紫草素對慢性皮膚潰瘍大鼠間隙連接蛋白家族的蛋白表達(dá)及基因表達(dá)水平的影響

杜偉鵬，張現(xiàn)峰，王曉歌，馬立人

（平頂山中醫(yī)醫(yī)院，河南 平頂山 467000）

皮膚潰瘍是一種由多種原因引起的難治性皮膚病，從肉體和精神上對患者造成雙重的痛苦，其主要特征是病程遷延、長期不能愈合，一般超過2周不愈合即可認(rèn)定為慢性皮膚潰瘍［1］。同時(shí)，慢性皮膚潰瘍伴隨的慢性炎癥具有致癌的風(fēng)險(xiǎn)［2］。目前我國對于慢性潰瘍大樣本人群調(diào)查尚未廣泛展開，但該病的危害已經(jīng)無法忽視。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對該病的治療已經(jīng)取得長足的進(jìn)步，目前西醫(yī)主要以外用藥物、高壓氧療、生長因子、皮膚移植和負(fù)壓傷口治療等手段為主［3］，雖然治療手段眾多，但療程長、代價(jià)大，效果也不盡如人意。中醫(yī)學(xué)對于慢性皮膚潰瘍的治療經(jīng)驗(yàn)豐富，多種藥物在該病的治療中均顯現(xiàn)出價(jià)值，其中以紫草的療效最為突出。紫草素是從紫草中提取的一種萘醌類化合物，對于促進(jìn)皮膚愈合具有良好的效果［4］，但其作用機(jī)制尚未明確。本研究就紫草素對慢性皮膚潰瘍大鼠間隙連接蛋白（Cx）的影響展開研究，以期為紫草素治療慢性皮膚潰瘍提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)健康SD 大鼠42 只，體質(zhì)量300～320 g，8～12 周齡，雌性各半，購于上海西普爾－必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：SCXK（滬）2018－0006。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后用于實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)條件：室溫22～25 ℃，相對濕度50%～70%，光暗同步各12 h，自由攝食飲水。此次研究獲得江西中洪博元生物技術(shù)有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：2019120601，所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)和處理均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用規(guī)定。

1.2 主要試劑和儀器

紫草素（HPLC ≥98%，上海脈鉑醫(yī)藥科技有限公司，貨號(hào)：MED80061－1 g）；醫(yī)用凡士林紗布（新鄉(xiāng)市華西衛(wèi)材有限公司，批號(hào)：1936031）；重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子凝膠（貝復(fù)新，珠海億勝生物制藥有限公司，批號(hào)：G41B10158）；免疫組化試劑盒（上海博湖生物科技有限公司，貨號(hào)：BH－S63629）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（上海博湖生物科技有限公司，貨號(hào)：BH－S63784）；Cx26、Cx32、Cx43 二抗（美國Biovision，貨號(hào)：3331－100、3330－120、3330－115）；甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GADPH，北京百奧萊博科技有限公司，貨號(hào)：ARB11900）。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀（美國伯樂Bio－Rad，型號(hào)：CFX96）；全自動(dòng)組織包埋裝置（沈陽恒松科技有限公司，型號(hào)：HS－B7126－B）；石蠟切片機(jī)（沈陽恒松科技有限公司，型號(hào)：HS－S7220－B）；熒光多功能顯微鏡（日本奧林巴斯，型號(hào)：CX43）；全波長酶標(biāo)儀（山東萊恩德智能科技有限公司，型號(hào)：LD－96A）；垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（美國伯樂Bio－Rad，型號(hào)：1658033）；微量核酸蛋白分析儀（北京創(chuàng)譽(yù)科技有限公司，型號(hào)：Aurora－900）。

