吡蟲啉在人體肝微粒體中的代謝產(chǎn)物和代謝途徑研究

張朝陽 劉秀華 王 悅 曲亞通 楊曉娟 劉貴巧 翁 瑞

（1.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，河北 邯鄲056038； 2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術(shù)研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全重點實驗室，北京 100081； 3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部煙草質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室，青島 266101）

新煙堿類殺蟲劑是一類神經(jīng)活性農(nóng)藥，廣泛應(yīng)用于果蔬、 茶葉、 小麥等農(nóng)作物種植過程中，其作用于昆蟲神經(jīng)系統(tǒng)突觸后膜的煙堿型乙酰膽堿受體（nAChR） 和周圍神經(jīng)，使昆蟲保持興奮、 麻痹直至死亡，主要用于防治刺吸式口器害蟲，對水生及陸生無脊椎動物具有致死作用[1～3]。 目前，新煙堿類農(nóng)藥已發(fā)展到第3 代，是農(nóng)業(yè)領(lǐng)域內(nèi)使用量最廣泛的殺蟲劑之一，但大量使用及不合理施用等行為使其殘留于農(nóng)產(chǎn)品及土地、 水源等自然生態(tài)環(huán)境中。 CHEN 等[4]以我國第5 次 （2009－2012年） 總膳食研究和第6 次 （2015－2018年） 總膳食研究的膳食樣本為基礎(chǔ)，測定24 個省份528 份膳食樣本中10 余種新煙堿類農(nóng)藥的殘留情況，發(fā)現(xiàn)檢出率最高的均為吡蟲啉（61.8%）和啶蟲脒（56.9%）。譚穎等[5]對北京市場上49 種蔬菜和24 種水果進行新煙堿類農(nóng)藥檢測，發(fā)現(xiàn)吡蟲啉和啶蟲脒的檢出率均達到100%。 CRADDOCK 等[6]對美國2004－2011年間水樣中新煙堿類農(nóng)藥殘留趨勢分析發(fā)現(xiàn)，未處理水中吡蟲啉檢出率由2%上升到36.7%，飲用水中吡蟲啉檢出率由小于1%上升到29.7%。 由此可見，吡蟲啉和啶蟲脒在食品和環(huán)境中的殘留較高，殘留的農(nóng)藥隨食物鏈、 呼吸等方式進入生物體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化從而影響健康。

目前我國關(guān)于新煙堿類農(nóng)藥的研究多集中在食品檢測、 農(nóng)藥合成以及對生物多樣性和環(huán)境的影響等方面[7～9]，對其在生物體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化的研究較少。而國外在新煙堿類農(nóng)藥生物轉(zhuǎn)化方面起步較早，已揭示了部分新煙堿類農(nóng)藥的代謝方式、 藥代動力學(xué)等信息[10～11]，但因物種之間存在差異，吡蟲啉在人體內(nèi)的代謝產(chǎn)物和具體的代謝途徑并不明確。 人肝微粒體體外溫孵法可以較好地模擬人體內(nèi)的代謝過程，在國內(nèi)外多應(yīng)用于醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的研究[12～14]，其中含有的細胞色素P450（Cytochrome P450，CYP450）酶是代謝的重要酶系，在生物轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用[15～17]。 該模型無需消耗大量實驗動物，可大量開展實驗且操作簡單，避免了生物體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境的干擾，實驗結(jié)果更易觀察。 明確的藥物代謝途徑、 代謝產(chǎn)物活性對了解藥物毒性、 制定合理治療方案及新藥開發(fā)都具有重要的指導(dǎo)意義[18]。 因此，本研究選取吡蟲啉（C9H10ClN5O2） 為農(nóng)藥底物，采用人肝微粒體體外孵育模型，利用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿－靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（UHPLCQ ExactiveTMPlus Orbitrap MS） 技術(shù)檢測其在人肝微粒體中的代謝產(chǎn)物，并結(jié)合二級質(zhì)譜信息推測其代謝途徑，期望為揭示吡蟲啉等新煙堿類殺蟲劑在人體中的代謝途徑提供理論依據(jù)。

