高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法測(cè)定土壤中的4 種硒形態(tài)

劉進(jìn)璽 周曉華 王鐵良 郭 潔 張 迪 賈 斌 魏 紅

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心，鄭州 450002）

硒 （Se） 是人體的必需微量元素[1]，參與合成人體內(nèi)多種含硒酶和含硒蛋白[2]，具有清除體內(nèi)自由基、 抗氧化作用，可以延緩器官老化與病變，提高免疫力，能夠抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)及其DNA、 RNA和蛋白質(zhì)合成[3]，抑制癌基因的轉(zhuǎn)錄，干擾致癌物質(zhì)的代謝。 因此，硒也被稱為 “抗癌之王”。 2017年發(fā)布的WS/T 578.3－2017 《中國(guó)居民膳食營(yíng)養(yǎng)素參考攝入量 第3 部分：微量元素》 標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定我國(guó)18～50 歲成年人，硒元素日平均需要量為50μg。硒元素是人體無(wú)法合成的元素，植物是人體攝取硒元素的重要來(lái)源。 而植物中硒元素的含量除了與植物的種類特性有關(guān)外，還與土壤中硒元素的有效性密切相關(guān)[4～6]。 土壤中硒的有效性不僅取決于總硒的含量，還與硒的形態(tài)有關(guān)。 因此，對(duì)土壤中硒形態(tài)的準(zhǔn)確測(cè)定意義重大。

硒元素的主要存在形態(tài)分為元素態(tài)硒、 無(wú)機(jī)態(tài)硒和有機(jī)態(tài)硒。 元素態(tài)硒和無(wú)機(jī)態(tài)硒主要存在于環(huán)境中，而有機(jī)態(tài)硒主要存在于生物體內(nèi)[7]。 土壤中能被農(nóng)作物吸收利用的有效硒主要有水溶態(tài)和可交換態(tài)的硒酸根［Se（Ⅵ）］離子、 亞硒酸根［Se（Ⅳ）］離子，以及包括硒代蛋氨酸 （SeMet）、 硒代半胱氨酸、 甲基硒代半胱氨酸等在內(nèi)的有機(jī)硒小分子。 目前，關(guān)于硒形態(tài)的測(cè)定方法研究主要集中在高效液相色譜－電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜法和高效液相色譜－氫化物發(fā)生－原子熒光光譜法[8～18]。 其中，高效液相色譜－電感耦合等離子體串聯(lián)質(zhì)譜法具有較高的靈敏度、 較寬的線性范圍和較低的檢出限，但是由于其儀器價(jià)格昂貴，多數(shù)基層單位并未配置，應(yīng)用不夠廣泛； 利用高效液相色譜－氫化物發(fā)生－原子熒光光譜法測(cè)定硒形態(tài)的研究大多集中在稻谷、 大豆、 酵母等富硒樣品上，對(duì)土壤的研究很少，僅見(jiàn)報(bào)道李愛(ài)民等[18]利用高效液相色譜－原子熒光光譜法測(cè)定土壤中4 種有效硒形態(tài)，其提取直接采用NY/T 3420－2019 中的方法，沒(méi)有進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。 筆者所在課題組收集了河南多個(gè)地區(qū)不同富硒農(nóng)作物生長(zhǎng)環(huán)境的土壤，針對(duì)所搜集到的樣品，進(jìn)行了從提取溶劑、 提取方式、 儀器條件等一系列的優(yōu)化，建立了高效液相色譜－氫化物發(fā)生－原子熒光光譜法測(cè)定土壤中硒酸根、 亞硒酸根、 硒代蛋氨酸、 硒代胱氨酸（SeCys）4 種硒形態(tài)的方法。

一、 材料與方法

（一） 主要儀器及試劑材料儀器設(shè)備：SA－10 液相色譜－原子熒光光譜聯(lián)用儀（北京吉天儀器有限公司）； Milli－Q 超純水發(fā)生器（美國(guó)Millipore公司）。 試劑：鹽酸（優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)）； 氫氧化鉀、 碘化鉀、 氫氧化鈉、 檸檬酸溶液、 乙酸銨溶液、 磷酸氫二銨 （分析純，國(guó)藥集團(tuán)）； 硒酸根、亞硒酸根、 硒代蛋氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院）；硒代胱氨酸標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)BOC Sciences 公司）。

（二） 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制準(zhǔn)確稱取10 mg（精確至0.01 mg） 各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL 容量瓶中，分別加入適量超純水溶解并定容，搖勻，得到4 種標(biāo)準(zhǔn)品的單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，換算為以硒計(jì)的質(zhì)量濃度。將上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液放置于4℃的冰箱中，備用。