1.3 模型構(gòu)建和分組

所有大鼠在造模前4 d 注射青霉素鉀溶液（400 U/只）防止感染，每天1 次。4 d 后隨機(jī)選擇30 只大鼠采用戊巴比妥鈉麻醉，標(biāo)記4 cm×4 cm 面積剃除背部毛發(fā)，8%硫化鈉脫毛，無菌條件下制備2 cm ×2 cm 創(chuàng)面面積，按印跡剪去全層皮膚，深至筋膜，避開較大血管，造成缺損性創(chuàng)面，肌注氫化可的松60 mg/kg，50%冰醋酸溶液涂抹創(chuàng)面，醫(yī)用紗布覆蓋、包扎，1 周后形成慢性皮膚潰瘍模型。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：大頭針刺創(chuàng)面5 mm，無滲血且潰瘍表面有肉芽組織生長［5］。選擇24 只造模成功大鼠，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為模型組和紫草素組，每組12 只。12 只未造模大鼠作為假手術(shù)組，僅在背部相應(yīng)部位分離皮瓣，原位縫合。

1.4 給藥方法

給藥時(shí)間為造模1 周后，給藥前均采用生理鹽水棉球清洗創(chuàng)面，擦拭分泌物。清潔后進(jìn)行藥物干預(yù)，并用紗布覆蓋。模型組給予1 890 U/cm2重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子凝膠涂抹創(chuàng)面，紫草素組給予4 mg/mL紫草混懸液（大豆油稀釋）涂抹，具體劑量參照“人和動(dòng)物體表面積折算的等效劑量比率表”換算。假手術(shù)組和模型組給予等量生理鹽水外敷。每日換藥1次，連續(xù)給藥14 d。

1.5 觀察指標(biāo)和方法

1.5.1 一般情況

每日觀察大鼠形態(tài)、體征、行為等一般情況。

1.5.2 創(chuàng)面愈合情況

分別在干預(yù)7、12 d 后觀察創(chuàng)面愈合情況，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。玻璃紙覆蓋創(chuàng)面，描繪潰瘍邊緣，沿邊緣剪下后稱重，按面積比值計(jì)算潰瘍面積，由同一名醫(yī)師測量，測量3次取平均值。

創(chuàng)面愈合（%）=（干預(yù)前創(chuàng)面面積- 干預(yù)后創(chuàng)面面積）／干預(yù)前創(chuàng)面面積×100%

1.5.3 潰瘍創(chuàng)面病理組織學(xué)變化

干預(yù)7、12 d 后，無菌條件下采用手術(shù)器械分離潰瘍創(chuàng)面肉芽組織低溫凍存待檢，取部分組織進(jìn)行石蠟切片、HE染色，顯微鏡下觀察病理變化。

1.5.4 Western Blot 法檢測潰瘍組織Cx26、Cx32、Cx43蛋白表達(dá)

干預(yù)12 d 后，取待檢潰瘍?nèi)庋拷M織，冰上加入RIPA 裂解液，充分震蕩、離心后吸取上清液；PBS 洗滌剪塊勻漿，離心收集上清液，獲得總蛋白溶液。加入細(xì)胞漿蛋白抽提試劑A 和B，再次離心后獲得細(xì)胞漿蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度。經(jīng)SDS－PAGE 電泳后在300 mA 恒流下轉(zhuǎn)膜，30 min 后使用5%脫脂牛奶封閉，4 ℃孵育稀釋后加入一抗，過夜后加入二抗，加入發(fā)光液之后進(jìn)行曝光、顯影、定影。采用Alpha 軟件分析目標(biāo)帶光密度值。

1.5.5 RT－PCR 法檢測潰瘍組織Cx26、Cx32、Cx43 mRNA相對表達(dá)

干預(yù)14 d 后取潰瘍?nèi)庋看龣z組織，充分研磨后分離蛋白，提取RNA，檢測RNA 濃度，逆轉(zhuǎn)錄后獲得cDNA。選擇20 μL 體系進(jìn)行Real time－PCR 反應(yīng)，cDNA 1.5 mmol/L。引物由武漢益普生物科技有限公司合成，反應(yīng)條件：95 ℃變性15 s，60 ℃退火并結(jié)合到靶序列上，延伸1 min，擴(kuò)增40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2－ΔΔCT法分析mRNA相對表達(dá)量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05代表差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況