一、 材料與方法

（一） 主要實驗儀器Ultimate 3000 液相色譜儀，配備有Q ExactiveTMPlus 四極桿－靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜 （美國Thermo Fisher 公司，配有電噴霧離子源及Xcalibur 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）； HH－S 數(shù)顯恒溫水浴鍋 （常州翔天實驗儀器廠）； ST16R 高速冷凍離心機 （美國Thermo Fisher 公司）； IKA VORTEX 3 漩渦混勻器 （德國IKA 公司）； Milli－Q ACADEMIC 超純水純化系統(tǒng) （法國MILLIQ 公司）； XSE105 分析天平 （美國Mettler Toledo 公司）； 小型制冰機（北京天林恒泰科技有限公司）。

（二） 材料與試劑吡蟲啉標準品 （純度≥99.8%，天津阿爾塔科技有限公司）； 乙腈、 甲酸銨 （質(zhì)譜級，美國Thermo Fisher 公司）；甲酸[質(zhì)譜級，霍尼韋爾貿(mào)易（上海）有限公司]； NADPH 再生系統(tǒng)（美國Sigma－Aldrich 公司）； Tris－HCl 緩沖液（1mmol/L，pH 7.4，北京索萊寶科技有限公司）；男性人肝微粒體購自武漢普萊特生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司，收到后溶解并分裝，存于－80℃冰箱。

（三） 實驗條件

1.色譜條件。 色譜柱使用Agilent Poroshell 120 EC－C18（2.1 mm×100 mm，2.7 μm），帶有保護柱。 流動相A 相為5 mmol/L 甲酸銨－0.1%甲酸水溶液，B 相為5 mmol/L 甲酸銨－0.1%甲酸乙腈。梯度洗脫程序：0～2min，5%B； 2～7min，30%B；7～12 min，100%B； 12～16 min，100%B； 最后回到初始流動相條件平衡柱子4 min。 柱溫：25℃，流速0.4 mL/min，進樣量5 μL。

2.質(zhì)譜條件。 電噴霧離子源 （ESI） 正離子模式，鞘氣流速40 L/h，輔助氣流速10 L/h，噴霧電壓3.8 kV，毛細管溫度325℃，加熱溫度400℃，S－Lens RF 電壓60 V，采集范圍m/z50 ～750。 歸一化碰撞能量 （NCE）：低能量為10%； 中能量為35%； 高能量為55%。 儀器使用中的氣體均為高純度氮氣，采用Full MS/dd－MS2的數(shù)據(jù)采集模式。

（四） 人肝微粒體孵育將吡蟲啉標準品溶解于乙腈中，配制成濃度為10 mg/mL 的溶液備用。配制終體積為200 μL 的NADPH 再生系統(tǒng)，其中包括人肝微粒體（終濃度為1 mg/mL）、 NADPH 溶液 （終濃度為1.5 mmol/L）、 Tris－HCl 緩沖液 （純水稀釋到0.05 mol/L）。 上述混合溶液在37℃水浴鍋中預(yù)孵育2 min，隨后加入1 μL 配制好的吡蟲啉標準溶液，在37℃的水浴鍋中孵育4 h，最后向孵育體系中加入等體積的預(yù)冷乙腈（200 μL） 終止反應(yīng)，在4℃下以14000 r/min 離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至進樣小瓶上機檢測。 實驗過程中同時設(shè)置3個對照組，分別為無人肝微粒體組、 無NADPH 組和無底物組，以相同方法進行孵育，具體孵育體系分組見表1。

