綿羊肺炎支原體分子致病機理研究進展

戴伶俐，王 娜，張 帆，宋 越，白 帆，劉 威，楊 斌，趙世華，張月梅

（內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031）

支原體（Mycoplasma）是介于細菌和病毒的原核微生物，無細胞壁成分，具有較強的吸附能力和延展性，能通過細菌濾器，并且能在體外無細胞條件下生長繁殖［1］。 支原體種類眾多，包括肺炎支原體、無乳支原體、解脲支原體等。 肺炎支原體常引起慢性、持續(xù)性感染，難以清除。 綿羊肺炎支原體（Mycoplasma ovipneumoniae，MO）是引起綿羊和山羊傳染性肺炎的主要病原體， 患病羊臨床表現(xiàn)為咳嗽、流涕、氣喘、漸進性消瘦以及肺臟間質(zhì)增生性炎癥，常呈隱蔽性、持續(xù)性感染。 羊支原體肺炎是高度接觸性傳染病， 通過空氣飛沫傳播進入宿主機體，經(jīng)黏附作用定植于呼吸道黏膜［2］，造成持續(xù)性感染， 羔羊尤為易感， 發(fā)病率和死亡率較高，患病羔羊肺臟呈典型的胸膜肺炎病變，肺臟炎性滲出增加，肺臟與心包膜、膈膜、胸腔壁內(nèi)膜粘連，肺臟病灶萎縮呈暗紅色，伴有呼吸道支氣管炎癥狀［3］。 支原體能夠抑制宿主免疫系統(tǒng)，降低天然免疫細胞殺傷能力，使外周T 淋巴細胞、B 淋巴細胞數(shù)量減少，使之逃避免疫系統(tǒng)監(jiān)控和清除［4-6］，因此，MO 感染成年羊常呈現(xiàn)慢性經(jīng)過［7］。 妊娠期、哺乳期母羊感染MO，呈現(xiàn)持續(xù)性混合感染，造成羔羊感染率上升，增加羔羊發(fā)病率和死亡率［8］，MO使成年羊持續(xù)性感染、羔羊病死率增加［9］，嚴重影響羊生產(chǎn)性能， 造成較為嚴重的經(jīng)濟損失，MO 引起的綿羊支原體肺炎是影響?zhàn)B羊業(yè)健康發(fā)展的重要呼吸道疫病。 因此，深入了解MO 的致病機制，是研發(fā)有效疫苗、 檢測方法、 治療藥物的重要前提。隨著養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)的不斷發(fā)展，對該病的重視程度越來越高，近年來，在致病機理方面的研究取得一定進展。 筆者對MO 分子致病機制研究進展進行綜述，以期為后續(xù)深入研究MO 致病機制、開發(fā)新型防控技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 MO 黏附呼吸道上皮細胞的分子機制

肺炎支原體入侵宿主的第一步是黏附［2］。 位于支原體頂端的黏附素或黏附因子是支原體的主要毒力因子。 關(guān)于人肺炎支原體和豬肺炎支原體黏附呼吸道上皮細胞的分子機制， 已經(jīng)進行了大量的研究和驗證工作。 研究表明，P1 和P30 蛋白是人肺炎支原體主要的黏附因子， 也是最早研究的、作用機制比較明確的黏附因子［10］。對于動物肺炎支原體， 豬肺炎支原體的研究相對較早也較為廣泛和深入。 研究發(fā)現(xiàn)，P97 蛋白首先被證明是豬肺炎支原體的主要黏附因子［11］。隨后，P102、P146、P216 蛋白都被證明與黏附相關(guān)，由此可見，支原體對呼吸道上皮細胞的黏附并不是由某個單一蛋白完成，而是需要一系列蛋白協(xié)同完成黏附。對人肺炎支原體的研究發(fā)現(xiàn)，HMW1、HMW2、HMW3、HMW4、P65、P40、P24、P41 等蛋白都與黏附過程相關(guān)，輔助P1 和P30 蛋白實現(xiàn)支原體黏附宿主細胞。 對于MO 黏附因子的研究目前仍處于起始階段。根據(jù)序列比對分析結(jié)果推測MO 的P113 蛋白與豬肺炎支原體黏附蛋白P97 直系同源［12］，可能與MO 黏附相關(guān)， 但是其是否屬于黏附蛋白目前尚缺少有力的直接證據(jù)。 對于MO 黏附相關(guān)蛋白的研究仍在探索。隨著基因組測序技術(shù)的發(fā)展，研究人員利用第二代測序技術(shù)對MO 進行全基因組測序，通過生物信息學分析，預(yù)測其蛋白質(zhì)功能，從而分析得到與黏附相關(guān)蛋白， 如P130、P129 和P71［13］。 但是這些蛋白具體執(zhí)行何種功能、是否存在互作、在MO 中的定位均需要深入研究。

