同位素稀釋-基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜定量分析復(fù)雜樣品中恩諾沙星研究

楊夢瑞 李 鵬，2 王 敏 周 劍 王彤彤 張麗媛 劉 芳

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100081； 2.國家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院，北京 100037）

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDITOF－MS） 是一種軟電離質(zhì)譜分析技術(shù)，其主要通過待測樣品與具有紫外吸光特性的基質(zhì)形成共結(jié)晶，在激光輻照下解吸附并離子化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的質(zhì)譜檢測。 由于其具有保證分子結(jié)構(gòu)完整性的軟電離特點(diǎn)，因此廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、 聚合物、多肽等大分子化合物相對(duì)分子質(zhì)量的準(zhǔn)確測定[1]。由于MALDI－TOF－MS 具有高通量、 靈敏、 快速等優(yōu)點(diǎn)，近年來，在小分子化合物分析、 質(zhì)譜成像、 微生物鑒定等重要領(lǐng)域也得到廣泛應(yīng)用[2～5]。但是，傳統(tǒng)有機(jī)MALDI 基質(zhì)在激光的輻照下容易在小分子質(zhì)量范圍內(nèi)形成碎片干擾，因此，通過采用無機(jī)納米顆粒作基質(zhì)[6～7]、 介孔材料修飾[8～10]、 新型有機(jī)基質(zhì)替代[11～12]等手段，可以消除干擾，實(shí)現(xiàn)MALDI－TOF－MS分析檢測有機(jī)小分子化合物的目標(biāo)。 此外，由于基質(zhì)與樣品結(jié)晶的不均勻性以及激光輻照的隨機(jī)性，導(dǎo)致MALDI－TOF－MS的測量重復(fù)性較差，極大制約了MALDI－TOF－MS的定量分析能力。

為實(shí)現(xiàn)MALDI－TOF－MS定量分析的目的，目前學(xué)者們主要開展兩個(gè)方面研究，一是提高待測樣品在MALDI 基質(zhì)中的均勻分布，提高測量的重現(xiàn)性與重復(fù)性[13]。 研究表明，納米顆粒負(fù)載沸石后能夠有效提高M(jìn)ALDI－TOF－MS測量的重復(fù)性，例如碲化鎘納米顆粒負(fù)載于介孔沸石表面，能夠顯著降低納米顆粒的團(tuán)聚效應(yīng)，達(dá)到均勻分散，顯著改善了MALDI－TOF－MS測量硬脂酸的重復(fù)性[14]。二是選擇合適的內(nèi)標(biāo)物。 目前，內(nèi)標(biāo)物的選擇主要集中在穩(wěn)定同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)物，由于其與目標(biāo)小分子具有相同的物理化學(xué)性質(zhì)，在MALDI 源的離子化效率相同； 同時(shí)，一些與目標(biāo)小分子結(jié)構(gòu)相似的化合物，由于其離子化效率與被測物離子化效率具有一定的相似性，也可以用作內(nèi)標(biāo)物來定量分析。

恩諾沙星（ENR） 屬于氟喹諾酮類廣譜抗菌藥物，由于在動(dòng)物養(yǎng)殖過程中的不規(guī)范使用，導(dǎo)致殘留問題突出，對(duì)動(dòng)物源食品安全與公共衛(wèi)生造成很大的威脅與影響。 因此，為加強(qiáng)監(jiān)管，國家標(biāo)準(zhǔn)GB 31650－2019 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》 規(guī)定，恩諾沙星與其殘留標(biāo)志物環(huán)丙沙星之和在牛奶、 羊奶中最大殘留限量（MRL）為100 μg/kg，家禽產(chǎn)蛋期為禁用。 高效液相色譜法 （HPLC）、 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法 （LC－MS/MS）等廣泛應(yīng)用于復(fù)雜樣品中恩諾沙星的測定。 由于動(dòng)物源基質(zhì)較為復(fù)雜，樣品前處理步驟較為繁瑣與費(fèi)時(shí)，而MALDI－TOF－MS具有樣品前處理簡單、高通量、 快速、 靈敏的技術(shù)優(yōu)勢，是一種具有潛力的分析方法。

本研究采用前期研究的MALDI 復(fù)合基質(zhì)[15]，重點(diǎn)探討了同位素稀釋質(zhì)譜法結(jié)合MALDI－TOFMS定量分析復(fù)雜陽性樣品中藥物小分子的可行性，考察了方法的線性、 重復(fù)性以及準(zhǔn)確性，并針對(duì)MALDI－TOF－MS定量分析小分子化合物提出了思考與展望。