表1 吡蟲啉人肝微粒體代謝孵育體系 （μL）

二、 結(jié)果與討論

（一） 吡蟲啉的質(zhì)譜分析吡蟲啉的保留時間為7.16 min，在正離子模式下，準分子離子峰[M+H]+質(zhì)量數(shù)為256.0592。 在ESI 離子源作用下，吡蟲啉經(jīng)碰撞能誘導(dǎo)解離后產(chǎn)生的主要離子碎片有m/z209.0586、 175.0976 、 128.0261 和84.0561。 其中，m/z為209.0586 的碎片離子是斷裂丟失一個NO2和兩個氫離子形成的； 裂解產(chǎn)生的碎片離子m/z175.0976 比碎片離子m/z209.0586 小34，推測是碎片離子m/z209.0586 斷裂丟失一個氯原子后形成的； 碎片離子m/z128.0261 和84.0561 是碎片離子m/z209.0586 碳氮鍵斷裂形成的兩個碎片，碎片離子m/z175.0976 斷裂相同位置的碳氮鍵也會形成碎片離子m/z84.0561，因此碎片離子m/z84.0561 強度高于碎片離子m/z128.0261，詳細的裂解路徑見圖1。

圖1 吡蟲啉的質(zhì)譜裂解路徑

（二） 代謝產(chǎn)物鑒定將人肝微粒體孵育后的實驗組和對照組溶液在UHPLC－Q ExactiveTMPlus Orbitrap MS 儀器上機進樣檢測，對比兩組譜圖，并結(jié)合吡蟲啉的碎片信息和質(zhì)譜裂解路徑圖對代謝產(chǎn)物進行分析，從實驗組的總離子流圖中篩選并鑒定出吡蟲啉原型化合物和5 個代謝產(chǎn)物 （M1～M5）。 吡蟲啉及其代謝產(chǎn)物（M1～M5）對應(yīng)的提取離子流色譜圖、 二級質(zhì)譜圖分別見圖2、 圖3，代謝產(chǎn)物信息見表2。

表2 吡蟲啉經(jīng)人肝微粒體體外孵育的代謝產(chǎn)物信息

圖2 吡蟲啉及其代謝產(chǎn)物（M1～M5） 的提取離子流色譜圖

圖3 吡蟲啉及代謝產(chǎn)物（M1～M5）的二級質(zhì)譜圖

代謝產(chǎn)物M1 的準分子離子峰[M+H]+的m/z為272.0538，與吡蟲啉的準分子離子峰[M+H]+256.0592 相比增大了16 u，并且產(chǎn)生的二級碎片離子225.0535、 191.0925 與吡蟲啉二級碎片離子209.0586、 175.0976 分別相差16 u，存在相同碎片離子84.0561。 因此，推測代謝產(chǎn)物M1 為吡蟲啉加一個羥基形成，分子式為C9H10ClN5O3，理論[M+H]+m/z值為272.0545，與檢測值的誤差為－2.57×10－6，保留時間為6.40 min。

代謝產(chǎn)物M2 的準分子離子峰為[M+H]+的m/z為211.0741，與吡蟲啉的準分子離子峰[M+H]+256.0592 相比小了45 u，且產(chǎn)生的二級碎片離子175.0981、 128.0079、 84.0563 與吡蟲啉二級碎片離子值幾乎相同。 因此，推測代謝產(chǎn)物M2 為吡蟲啉脫硝基形成，在脫硝基后在原位置連接一個氫原子，推測分子式為C9H11ClN4，理論[M+H]+m/z值為211.0745，與檢測值的誤差為－1.90×10－6，保留時間為4.09 min。

代謝產(chǎn)物M3 的準分子離子峰為[M+H]+的m/z為240.0641，與吡蟲啉的準分子離子峰[M+H]+256.0592 相比小了16 u，且產(chǎn)生的二級碎片離子209.0591、 175.0981、 128.0264、 84.0563 與吡蟲啉二級碎片離子值幾乎相同。 因此，推測代謝產(chǎn)物M3 為吡蟲啉硝基掉一個氧原子后形成亞硝基產(chǎn)生的，推測分子式為C9H10N5OCl，理論[M+H]+m/z值為240.0647，與檢測值的誤差為－2.50×10－6，保留時間為5.90 min。

