Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子超家族在褶皺臂尾輪蟲中的進化和表達分析?

范正杰，王玉玨，張全啟，2，3??

(1.中國海洋大學海洋生物遺傳學與育種教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2.青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266237；3.中國海洋大學三亞海洋研究院 海南省熱帶水產(chǎn)種質(zhì)重點實驗室，海南 三亞 572000)

轉(zhuǎn)座子(Transposons)，又被稱為轉(zhuǎn)座元件(Transposable elements, TEs)，是一段能通過非同源重組在宿主基因組內(nèi)或基因組間進行移動的散在分布的重復序列[1]。真核生物的轉(zhuǎn)座子按轉(zhuǎn)座機制可分為兩大類：Ⅰ類元件即逆轉(zhuǎn)錄元件，是通過逆轉(zhuǎn)錄酶使用“復制-粘貼”的機制進行轉(zhuǎn)座的RNA轉(zhuǎn)座子；Ⅱ類元件DNA轉(zhuǎn)座子，則是使用基于DNA的“剪切-粘貼”轉(zhuǎn)座模式直接將轉(zhuǎn)錄子從原始位點整合至目標位點的轉(zhuǎn)座子，其中最大的亞綱是兩端有末端反向重復序列(Terminal inverted repeat，TIR)結(jié)構的TIR轉(zhuǎn)座子，包含著分布廣泛且種類眾多的超家族，例如Tc1/Mariner超家族。Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子超家族可能是自然界中分布最廣的轉(zhuǎn)座子超家族，在輪蟲、真菌、植物、魚類和哺乳動物等多種生物中都有其存在，然而其絕大多數(shù)是失活突變[2-4]，且它因Tc1和Mariner合稱而得名[5]。其中Tc1轉(zhuǎn)座子于秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)基因組研究時被發(fā)現(xiàn)[6]，Mariner是最小的自主DNA轉(zhuǎn)座子之一，以其水平轉(zhuǎn)移的傾向而聞名，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其在動物、植物、真菌中均廣泛分布，即使在蛭形輪蟲這類具有高轉(zhuǎn)座抑制的物種中，Mariner轉(zhuǎn)座子也通過其強大的不依賴宿主的特性而大量的存在與繁殖[4]。

Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子的長度在1～5 kb之間，編碼282～345個氨基酸的轉(zhuǎn)座酶，其兩側(cè)有2個TIR，且TIR長度在17～1 100 bp之間[3,7]。來自不同Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子家族的轉(zhuǎn)座酶蛋白序列并不十分相似，但都具有兩個特征結(jié)構域：一個包含螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(Helix-Turn-Helix, HTH)氨基末端，用于識別和結(jié)合TIR；另一個包含DDD/E羧基末端催化基序結(jié)構域，其第一和第二個天冬氨酸(D)殘基之間至少有92個氨基酸，而第二個天冬氨酸(D)殘基和第三個天冬氨酸(D)殘基或谷氨酸殘基(E)之間的距離是變量。目前Tc1/Mariner超家族大致可根據(jù)此數(shù)目分為7個主要亞家族，分別為DD34E(Tc1)、DD34D(mariner)、DDxD(pogo)、DD37D(maT)、DD37E、DD39D和DD41D(rosa)。

Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子不依賴宿主的特征來執(zhí)行轉(zhuǎn)座過程，因此其存在不局限于一個特定的宿主。事實上，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多Tc1/Mariner在不同宿主之間水平轉(zhuǎn)移的情況，例如在褐帶卷蛾中發(fā)現(xiàn)的一個Mariner轉(zhuǎn)座子通過水平轉(zhuǎn)移方式轉(zhuǎn)移到它的寄生體后，也在其它寄主和寄生體間發(fā)現(xiàn)了Mariner轉(zhuǎn)座水平轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，表明寄生—寄主關系可能在轉(zhuǎn)座子水平轉(zhuǎn)移中占重要地位[8]。該現(xiàn)象存在于海洋甲殼類動物之間[9]、不同目昆蟲之間[10-11]，甚至存在于不同門的生物之間，如人類和寄生線蟲之間的轉(zhuǎn)移[12]。然而，目前還不清楚轉(zhuǎn)座子是如何侵入新的基因組的。參與這種水平轉(zhuǎn)移的潛在載體是外部寄生者，如螨蟲(可能是果蠅中P元件水平轉(zhuǎn)移的載體[13])？還是內(nèi)部寄生者，如病毒[14]？目前針對Tc1/Mariner的水平轉(zhuǎn)移在昆蟲中報道較多[15]。

