必要進(jìn)一步挖掘利用MSCs 替代或改善當(dāng)前抗菌藥物療法的潛力。MSCs 通過多種機(jī)制發(fā)揮抗菌作用，包括分泌AMPs、提升宿主免疫系統(tǒng)功能和促進(jìn)免疫細(xì)胞直接吞噬作用。MSCs 可以成為一種臨床上重要的廣譜抗菌劑， 能夠單獨(dú)有效地控制多重耐藥（MDR）菌株引起的感染，或者更有可能與常規(guī)抗菌藥物聯(lián)合使用。MSCs 有可能減少動(dòng)物抗菌藥物的使用量并降低動(dòng)物源細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生和擴(kuò)散，這對(duì)人類健康也很重要。由于獸醫(yī)領(lǐng)域關(guān)于MSCs 的研究才剛剛出現(xiàn)， 還有許多研究問題需要解決。