代謝產(chǎn)物M4 的準分子離子峰為[M+H]+的m/z為254.0433，與吡蟲啉的準分子離子峰[M+H]+256.0592 相比小了2 u，推測是掉兩個氫原子后形成，產(chǎn)生的二級碎片離子與吡蟲啉的二級碎片離子不同，但二級碎片離子126.0108 與代謝產(chǎn)物M3中二級碎片離子值幾乎相同，推測代謝產(chǎn)物M4 的質(zhì)譜裂解路徑與吡蟲啉裂解路徑不同。 代謝產(chǎn)物M4 的分子式推測為C9H8ClN5O2，理論[M+H]+m/z值與檢測值的誤差為－2.36×10－6，保留時間為6.11 min。

代謝產(chǎn)物M5 的準分子離子峰為[M+H]+的m/z為158.0000，與吡蟲啉的準分子離子峰[M+H]+256.0592 相比小了98 u，推測為吡蟲啉碳氮鍵斷裂后甲基氧化為羧基形成。 因此，推測代謝產(chǎn)物M5的分子式為C6H4ClNO2，理論[M+H]+m/z值與檢測值的誤差為－1.90×10－6，保留時間為6.36 min。

（三） 代謝路徑分析吡蟲啉經(jīng)過人肝微粒體體外代謝孵育共得到5 種代謝產(chǎn)物，代謝產(chǎn)物M1～M3 分別推測為吡蟲啉－羥基、 脫硝基吡蟲啉和亞硝胺吡蟲啉。 其中吡蟲啉－羥基在人、 鼠、貓、 狗肝微粒體中均有發(fā)現(xiàn)[19]，脫硝基吡蟲啉、 亞硝胺吡蟲啉在人肝微粒體中有發(fā)現(xiàn)[20]，涉及的主要代謝途徑有羥基化、 脫硝基以及亞硝基化，在本研究中根據(jù)得到的一級離子質(zhì)荷比和二級碎片離子信息確定了3 種代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，并推斷了3 種代謝產(chǎn)物的代謝路徑（見圖4）。 代謝產(chǎn)物M4 推斷為吡蟲啉－烯烴，代謝產(chǎn)物M5 推斷為6－氯煙酸，涉及的主要是烯烴化和氧化反應(yīng)，這兩種代謝產(chǎn)物在之前的肝微粒體體外孵育實驗中并未發(fā)現(xiàn)和檢出，根據(jù)檢測得到的譜圖信息確定了其代謝路徑（見圖4）。本研究得到的5 種代謝產(chǎn)物中M5 轉(zhuǎn)化率最低，代謝產(chǎn)物M1、 M3 轉(zhuǎn)化率最高，因此代謝產(chǎn)物M1、M3 可以作為吡蟲啉監(jiān)測實驗中的代謝標志物。

圖4 吡蟲啉經(jīng)人肝微粒體體外孵育的代謝路徑

三、 結(jié)論

本研究通過男性人肝微粒體體外孵育體系對吡蟲啉進行孵育，利用UHPLC－Q ExactiveTMPlus Orbitrap MS 技術(shù)對代謝產(chǎn)物進行鑒定，得到了代謝產(chǎn)物的保留時間、 一級離子質(zhì)荷比、 二級碎片離子等信息，共鑒定出5 種吡蟲啉代謝產(chǎn)物，主要涉及加羥基、 脫硝基、 還原、 氧化等代謝反應(yīng)，初步闡明了吡蟲啉的I 相代謝途徑，該結(jié)果可為研究吡蟲啉中毒后治療以及研發(fā)新藥提供思路和數(shù)據(jù)參考。