2 MO 引起下呼吸道損傷的分子機制

MO 通過黏附呼吸道上皮細胞定植于呼吸道黏膜和肺泡細胞表面，持續(xù)刺激機體，造成機體炎性損傷。研究人員通過體內(nèi)外試驗探究MO 引起下呼吸道損傷的分子機理。在體外研究方面，Li 等［14］通過氣液界面培養(yǎng)寧夏灘羊氣管上皮細胞， 接種MO， 證實MO 通過ERK-線粒體途徑引起細胞凋亡。 Xue 等［15］使用氣液界面培養(yǎng)方法培養(yǎng)綿羊氣管上皮細胞感染MO，表明MO 可通過Toll 樣受體激活其級聯(lián)蛋白MyD88，使下游P38 蛋白磷酸化，進而通過MAPK 信號通路導(dǎo)致線粒體活性氧（ROS）累積，引起氣管上皮細胞氧化應(yīng)激。 內(nèi)源性ERK-線粒體途徑和外源性凋亡途徑均發(fā)揮作用，細胞發(fā)生凋亡致使氣管上皮損傷［14，16-19］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MO 菌體最外層的莢膜多糖（capsular polysaccharides，CPS）能夠在體外刺激原代羊氣管上皮細胞發(fā)生氧化損傷。 CPS 是MO 的重要毒力因子，通過TLRs 通路，MyD88 依賴性和非依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)使細胞凋亡，JNK/P38-MAPK 信號通路起重要的促凋亡作用［15］。在體內(nèi)研究方面，Du 等［20］建立了綿羊MO 體內(nèi)感染模型， 肺臟轉(zhuǎn)錄組分析表明MO 通過LAMP-TLR2/LR6-MyD88-MKK6-AP1 -IL1β 和 LAMP -TLR8 -MyD88 -IRF5 -RANTES 兩條通路致肺部病變。 促使細胞自噬也是MO 引起細胞損傷的一種方式。 羅海霞等［21］研究表明，MO 通過P62 和Atg7 蛋白引起綿羊肺上皮細胞自噬。

MO 不僅通過內(nèi)源性和外源性凋亡途徑促使呼吸道黏膜上皮細胞凋亡導(dǎo)致組織損傷， 還能通過刺激免疫細胞促進炎癥反應(yīng)， 使組織發(fā)生炎性損傷而致病。 MO 菌體表面的脂質(zhì)膜相關(guān)蛋白（lipid-associated membrane proteins，LAMPs） 是與宿主細胞發(fā)生相互作用的重要結(jié)構(gòu)［22］。 最近證明MO 可通過LAMPs 與綿羊肺泡巨噬細胞的TLR2受體結(jié)合激活MAPK 信號通路，上調(diào)IL1β 炎癥因子表達，使其分泌水平提高［23］。 IL1β 既是炎癥因子又是信號分子，能募集其他免疫細胞，包括天然免疫細胞（如中性粒細胞和樹突狀細胞）和適應(yīng)性免疫細胞（如T 淋巴細胞、B 淋巴細胞），從而激發(fā)更嚴重的炎癥反應(yīng)［24］。此外，MO 還能通過LAMPTLR2-NF-κB/MAPK-cytokine 通路引起小鼠腹腔巨噬細胞炎癥反應(yīng)［23］。MO 的熱休克蛋白（HSP）也是引起炎癥反應(yīng)的重要刺激因子。 周怡等［25］研究表明， 重組MO HSP70 蛋白能引起小鼠IL-2 和INF-γ 分泌水平上升。