轉(zhuǎn)座子在基因組中的分布并非是隨機的，部分轉(zhuǎn)座子與一些功能元件有密切的聯(lián)系[16-17]，轉(zhuǎn)座子不僅影響了基因組的結(jié)構，還參與了基因表達調(diào)控的過程，例如在人類和小鼠中發(fā)現(xiàn)Alu插入的數(shù)量與基因差異表達存在相關性[18]。在大鼠和小鼠中發(fā)現(xiàn)，長末端重復序列(Long terminal repeated，LTR)和長散在重復序列(Long interspersed nuclear elements，LINE)與基因表達正相關[19]。此外，轉(zhuǎn)座子插入到基因或基因側(cè)翼區(qū)域也可能帶來基因功能突變[20]。

褶皺臂尾輪蟲(Brachionusplicatilis)在分類學上隸屬于輪蟲動物門(Rotifera)，單巢綱(Monogononta)、游泳目(Ploimida)、臂尾輪蟲科(Brachionidae)、臂尾輪蟲屬(Brachionus)，是目前唯一能在海水養(yǎng)殖中實現(xiàn)規(guī)?；B(yǎng)殖的輪蟲，具有抗逆性強、營養(yǎng)豐富、繁殖快和游動慢等特點，因此該物種成為海水魚蝦蟹類幼體重要的開口餌料[21]。同時褶皺臂尾輪蟲具有典型的孤雌生殖世代和有性生殖世代交替的兼性繁殖生活史，會在外界環(huán)境變化，如溫度、營養(yǎng)、種群密度和pH溶解氧劇變時進入混交世代。先前的轉(zhuǎn)座子對于輪蟲門基因組影響的研究大多關注含量及結(jié)構[22]，而本研究基于褶皺臂尾輪蟲基因組數(shù)據(jù)，針對褶皺臂尾輪蟲基因附近的轉(zhuǎn)座子家族進行鑒定和富集，并針對其Tc1/Mariner超家族進行了進化和表達分析，以從功能的視角去探索Tc1/Mariner超家族在褶皺臂尾輪蟲基因組中扮演的角色。

1 材料與方法

1.1 褶皺臂尾輪蟲基因組重復序列注釋

褶皺臂尾輪蟲基因組數(shù)據(jù)(Bioproject:PRJNA 719948)和基因注釋信息由本實驗室分析獲得。重復序列注釋方法分為同源序列比對和從頭預測兩類。同源序列比對方法基于RepBase[23]，使用RepeatMasker[24]和Repeatproteinmask[25]軟件識別與已知重復序列相似的序列。從頭預測使用LTR_FINDER[26]，Piler[27]，RepeatScout[28]，RepeatModeler[29]等軟件：首先建立從頭測序重復序列庫；再通過Repeatmasker 軟件預測。此外，使用TRF[30](http://tandem.bu.edu/trf/trf.html)尋找基因組中串聯(lián)重復序列(Tandem repeat)。重復序列的注釋均使用軟件默認參數(shù)。將RepeatModeler、RepeatScout、Piler、LTR_finder 軟件預測出來的結(jié)果結(jié)合RepBase 庫采用Uclust[31]的軟件(遵從80-80-80 原則)進行整合獲得最終注釋結(jié)果。