一、 材料與方法

（一） 實(shí)驗(yàn)儀器與材料MALDI－TOF－MS 質(zhì)譜儀配置波長337 nm 的高頻固態(tài)激光器（Autoflex Speed，布魯克公司，美國）； Beta 沸石（先豐納米材料科技有限公司，中國） 負(fù)載的α－氰基－4－羥基肉桂酸（CHCA，Sigma 公司，美國）； 恩諾沙星純品（TCI 公司，日本）； 恩諾沙星－D5純品（LGC公司，英國）； 甲醇、 乙腈等其他常用有機(jī)試劑（Merck 公司，德國）； 雞蛋、 牛奶為市售商品。

（二） 實(shí)驗(yàn)方法

1.陽性樣品制備。 準(zhǔn)確稱取牛奶、 雞蛋液空白樣品200 g，分別添加一定量的恩諾沙星固體粉末，并充分混勻后制備含有恩諾沙星藥物的陽性樣品，待平衡后分裝至樣品瓶中，于4℃條件冷藏。

2.樣品前處理。 分別準(zhǔn)確稱量1.0 g 陽性樣品于15 mL 離心管中，加入一定量恩諾沙星－D5溶液，并準(zhǔn)確記錄質(zhì)量，渦旋5 min 后室溫下平衡1 h。待充分平衡后，加入1% 甲酸乙腈提取液8 mL，渦旋混勻2 min，以10000 r/min 低溫 （4℃） 離心10 min，取上清液過0.22 μm 尼龍濾膜，室溫下使用氮?dú)獯祾咧馏w積約1 mL。 牛奶樣品直接上機(jī)分析； 蛋液需進(jìn)一步加入水飽和的正己烷4 mL 除脂，以10000 r/min 低溫（4℃） 離心5 min 后取下層清液上機(jī)。

3.點(diǎn)板與質(zhì)譜分析。 點(diǎn)板時(shí)，分別移取0.5 μL 經(jīng)過前處理的待測樣品與復(fù)合基質(zhì)于樣品板上混合，重復(fù)上述步驟，待溶劑揮發(fā)完全形成結(jié)晶后上機(jī)分析。 MALDI－TOF－MS采用正離子方式，連續(xù)采集500 張質(zhì)譜圖累加后作為最終質(zhì)譜圖，采用Igor Pro 軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)分析并作圖。

4.校準(zhǔn)曲線與結(jié)果計(jì)算。 配制0.5、 1.0、 2.0、4.0、 8.0 mg/kg 一系列恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別添加4.0 mg/kg 的同位素內(nèi)標(biāo) （恩諾沙星－D5），以標(biāo)準(zhǔn)溶液中恩諾沙星與恩諾沙星－D5的質(zhì)量比與對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜峰面積比擬合校準(zhǔn)曲線。 在待測樣品中添加一定量的恩諾沙星－D5，質(zhì)譜分析后采用校準(zhǔn)曲線計(jì)算。 計(jì)算方式見公式（1）。

公式（1）中，X1為被測物的質(zhì)量濃度（mg/kg）；A1為儀器測得的樣品溶液中被測物的峰面積；A2為儀器測得的樣品溶液中同位素標(biāo)記物的峰面積；M1為加入樣品中的同位素標(biāo)記物的質(zhì)量 （mg）；MS為樣品的質(zhì)量（kg）；f為待測物與同位素內(nèi)標(biāo)物的校正因子。

二、 結(jié)果與討論

（一） 定量可行性分析由于MALDI－TOFMS 不具有LC－MS 等串聯(lián)質(zhì)譜的在線分離功能，具有相同質(zhì)量數(shù)的干擾物成為影響MALDI－TOFMS 定性定量分析復(fù)雜樣品中目標(biāo)化合物的關(guān)鍵因素。 為了排除內(nèi)源性物質(zhì)的干擾，首先采用MALDI－TOF－MS 分析了經(jīng)過前處理的空白蛋液、 牛奶樣品，得到的質(zhì)譜圖見圖1。 如圖1 所示，雖然在低質(zhì)量數(shù)范圍內(nèi)質(zhì)譜峰較為復(fù)雜，但是在質(zhì)荷比m/z360、m/z365 均未見明顯的質(zhì)譜峰，認(rèn)為經(jīng)過上述前處理后，沒有來自具有相同質(zhì)荷比的內(nèi)源性化合物的干擾。 同樣，采用上述方法，上機(jī)分析添加了恩諾沙星－D5同位素內(nèi)標(biāo)的陽性樣品，獲得的質(zhì)譜圖見圖2。 從圖2 中可以發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)質(zhì)譜峰[ENR+H]+和[ENR－D5+H]+在m/z360 和m/z365 成功被檢出。 因此，認(rèn)為可以采用恩諾沙星－D5作為同位素稀釋劑，對(duì)陽性蛋液、 牛奶中的恩諾沙星開展MALDI－TOF－MS 定量分析研究。

圖1 空白牛奶樣品 （A） 和空白蛋液樣品 （B） 的MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜圖

圖2 添加同位素內(nèi)標(biāo)后的陽性牛奶樣品 （A） 和蛋液樣品 （B） 的MALDI-TOF-MS 質(zhì)譜圖

（二） 方法學(xué)考察由于基于與樣品共結(jié)晶均勻性差以及激光輻照的隨機(jī)性，造成MALDITOF－MS 測量重復(fù)性差，因此MALDI－TOF－MS定量分析存在一定的局限性。 一方面是通過不斷改進(jìn)基質(zhì)材料來提高測量重復(fù)性達(dá)到定量的目的，另一方面是選擇合適的內(nèi)標(biāo)物來定量，而同位素標(biāo)記物則被認(rèn)為是最理想的內(nèi)標(biāo)。 本研究選擇恩諾沙星－D5為同位素內(nèi)標(biāo)，配制0.5、 1.0、 2.0、 4.0、8.0 mg/kg 一系列恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別添加4.0 mg/kg 的同位素內(nèi)標(biāo)，旋混均勻后分別與基質(zhì)混合共結(jié)晶于樣品板上，上機(jī)分析。 以標(biāo)準(zhǔn)溶液中恩諾沙星與恩諾沙星－D5的質(zhì)量比與對(duì)應(yīng)的峰面積比擬合直線（見圖3）。 如圖3 所示，恩諾沙星在0.5～8.0 mg/kg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.998。由此可見，通過使用同位素內(nèi)標(biāo)，可以有效減少M(fèi)ALDI－TOF－MS 測量隨機(jī)性帶來的定量偏差。

圖3 校準(zhǔn)曲線

陽性樣品測定時(shí)，按照目標(biāo)物與同位素內(nèi)標(biāo)1∶1 的原則，添加一定量的恩諾沙星－D5，待充分平衡并前處理后上機(jī)分析，并采用校準(zhǔn)曲線校準(zhǔn)計(jì)算。 本研究考察了MALDI－TOF－MS定量測定蛋液、 牛奶中恩諾沙星的測量重復(fù)性，結(jié)果見表1。如表1 所示，蛋液測定結(jié)果組間組內(nèi)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD） 均＜1%，牛奶測定結(jié)果組間組內(nèi)RSD均＜5%，表明方法的精密度良好，滿足定量要求。同時(shí)，采用添加回收考察了方法的準(zhǔn)確性，按照測定結(jié)果的25%、 50%和100%加標(biāo)后采用同樣的方法測定，結(jié)果見表2。 如表2 所示，蛋液樣品3 個(gè)不同濃度水平的回收率在96.7%～100.0%之間，牛奶樣品3 個(gè)濃度水平的回收率在97.4%～99.2%之間，由此說明方法的準(zhǔn)確性較高，符合定量要求。 綜上所述，結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)，實(shí)現(xiàn)了MALDITOF－MS 定量分析蛋液、 牛奶陽性樣品中恩諾沙星藥物的含量。

表1 陽性蛋液、 牛奶樣品中恩諾沙星測定結(jié)果

表2 陽性蛋液、 牛奶樣品中恩諾沙星加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （n＝3）

（三） 局限性分析與展望本研究中，通過質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理軟件Flex Analysis 以3 倍信噪比和10倍信噪比確定該方法的檢出限與定量限，分別對(duì)應(yīng)濃度為0.5 mg/kg 和2.0 mg/kg，高于動(dòng)物源產(chǎn)品中恩諾沙星殘留檢測限量，因此在實(shí)際檢測應(yīng)用時(shí)具有一定的局限性。 這主要受限于MALDI－TOFMS儀器自身進(jìn)樣方式。 當(dāng)激光輻照樣品板上的樣品結(jié)晶時(shí)，只有激光光斑激發(fā)部位的極少量樣品離子化后進(jìn)入TOF 飛行管到達(dá)檢測器產(chǎn)生信號(hào)，由此說明儀器自身的檢出限遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于方法的檢出限。針對(duì)上述局限性，一方面通過對(duì)前處理后的樣品濃縮后上樣，提高上機(jī)濃度，達(dá)到殘留檢測要求； 另一方面，未來可以通過研究具有特異性吸附作用的新型MALDI 基質(zhì)來富集目標(biāo)化合物，提高靶板樣品中待測物的絕對(duì)含量，進(jìn)而達(dá)到滿足MALDITOF－MS殘留檢測的要求。

三、 結(jié)論

本研究通過采用同位素稀釋質(zhì)譜法，克服了MALDI－TOF－MS定量重復(fù)性、 準(zhǔn)確性差的問題，實(shí)現(xiàn)了MALDI－TOF－MS定量分析蛋液、 牛奶等復(fù)雜陽性樣品中恩諾沙星藥物含量。 研究結(jié)果表明，方法的線性良好，測量重復(fù)性與準(zhǔn)確性滿足定量要求。 該方法的建立為MALDI－TOF－MS定量分析小分子化合物提供了一種借鑒與參考。