干預(yù)期間無大鼠死亡，各組大鼠體質(zhì)量、活動(dòng)度未見明顯變化。

2.2 各組大鼠創(chuàng)面愈合情況比較

與本組治療前比較，模型組、紫草素組大鼠干預(yù)12 d 后創(chuàng)面愈合率均高于7 d 后（P<0.05）；與模型組同時(shí)間比較，紫草素組干預(yù)7、12 d 后創(chuàng)面愈合率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

表1 各組大鼠干預(yù)7、12 d后創(chuàng)面愈合率比較（±s，%）

表1 各組大鼠干預(yù)7、12 d后創(chuàng)面愈合率比較（±s，%）

注：與本組干預(yù)7 d后比較，aP<0.05。

組別假手術(shù)組模型組紫草素組干預(yù)12 d—91.77±4.95a 93.03±2.26a n 12 12 12干預(yù)7 d—34.24±11.59 40.79±10.08

2.3 各組大鼠潰瘍創(chuàng)面病理學(xué)變化比較

假手術(shù)組大鼠皮膚組織在干預(yù)7、12 d后均有完整的皮膚結(jié)構(gòu)，表皮、真皮、皮下組織，未見炎性細(xì)胞浸潤；模型組大鼠在干預(yù)7 d 后傷口組織沒有完整的結(jié)構(gòu)，表皮缺失，傷口部位有大量炎性細(xì)胞浸潤、聚集；與模型組比較，紫草素組大鼠在干預(yù)7 d后表皮層和真皮層的細(xì)胞數(shù)明顯增多，皮層變厚，炎性細(xì)胞浸潤減少。模型組大鼠干預(yù)12 d后傷口仍沒有形成明顯完整的皮膚結(jié)構(gòu)，炎性細(xì)胞浸潤減少；紫草素組大鼠干預(yù)12 d后已經(jīng)有明顯的表皮形成，小鼠傷口愈合速度明顯優(yōu)于模型組。見圖1。

圖1 各組大鼠潰瘍創(chuàng)面肉芽組織病理變化圖（HE，×200）

2.4 各組大鼠潰瘍創(chuàng)面Cx26、Cx30、Cx43蛋白表達(dá)情況比較

干預(yù)12 d 后，模型組、紫草素組Cx26、Cx30、Cx43蛋白均低于假手術(shù)組（P< 0.05）；紫草素組Cx26、Cx30、Cx43蛋白表達(dá)高于模型組（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠潰瘍創(chuàng)面Cx26、Cx30、Cx43蛋白表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠潰瘍創(chuàng)面Cx26、Cx30、Cx43蛋白表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

組別假手術(shù)組模型組紫草素組Cx43 1.04±0.22 0.36±0.09a 0.65±0.18ab n 12 12 12 Cx26 1.05±0.21 0.24±0.08a 0.43±0.10ab Cx32 1.02±0.25 0.40±0.11a 0.74±0.23ab

2.5 各組大鼠大鼠潰瘍創(chuàng)面Cx26、Cx30、Cx43 mRNA相對表達(dá)比較

干預(yù)12 d 后，模型組、紫草素組Cx26、Cx30、Cx43 mRNA 低于假手術(shù)組（P< 0.05）；紫草素組Cx26、Cx30、Cx43 mRNA高于模型組（P<0.05）。見表3。

表3 各組大鼠潰瘍創(chuàng)面Cx26、Cx30、Cx43mRNA相對表達(dá)比較（±s）

表3 各組大鼠潰瘍創(chuàng)面Cx26、Cx30、Cx43mRNA相對表達(dá)比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

組別假手術(shù)組模型組紫草素組Cx43 0.98±0.17 0.43±0.11a 0.59±0.11ab n 12 12 12 Cx26 0.95±0.21 0.41±0.12a 0.65±0.17ab Cx30 1.02±0.09 0.48±0.10a 0.69±0.18ab