1.2 轉(zhuǎn)座子及鄰近基因表達分析

褶皺臂尾輪蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Bioproject: PRJNA 720972)由本實驗室測序分析獲得，取自8個發(fā)育階段：非混交胚胎、非混交雌性、雄性、雄性胚胎、攜帶雄性胚胎的混交雌性、攜帶休眠卵的混交雌性、新產(chǎn)休眠卵、休眠三個月后的休眠卵(見圖1)。使用Genomic-Ranges軟件[32]及rtracklayer軟件[33]對轉(zhuǎn)座子及基因結(jié)構進行了統(tǒng)計，并且以基因兩側(cè)的5 000 bp的長度分別作為基因的上游和下游部分。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行reads過濾，并使用STAR軟件[34]進行比對得到SAM文件，再使用Samtools軟件[35]轉(zhuǎn)換為按名字排序的BAM文件并用于后續(xù)的分析。將基因注釋、轉(zhuǎn)座子注釋文件和各個時期轉(zhuǎn)錄組進行比對結(jié)果，使用TEtranscripts軟件[36]進行counts統(tǒng)計，并使用R語言軟件中的DEseq2軟件[37]進行標準化及處理，使用dplyr、factoextra[38]、FactoMineR軟件[39]進行平行組及各個組之間的主成分分析以確保質(zhì)量，最后用TBtools軟件[40]來得到各個發(fā)育時期的所有轉(zhuǎn)座子及基因的FPKM表達量。規(guī)定只有在各個發(fā)育時期FPKM≥3時認為該轉(zhuǎn)座子有表達，進行篩選后將有表達的轉(zhuǎn)座子使用R語言軟件中的clusterProfiler軟件[41]進行富集分析以獲得轉(zhuǎn)座子家族，對富集到的轉(zhuǎn)座子家族與臨近基因的各世代表達進行Person相關性分析，以絕對值0.5作為相關的系數(shù)標準，使用R語言軟件中的ggplot2[38]進行繪圖。

圖1 褶皺臂尾輪蟲生活史模式圖

1.3 Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子超家族的表達和進化分析

利用shell腳本提取褶皺臂尾輪蟲基因組中的Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子超家族注釋信息，并分別統(tǒng)計其家族種類、拷貝數(shù)和表達量，最后對臨近基因的功能進行分析。

為了獲得基于Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子完整轉(zhuǎn)座酶，從NCBI及Repbase中下載了544條Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座酶序列，以褶皺臂尾輪蟲基因組為目標庫，使用tBlastN尋找轉(zhuǎn)座酶序列(相似度>30%、長度>80、e值<10-5)，對每個拷貝的兩側(cè)分別延長1 000 bp，使用Seqkit[42]的subseq功能基于bed格式提取完整fasta序列，使用TBtools中的ORF_Prediction獲取序列的ORF序列，并保留每個序列預測出的長度大于300 bp的氨基酸序列，在MuscleX軟件中使用對齊(即使用默認設置)，手動進行篩選，保留有完整的DDE/D結(jié)構域的轉(zhuǎn)座酶序列，并基于DDE/D結(jié)構域確認其家族，在PHYRE2網(wǎng)站(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)上預測各家族轉(zhuǎn)座酶的空間結(jié)構。

使用已知的具有完整DDE結(jié)構域的轉(zhuǎn)座酶家族(來自于果蠅、蛭形輪蟲、家蠶等)作為參考，使用muscle軟件[43]進行對齊，用ProtTest軟件[44]選擇最優(yōu)氨基酸代替模型，基于該模型使用RAxML軟件[45]構建系統(tǒng)進化樹,bootstrap設為1 000。對于獲得的系統(tǒng)樹，使用EvolView軟件[46]進行美化。

利用Tc1/Mariner各個亞家族的注釋信息，使用TEtranscripts軟件處理結(jié)果來得到各個時期的表達量。用GenomicRanges軟件及rtracklayer軟件尋找各家族附近基因，并基于基因功能注釋得到Tc1/Mariner各亞家族附近基因的功能富集結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 褶皺臂尾輪蟲基因附近轉(zhuǎn)座子家族富集分析