MO 感染羊肺上皮巨噬細胞的蛋白質(zhì)組學研究表明，MO 感染引起Toll 樣受體信號通路相關(guān)蛋白 （FADD、CD86 等）、MAPK 信號通路蛋白（p38、ERK 等）、 自噬作用相關(guān)蛋白（CD11b、PKC等）及細胞與細胞外基質(zhì)（ECM）受體相互作用相關(guān)蛋白（THBS1、CD36 等）表達量發(fā)生顯著變化。這些蛋白分子主要參與巨噬細胞的免疫應(yīng)答、凋亡及自噬等過程。從蛋白質(zhì)組學角度證明，綿羊原代肺泡巨噬細胞感染MO 后其Toll 樣受體信號通路、MAPK 信號通路、ECM 受體相互作用及自噬作用途徑可能被激活或被抑制［26］。

由此可見，MO 對下呼吸道造成的損傷機制主要是引起肺上皮和氣管上皮細胞凋亡， 同時刺激巨噬細胞發(fā)生嚴重的炎癥反應(yīng)， 對附近組織造成炎性損傷。支原體不僅損傷呼吸道上皮細胞，也能影響免疫系統(tǒng)，從而造成更嚴重的炎性損傷。

3 MO 抑制宿主免疫系統(tǒng)的分子機制

免疫系統(tǒng)是機體抵抗病原微生物的重要防線。 支原體感染多呈現(xiàn)慢性、持續(xù)性感染，對機體造成持久性損傷［27-31］。 支原體是如何與宿主機體免疫系統(tǒng)對抗、如何逃避免疫監(jiān)視而免受清除，成為近年來支原體研究領(lǐng)域的熱點。

天然免疫是動物抵抗病原微生物的第一道防線，中性粒細胞作為數(shù)量最多的天然免疫細胞，在感染初期發(fā)揮極為重要的抗感染免疫作用。 中性粒細胞能通過吞噬、 呼吸爆發(fā)作用等實現(xiàn)對病原微生物的清除。 但是支原體能抵抗中性粒細胞的吞噬作用，降低其細胞外捕網(wǎng)（NETs）活性，抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）和一氧化氮產(chǎn)生，減弱其呼吸爆發(fā)作用，從而抑制中性粒細胞的功能活性而僥幸生存［4］。 此外，巨噬細胞作為天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，通過吞噬、抗原遞呈、分泌炎性因子、分泌補體等方式抵抗微生物感染［32-34］。MO 可引起小鼠肺巨噬細胞凋亡。 研究表明，P53 和RO 介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡途徑和caspase8 介導(dǎo)的外源性凋亡途徑均可引起小鼠肺巨噬細胞凋亡，抑制天然免疫反應(yīng)，降低機體對菌體的抵抗能力［35］。 TIPE2 蛋白在支原體感染引起的巨噬細胞炎癥反應(yīng)過程中起負調(diào)控作用，可抑制巨噬細胞的免疫反應(yīng)［36］。 近年來，新發(fā)現(xiàn)的巨噬細胞自噬現(xiàn)象， 不僅能發(fā)揮清除病原微生物的作用，而且能被病原微生物利用，從而達到免疫逃逸目的［37］。 MO 進入巨噬細胞后形成內(nèi)體（endosome），激活NOD/c-JNK 通路，形成自噬小體（autophagsome），在溶酶體的作用下使巨噬細胞發(fā)生自噬，Atg5、beclin1 和LC3-II 自噬相關(guān)蛋白表達均上調(diào)［26］。 MO 可引起巨噬細胞自噬，從而降低巨噬細胞的防衛(wèi)能力。 巨噬細胞不僅在天然免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用， 而且其分泌的細胞因子能夠募集、活化適應(yīng)性免疫細胞，因此，巨噬細胞是天然免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁， 一旦其功能受阻，機體的免疫功能將發(fā)生嚴重失調(diào)，降低機體免疫能力。另外，一個在天然免疫系統(tǒng)和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)中均發(fā)揮作用的分子——補體也能夠被支原體巧妙躲避。 肺炎支原體通過EF-Tu 募集H 因子，逃避補體殺傷。H 因子還有助于支原體與氣管上皮細胞黏附［38］。