3 討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，慢性皮膚潰瘍屬“頑瘡”“潰瘍”“褥瘡”等范疇，相關(guān)記載最早可見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》。該病的病因無外乎內(nèi)傷、外感。內(nèi)傷或因飲食失節(jié)、勞力過度，外感多由各種原因造成的外傷和六淫之風(fēng)、寒、暑、濕、燥、火［6－7］。中醫(yī)學(xué)對慢性皮膚潰瘍的治療具有豐富的經(jīng)驗(yàn)，主張清創(chuàng)、控制感染、改善血供、促進(jìn)創(chuàng)面愈合等非手術(shù)治療手段［8］。

紫草是紫草科植物新疆紫草、紫草或內(nèi)蒙紫草的干燥根，具有活血涼血、解毒透疹的功效［9］，在血熱毒盛、麻疹、瘡瘍的治療中具有獨(dú)特的療效［10］。紫草及紫草制劑現(xiàn)已廣泛用于臨床治療，用于濕疹、皮炎、皮膚創(chuàng)面及黏膜損傷等多種炎癥性疾?。?1］。紫草素是從紫草中提取的主要成分，具有抗炎、殺菌等效果，也有研究證實(shí)其具有抗癌的作用［12］，常用于皮膚疾病的治療。

潰瘍創(chuàng)面愈合率是反映慢性皮膚潰瘍療效最直觀的證據(jù)［13］，在本次研究中，紫草素組干預(yù)7、12 d 后創(chuàng)面愈合率與模型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），證實(shí)其能夠有效促進(jìn)慢性皮膚潰瘍愈合，治療效果與重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子凝膠相當(dāng)。從潰瘍創(chuàng)面肉芽組織HE 染色中可以看出，紫草素組肉芽組織生長良好，炎性細(xì)胞浸潤減少，進(jìn)一步印證了紫草素對于慢性皮膚潰瘍的治療效果及其抗炎效果。

間隙連接是相鄰細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)和信息交換的跨膜蛋白通道［14］，主要由Cx構(gòu)成。營養(yǎng)物質(zhì)、代謝產(chǎn)物、分子量較小的親水性物質(zhì)等均可以通過間隙連接進(jìn)行交換［15］。間隙連接介導(dǎo)的細(xì)胞連接通訊是調(diào)控內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，細(xì)胞新陳代謝、增殖分化等生理過程的重要手段。Cx 基因也與多種皮膚病存在密切的聯(lián)系。Cx 的主要作用有細(xì)胞通道、電耦聯(lián)作用、調(diào)控細(xì)胞生長與分化及傳遞胚胎生長、發(fā)育中的細(xì)胞間信號(hào)［16］。Cx26、Cx30、Cx43是Cx家族的關(guān)鍵蛋白，其高水平表達(dá)說明細(xì)胞之間的信息和物質(zhì)交換加快，有利于創(chuàng)面的愈合。相關(guān)研究也證實(shí)，Cx43 對于皮膚傷口愈合的速度和質(zhì)量具有重要作用［17］。本次研究中，模型組、紫草素組Cx26、Cx30、Cx43 mRNA 和蛋白表達(dá)均低于假手術(shù)組，證實(shí)Cx26、Cx30、Cx43 在創(chuàng)面愈合中發(fā)揮了作用。紫草素組Cx26、Cx30、Cx43 mRNA 和蛋白表達(dá)均高于模型組，提示紫草素可能通過提高Cx 水平促進(jìn)潰瘍皮膚的愈合，提高治療效果。

本次研究不足之處在于未對紫草素劑量水平展開研究，日后將繼續(xù)補(bǔ)充相關(guān)研究。

綜上所述，紫草素治療慢性皮膚潰瘍大鼠效果明顯，其作用機(jī)制可能與提高間隙連接蛋白水平有關(guān)。