主成分分析結(jié)果顯示(見圖2)，8個組24個轉(zhuǎn)錄組聚類情況良好，可用于后續(xù)分析。褶皺臂尾輪蟲基因組中共鑒定到419 244個轉(zhuǎn)座子(不含簡單重復序列)，從中篩選得到了92 225個轉(zhuǎn)座子在褶皺臂尾輪蟲的生命周期中的不同階段發(fā)生了表達。共富集到10個轉(zhuǎn)座子家族中，其中Ⅰ轉(zhuǎn)座子家族有3個：ERV4、Pao和tRNA-Deu；Ⅱ轉(zhuǎn)座子家族有7個：包括隸屬于Tc1/Mariner超家族的Mariner、Fot1和Tigger3個亞家族，以及不屬于Tc1/Mariner超家族的hAT1、hAT、Academ和Sola。將這10個轉(zhuǎn)座子家族的轉(zhuǎn)座子拷貝表達量與鄰近基因的表達量進行相關性分析，發(fā)現(xiàn)多數(shù)轉(zhuǎn)座子的表達模式與附近基因的表達模式呈正相關，負相關者較少，其中呈相關性的Mariner家族的轉(zhuǎn)座子以分布在基因下游為主(見圖3a)，而Fot1家族的轉(zhuǎn)座子以mRNA分布居多(見圖3b),Tigger家族的轉(zhuǎn)座子則分布較為均勻(見圖3c)。

(AE: 非混交胚胎Amictic embryos；AMF: 非混交雌性Amictic females；M: 雄性Males；ME: 雄性胚胎Male embryos；M: 攜帶雄性胚胎的混交雌性Mictic females with male embryos；MFRE: 攜帶休眠卵的混交雌性Mictic females with resting eggs；RE: 新產(chǎn)的休眠卵Resting eggs；RED: 休眠三個月后的休眠卵Resting eggs after three months’ dormancy)

((a)Mariner家族Mariner family；(b)Fot1家族Fot1 family；(c)Tigger家族Tigger family。第一列為Pearson相關性系數(shù)，第二列-log10(p值)，第三列轉(zhuǎn)座子位置，第四列為轉(zhuǎn)座子FPKM表達量，第五列為轉(zhuǎn)座子附近基因FPKM表達量。1st column: correlation; 2nd column:-log10(p-value);3rd column: TE position; 4th column: TE FPKM expression level; 5th column: nearby genes’ FPKM expression level.AE: 非混交胚胎Amictic embryos；AMF: 非混交雌性Amictic females；M: 雄性Males；ME: 雄性胚胎Male embryos；M: 攜帶雄性胚胎的混交雌性Mictic females with male embryos；MFRE: 攜帶休眠卵的混交雌性Mictic females with resting eggs；RE: 新產(chǎn)的休眠卵Resting eggs；RED: 休眠三個月后的休眠卵Resting eggs after three months’ dormancy)

2.2 Tc1/Mariner的鑒定和轉(zhuǎn)座酶結(jié)構及系統(tǒng)發(fā)育分析

褶皺臂尾輪蟲中共發(fā)現(xiàn)了23 378個Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子拷貝，并分為7個亞家族，其中拷貝數(shù)目較多的3個家族為Tc1、Pogo和Mariner家族(見表1)。

統(tǒng)計了7個亞家族在基因內(nèi)部、基因上下游及基因間區(qū)的分布情況(見表1)。所有亞家族表現(xiàn)出了相似的分布特征，即均在基因間區(qū)分布最多。除了Trigger亞家族(48.19%)和Tc1亞家族(47.73%)，其余5個亞家族在基因間區(qū)的轉(zhuǎn)座子分布占比都超過了50%。Sagan亞家族在基因間區(qū)的分布占比最高(65.69%)。在基因內(nèi)部分布的情況中可以發(fā)現(xiàn)，相較于其他6個亞家族，Sagan亞家族在基因內(nèi)部的分布最少(僅占2.93%)。

表1 Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子7個亞家族的位置分布及拷貝數(shù)