使用時(shí)將單一標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用水稀釋成適宜濃度的單一標(biāo)準(zhǔn)工作液。 分別吸取一定量的標(biāo)準(zhǔn)工作液，配制成混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，臨用前稀釋成合適濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

（三） 儀器條件液相色譜條件：Hamilton PRP－X100 色譜柱 （250 mm×4.1 mm，10 μm）； 流動(dòng)相為60 mmol/L 的磷酸氫二銨溶液 （pH 6.0），流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為100 μL。

氫化物發(fā)生條件：載流為10%HCl； 還原劑為2%KBH4含0.5%KOH、 0.1%KI 含0.5%KOH。

原子熒光檢測(cè)條件：硒空心陰極燈，燈電流為90mA； 負(fù)高壓為290V； 載氣、屏蔽氣為氬氣，流量分別為300、 500 mL/min； 原子化器高度為10 mm。

（四） 樣品制備樣品采集后，置于室內(nèi)干凈整潔的通風(fēng)處，自然風(fēng)干，剔除其中的植物殘?bào)w、石塊等，樣品磨碎后過(guò)60 目篩，作為待測(cè)試樣。

（五） 樣品前處理稱取2 g （精確至0.01 g）土壤樣品于250 mL 具塞三角瓶中，加入100 mL 0.08 mol/L NaOH 溶液，超聲30 min 后振蕩16 h，取10 mL 上清液，在10000 r/min 條件下離心12 min，取上清液過(guò)膜（0.22 μm） 后待上機(jī)。

二、 結(jié)果與討論

（一） 儀器條件的選擇用來(lái)分離硒形態(tài)常用的色譜柱主要有C18柱和離子交換柱[19～20]，本文分別嘗試使用了島津C18色譜柱和Hamilton PRPX100 離子交換柱，以檸檬酸溶液、 乙酸銨溶液、磷酸氫二銨溶液作為流動(dòng)相來(lái)優(yōu)化4 種硒形態(tài)的分離情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，使用Hamilton PRP－X100 離子交換柱，并使用磷酸氫二胺作為流動(dòng)相時(shí)，4 種硒形態(tài)的分離度和峰形最佳，因此確定色譜柱為Hamilton PRP－X100 離子交換柱。 接下來(lái)進(jìn)一步優(yōu)化磷酸氫二銨的濃度和酸度，結(jié)果表明，當(dāng)磷酸氫二銨的濃度為60 mmol/L、 pH 為6.0 時(shí)，4 種硒形態(tài)的分析時(shí)間適當(dāng)，分離度達(dá)到要求，因此確定流動(dòng)相為60 mmol/L 的磷酸氫二銨溶液（pH 為6.0）。4 種硒形態(tài)的標(biāo)樣圖譜見(jiàn)圖1。

圖1 40 μg/L 4 種硒形態(tài)標(biāo)樣圖譜

（二） 提取溶劑的選擇在河南省內(nèi)種植富硒農(nóng)產(chǎn)品的土地上取樣，共在新鄉(xiāng)市原陽(yáng)縣、 開(kāi)封市、 新鄉(xiāng)市新鄉(xiāng)縣、 濟(jì)源市等地抽取土壤樣品76份，測(cè)得pH 范圍為7.65～8.77，全硒含量為0.06～5.49 mg/kg。 本研究首先選取全硒含量為5.49 mg/kg的土壤樣品作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，對(duì)提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化。

分別選取100 mL 水、 添加30 mg 鏈霉蛋白酶的100 mL 水、 100 mL 0.01 mol/L 的NaOH 溶液、100 mL 體積分?jǐn)?shù)為10%的HCl 溶液、 100 mL 90 mmol/L 的Tris－HCl 緩沖液 （pH 7.5）、 100 mL 體積分?jǐn)?shù)為10%的硝酸溶液作為提取溶劑，對(duì)土壤樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 結(jié)果表明，體積分?jǐn)?shù)為10%的HCl 溶液作為提取溶劑時(shí)，峰位置發(fā)生了遷移，且峰形不佳，因此排除該溶液。 其他5 種提取溶劑提取到的均為硒酸根，其中0.01 mol/L 的NaOH 溶液作提取溶劑時(shí)，提取效率最好，說(shuō)明堿性溶液的提取效果最佳。 又進(jìn)一步優(yōu)化堿液的種類和濃度，實(shí)驗(yàn) 比 較 了0.005、 0.01、 0.02、 0.05、 0.08、 0.10 mol/L 的NaOH 溶 液，0.05、 0.10、 0.20 mol/L 的Na2CO3溶液和0.05、 0.10、 0.20 mol/L 的K2HPO4－KH2PO4緩沖液的提取效果。 結(jié)果表明，NaOH 溶液作提取溶劑時(shí)提取效率最好，當(dāng)NaOH 溶液濃度在0.005～0.10 mol/L 范圍內(nèi)不斷提高時(shí)，硒酸根的提取效率出現(xiàn)先增高后下降的趨勢(shì)，當(dāng)NaOH濃度為0.08 mol/L 時(shí)，提取效率最高，因此確定使用0.08 mol/L 的NaOH 溶液作為提取溶劑。