支原體不僅能夠抑制天然免疫細胞功能，還能通過影響適應(yīng)性免疫系統(tǒng)達到逃避免疫監(jiān)視的效果。 肺炎支原體感染使外周血CD4+T 細胞數(shù)量以及CD4+T 細胞與CD8+T 細胞比例降低。 感染MO 的Argali 雜交羊肺臟轉(zhuǎn)錄組分析表明，MO 能抑制纖毛運動， 使B 細胞免疫抑制， 致使其易感MO［39］。 不同品種羊?qū)O 的易感性存在一定差異， 這也促使研究者從不同的角度探討MO 與免疫系統(tǒng)的互作方式。 羊MHC-DRB1 外顯子exon2區(qū)域多態(tài)性與是否易感或耐受MO 感染有關(guān)［40］。

4 小結(jié)與展望

由于MO 引起的羊支原體肺炎呈漸進性發(fā)展，降低羊生產(chǎn)性能，難以有效防控，該病也受到越來越多的關(guān)注，對MO 的研究將逐漸深入。 黏附是支原體發(fā)揮致病作用的第一步， 多種支原體的黏附蛋白已經(jīng)明確。 對于MO，雖然已經(jīng)推測或間接證明與其黏附相關(guān)的蛋白， 但是目前仍然缺乏有力的直接證據(jù)， 例如通過構(gòu)建缺失株或篩選缺陷菌株直接證明與支原體黏附功能相關(guān)的蛋白。

目前對于MO 引起細胞損傷的分子機制研究集中在TLR 受體及其下游相關(guān)信號通路，如MAPK、ERK、JNK 信號通路，最終引起氧化應(yīng)激、凋亡或者自噬。 支原體能通過抑制宿主免疫系統(tǒng)包括天然免疫和適應(yīng)性免疫， 達到免疫逃逸，造成持續(xù)性感染。 對MO 與免疫系統(tǒng)的互作機制進行深入研究，有利于有效清除MO，降低其持續(xù)感染率。

支原體不同于細菌與病毒， 有特有的形態(tài)結(jié)構(gòu)、生長特性、致病機制。 對于支原體分子致病機制在人肺炎支原體、牛肺炎支原體、豬肺炎支原體研究上較為廣泛與深入。 對于MO 的研究方興未艾， 由于缺少便于操作的體外模型和基因組操作系統(tǒng)，對于科學假設(shè)缺乏有效的驗證系統(tǒng)，也限制了對該病原菌的深入研究。 羊呼吸道疾病目前情況復(fù)雜，往往并不是單一病原微生物引起，常呈現(xiàn)復(fù)雜的混合感染［41-44］。免疫巴氏桿菌LKTA 亞單位疫苗能夠?qū)υ摬≡鸬矫庖弑Ｗo作用， 但是對支原體混合感染缺乏有效的保護［45］，支原體與其他呼吸道病原菌的互作關(guān)系也將是解析該病致病機制的新思路。 因此，建立有效的體外評價體系、高效基因組操作系統(tǒng)會大大提升對該病原體的認知，有利于開發(fā)高效防控技術(shù)。