基于同源比對的方法，本文作者在褶皺臂尾輪蟲基因組中共發(fā)現(xiàn)了29條完整的Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子序列。為了確定褶皺臂尾輪蟲中Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子的系統(tǒng)發(fā)育關系，基于轉(zhuǎn)座酶序列使用Repbase和NCBI中下載的近源物種中的Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子基因序列進行了系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)褶皺臂尾輪蟲中的Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子可以分為3個不同的亞家族即Tc1、Tc2和Pogo，其中大多數(shù)為Pogo轉(zhuǎn)座子(見圖4)。系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果表明，褶皺臂尾輪蟲Tc1亞家族與家蠶的Tc1亞家族關系較近，而與果蠅中的Tc1家族關系較遠；Tc2亞家族與秀麗隱桿線蟲的Tc2聚為姐妹群；Pogo亞家族與真渦蟲Pogo亞家族關系較近。總體來看，這與褶臂尾輪蟲Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)發(fā)育關系與物種之間的親緣關系基本一致。

(不同的背景顏色代表不同的Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子亞家族，紅色分類名代表褶皺臂尾輪蟲中鑒定到的序列。Clade colors denote different subfamilies of Tc1/Mariner transposons; Taxon names in red indicate sequences from B. plicatilis.)

然后對29條完整轉(zhuǎn)座酶進行了結(jié)構預測和序列比對。Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座酶的N端為DNA結(jié)合區(qū)域，C端為催化區(qū)域，空間結(jié)構預測結(jié)果(見圖5)表明褶皺臂尾輪蟲的Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座酶均在Phyre2中高置信命中了c3hosA(轉(zhuǎn)座酶)結(jié)構，其N端NA結(jié)合區(qū)域含有兩段螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH，helix-turn-helix)結(jié)構，而在轉(zhuǎn)座酶的C端均具有DDE/D基序作為DNA剪切轉(zhuǎn)座活性的催化區(qū)域。序列對比結(jié)果顯示Tc1/Mariner超家族轉(zhuǎn)座酶催化區(qū)域的第二個天冬氨酸(D)和第三個天冬氨酸(D)之間，或第二個天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)之間有30～35個氨基酸，基于其數(shù)目不同可以分為不同的家族，分別是Tc1家族(DD34E，見圖6a)、Tc2(DD35D，見圖6b)家族和Pogo(DDxD，見圖6c)家族。

圖5 Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座酶的空間結(jié)構預測

2.3 Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子超家族的表達模式及功能

Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子7個亞家族在各個發(fā)育階段均有表達，并且具有相似的表達模式，但表達量并非恒定一致(見圖7)，在孤雌生殖階段的非混交胚胎和非混交雌性中表達量偏低，在有性生殖階段中，表達量較高，其中轉(zhuǎn)座子在雄性階段表達量最高，在攜帶雄性胚胎的需精雌性和攜帶休眠卵的混交雌性中表達量較低，在休眠卵(包括新產(chǎn)和休眠三個月)中的表達量較高。

(AE: 非混交胚胎Amictic embryos；AMF: 非混交雌性Amictic females；M: 雄性Males；ME: 雄性胚胎Male embryos；MFM: 攜帶雄性胚胎的混交雌性Mictic females with male embryos；MFRE: 攜帶休眠卵的混交雌性Mictic females with resting eggs；RE: 新產(chǎn)的休眠卵Resting eggs；RED: 休眠三個月后的休眠卵Resting eggs after three months’ dormancy.)

為了了解各個亞家族臨近基因的功能，本文作者對每個亞家族臨近的基因進行GO和KEGG富集分析。

GO功能富集(見圖8)發(fā)現(xiàn)了大量離子相關功能，包括離子結(jié)合和離子轉(zhuǎn)運。其中離子結(jié)合功能包括鋅離子結(jié)合和鎂離子結(jié)合等，而離子轉(zhuǎn)運涉包括陰離子轉(zhuǎn)運等。同時也發(fā)現(xiàn)了細胞周期調(diào)控功能，包括細胞周期功能DNA修復功能和多細胞生物發(fā)育的調(diào)節(jié)功能。此外還發(fā)現(xiàn)應對刺激的功能，包括在應對外界壓力和生物過程的調(diào)控的功能，以及損傷的反應。