（三） 提取方式的選擇實(shí)驗(yàn)比較了超聲30 min、 超聲30 min 后浸泡靜置4 h、 超聲30 min 后浸泡靜置8 h、 超聲30 min 后浸泡靜置16 h、 超聲30 min 后振蕩4 h、 超聲30 min 后振蕩8 h、 超聲30 min 后振蕩16 h 和超聲30 min 后振蕩20 h 的提取效果。 結(jié)果表明，超聲后振蕩提取的效果優(yōu)于僅超聲和超聲后靜置的效果； 超聲30 min 后振蕩提取，隨著振蕩時(shí)間的增長(zhǎng)，提取效率逐漸提高，但振蕩時(shí)間為16 h 后，隨著振蕩時(shí)間的增長(zhǎng)，提取效率基本保持不變，這說(shuō)明當(dāng)超聲30 min 后再振蕩16 h 時(shí)，土壤中的有效硒已經(jīng)提取完全，因此確定超聲30 min 后振蕩16 h 為提取方式。

（四） 方法學(xué)評(píng)價(jià)

1.線性關(guān)系和定量限。 吸取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，分別配制成5、 10、 20、 40、 80、 100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，在前文所述儀器條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 以各個(gè)化合物的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制線性關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線。 結(jié)果顯示，4 種化合物的相關(guān)系數(shù)范圍為0.9991～0.9995（見(jiàn)表1）。 選取空白樣品做添加回收實(shí)驗(yàn)，添加量范圍為0.10～1.0 mg/kg，實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，當(dāng)硒酸根和亞硒酸根的添加濃度為0.25 mg/kg、 硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的添加濃度為0.50 mg/kg 時(shí)，上機(jī)液的圖譜峰形對(duì)稱、 清晰可辨，可準(zhǔn)確積分，5 個(gè)平行的回收率在72.3%～81.6%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在5.4%～8.7%之間，符合實(shí)驗(yàn)室相關(guān)法規(guī)的要求。 因此，確定硒酸根和亞硒酸根的定量限為0.25 mg/kg，硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸的定量限為0.50 mg/kg （見(jiàn)表1）。

表1 4 種硒形態(tài)的線性關(guān)系和定量限

2.準(zhǔn)確度和精密度。 選取本底不含硒酸根、 亞硒酸根、 硒代蛋氨酸和硒代胱氨酸的土壤樣品進(jìn)行添加回收實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)設(shè)3 個(gè)濃度水平，每個(gè)濃度水平重復(fù)5 次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。 4 種硒形態(tài)的平均回收率為72.3%～94.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）為4.3%～8.7%。 結(jié)果表明，該方法的準(zhǔn)確度和精密度滿足實(shí)驗(yàn)室相應(yīng)法規(guī)的要求，可以用于準(zhǔn)確定量。

表2 4 種硒形態(tài)添加回收實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.實(shí)際樣品的測(cè)定。 選取全硒含量不同的土壤樣品，依據(jù)NY/T 3420－2019 測(cè)定土壤樣品中的有效硒，并依據(jù)本文建立的方法進(jìn)行硒形態(tài)的分析，測(cè)得土壤中的有效硒形態(tài)均為硒酸根，其含量占全硒含量的23.6%～43.0% （見(jiàn)表3）。 該結(jié)果表明，所抽取土壤樣品中不含有硒代蛋氨酸、 硒代胱氨酸和亞硒酸根，絕大多數(shù)樣品中4 種常見(jiàn)硒形態(tài)之和占全硒含量不足50%，土壤中大部分硒的存在形式可能是殘?jiān)鼞B(tài)或強(qiáng)有機(jī)結(jié)合態(tài)[21]，具體情況需在后續(xù)工作中繼續(xù)探討。

表3 土壤樣品中4 種硒形態(tài)測(cè)定結(jié)果 （mg/kg）

三、 結(jié)論

本文通過(guò)高效液相色譜－氫化物發(fā)生－原子熒光光譜法建立了土壤中硒酸根、 亞硒酸根、 硒代蛋氨酸、 硒代胱氨酸4 種硒形態(tài)的測(cè)定方法，通過(guò)方法學(xué)評(píng)價(jià)和實(shí)際樣品的測(cè)定，表明該方法的線性關(guān)系良好，準(zhǔn)確度和精密度滿足相應(yīng)法規(guī)的要求，可用于實(shí)際樣品中4 種硒形態(tài)的測(cè)定。