圖8 篩選出Tc1/Mariner臨近基因的GO功能富集

KEGG通路富集(見圖9)中發(fā)現(xiàn)的細胞周期通路和環(huán)境信息處理的通路有大量的富集。其中大量富集于細胞周期的通路包括減數(shù)分裂和衰老通路。大量富集于環(huán)境信息處理的通路包括鞘脂信號通路、Notch、Jak-STAT、HIF1、TGF-beta及Wnt信號通路等。

圖9 篩選出的Tc1/Mariner臨近基因的KEGG信號通路富集

總之，Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子超家族附近基因中有大量涉及離子相關、應對刺激、環(huán)境信息處理及生物發(fā)育調(diào)節(jié)的功能和通路。

3 討論

通過統(tǒng)計褶皺臂尾輪蟲基因組中的轉(zhuǎn)座子的分布，發(fā)現(xiàn)分布在基因內(nèi)含子區(qū)域的轉(zhuǎn)座子較多。相較于基因編碼區(qū)域，內(nèi)含子區(qū)域的轉(zhuǎn)座子受到的選擇壓力更小,從而獲得相較于其他區(qū)域更高的存活機會[47]，同時內(nèi)含子區(qū)域的轉(zhuǎn)座子插入可能影響mRNA的可變剪切及轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的正確加工。但是目前還沒有足夠的證據(jù)證明褶皺臂尾輪蟲中轉(zhuǎn)座子的插入位置偏倚是隨機插入后受到選擇壓力的選擇結(jié)果，還是在轉(zhuǎn)座子本身的偏好性帶來的[48]。

轉(zhuǎn)座子在基因組中的分布與基因表達的各個方面相關，包括表達水平、轉(zhuǎn)錄本多樣性和基因調(diào)控因子的活性[49]。目前，關于轉(zhuǎn)座子家族作為整體對基因表達的影響的研究還較少，有研究報道LINE1家族在小鼠原始生殖干細胞和著床前胚胎中RNA含量豐富并且其敲除會抑制原始生殖干細胞更新[50]。本研究通過使用生物信息學手段分析了轉(zhuǎn)座子表達與輪蟲各個生命階段的相關關系，在發(fā)育的各個階段都鑒定到了表達的轉(zhuǎn)座子及富集的轉(zhuǎn)座子家族。共富集到了10個轉(zhuǎn)座子家族，其中DNA類型的轉(zhuǎn)座子含優(yōu)勢，其中有Mariner、Fot1和Tigger3個亞家族均來自于Tc1/Mariner超家族。同時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子的表達與臨近基因的表達以正相關為主。

已有文獻報道脊椎動物中Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子具有多樣性，其豐度各有差異[51]。Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子超家族在哺乳動物和鳥類中表現(xiàn)出非常低的多樣性和豐度[52-53]，與哺乳類和鳥類中不同，早前的研究在硬骨魚的基因組中觀察到了Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子的高多樣性和高豐度[54]。例如轉(zhuǎn)座子可以插入到基因組中的新的調(diào)控元件、外顯子及內(nèi)含子中介導基因融合和基因沉默[55]。而在Tc1/Mariner超家族中，許多轉(zhuǎn)座子例如Tc1亞家族不僅可以參與基因表達調(diào)控，還可以促進新基因的產(chǎn)生，進而使物種適應新環(huán)境[56]。本研究發(fā)現(xiàn)Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子在褶皺臂尾輪蟲基因組中表現(xiàn)出多樣性，共鑒定出7個Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子亞家族。根據(jù)其催化區(qū)域第二個天冬氨酸(D)和第三個天冬氨酸(D)之間，或第二個天冬氨酸(D)和谷氨酸(E)之間的氨基酸數(shù)目將其鑒定為Tc1(DD34E)、Tc2(DD35D)、Mariner(DD34D)、Pogo(DDxD)、Sagan(DD30D)、Tigger(DD32D，DD36D)和Fot1(DD30D)。然而，在自然界中發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子被認為是有缺陷的，因為它們在轉(zhuǎn)座酶基因的編碼區(qū)域內(nèi)包含了移碼、插入/缺失和過早終止密碼子，因此很少有轉(zhuǎn)座子(如Passport和Thm3)被認為是功能活性元件[57-58]。在哺乳動物和鳥類中，所有Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子都是化石轉(zhuǎn)座子且結(jié)構有缺陷[52-53,59]。在兩棲動物中，Tc1/Mariner超家族的活動似乎也已經(jīng)滅絕，盡管Tc1/Mariner超家族占青蛙基因組的很大比例(約5%)，但大多數(shù)元件都是古老的，并且沒有獨立的家族被鑒定出來[60]。爬行動物中Tc1/Mariner多樣性也很低，Tc1/Mariner超家族是蜥蜴DNA轉(zhuǎn)座子中第二多的超家族，但只有一個獨立的家族被鑒定出來[61]。在褶皺臂尾輪蟲中，Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子具有多樣性，這可能是因為在淡水生態(tài)系統(tǒng)中，洪水和干旱等頻繁的壓力可以加快轉(zhuǎn)座活動，從而有助于宿主產(chǎn)生新的變異以適應變化的環(huán)境[25, 62-63]。

Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座酶中最后兩個殘基之間的氨基酸數(shù)量在30～36之間。除去缺陷拷貝中的突變，大多數(shù)DD34E(Tc1)和DD34D(Mariner)元件包含典型的34個氨基酸間距(DD34E和DD34D)[64]。在本研究中，本文作者發(fā)現(xiàn)褶皺臂尾輪蟲的DD34E(Tc1)中的大部分元件都表現(xiàn)出典型的DD34E 結(jié)構。在DDxD(Pogo)亞家族在不同物種中可以觀察到距離的變化，例如真菌的Flipper、Pot2和Fot1中的DD35D[65-66]、果蠅的DD30D[25,67]、人類的DD32D(Tigger1)[68]，而在硬骨魚中，所有完整的轉(zhuǎn)座子元件都顯示出非常保守的DD35D 結(jié)構域[69]。本研究鑒定出的3個亞家族的29條完整轉(zhuǎn)座酶序列也均具有良好的保守性，包括Tc1-DD34E、Tc2-DD35D和Pog-DDxD，這一結(jié)果表明，硬骨魚類中Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座酶的活性可能有其特殊性。

對褶皺臂尾輪蟲的Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子的各個亞家族的各發(fā)育階段的表達情況和臨近基因功能進行了分析，發(fā)現(xiàn)各個亞家族的表達模式基本相似，均在雄性發(fā)育階段表達量最高，在新產(chǎn)休眠卵和休眠三個月后的休眠卵的表達量較高，這2個時期均為輪蟲發(fā)育狀態(tài)發(fā)生變化的特殊時期，這期間轉(zhuǎn)座子處于活躍狀態(tài)，這為后續(xù)研究轉(zhuǎn)座子在輪蟲發(fā)育中的作用提供了重要的材料和線索。在對其臨近基因功能分析中，各個亞家族的GO功能諸多涉及到多細胞生物發(fā)育的調(diào)節(jié)、離子通道、細胞周期、對刺激反應的調(diào)控、DNA修復等；KEGG分析也發(fā)現(xiàn)與環(huán)境信息處理、生物發(fā)育調(diào)節(jié)有關。這些都可能與環(huán)境適應有關，而在輪蟲基因組中，DNA修復和離子轉(zhuǎn)運屬于輪蟲適應環(huán)境比較獨特的功能，涉及到神經(jīng)調(diào)節(jié)、滲透壓調(diào)節(jié)、細胞周期調(diào)節(jié)、無性世代有害變異修復和休眠卵滯育等一系列的生物學過程。顯然，輪蟲基因組對環(huán)境的適應是綜合的調(diào)節(jié)，不局限于基因?qū)用妫€包含了轉(zhuǎn)座子表達對基因表達的調(diào)控。因此，有關Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子具體的生物學功能，需要進一步的實驗去驗證。

本研究通過對褶皺臂尾輪蟲Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子超家族在基因組中的分布、進化和表達進行系統(tǒng)分析，這為系統(tǒng)地認知Tc1/Mariner轉(zhuǎn)座子并從功能角度理解其對褶皺臂尾輪蟲基因組的作用提供了新的線索。