基于腸道菌群探討黃精水提物改善高脂高糖飲食所致大鼠認(rèn)知功能損傷的作用機(jī)制

王洋，韓玉生，趙福紅，宮銘海，周忠光?，楊波

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040；2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，黑龍江 齊齊哈爾 161000）

高脂高糖飲食已經(jīng)成為現(xiàn)代社會的主要飲食結(jié)構(gòu)。長期或過量高脂高糖飲食可誘導(dǎo)肥胖，出現(xiàn)葡萄糖穩(wěn)態(tài)失衡及血脂異常的代謝紊亂。同時，高脂高糖飲食還能夠破壞海馬形態(tài)、誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞炎癥改變并伴隨著認(rèn)知功能損傷［1］。已有研究表明高能量飲食會增加中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病率，如易感阿爾茨海默病［2］、帕金森病等［3］。

腸道微生物群特定物種豐度的變化與肥胖、代謝異常密切相關(guān)［4］，且腸道微生態(tài)失調(diào)會引發(fā)慢性低度炎癥［5］。脂多糖（LPS）是革蘭氏陰性菌外膜上最主要的成分，也被稱為內(nèi)毒素，是炎癥中主要的致病因子［6］。腸道微生物失衡對炎癥狀態(tài)的激活，部分是由腸道通透性改變介導(dǎo)的，大量LPS 聚集增加了腸道和血腦屏障的滲透性，在腸壁黏膜損傷環(huán)境下，LPS 可能“滲漏”到血液循環(huán)中，導(dǎo)致循環(huán)中LPS的濃度增加，從而刺激Toll 樣受體4（Toll－like－receptor 4，TLR－4），增加促炎細(xì)胞因子的濃度并導(dǎo)致多種炎癥性病變的發(fā)生［7］，亦可引起神經(jīng)炎癥、大腦神經(jīng)退行性樣改變［8］。TLR4/NF－κB信號通路是LPS介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路中最重要的下游通路［9］，可上調(diào)NLRP3炎癥小體的表達(dá)，分泌釋放出眾多內(nèi)源性生物活性炎癥因子，發(fā)揮其毒性作用［10］。因此，高脂高糖飲食誘導(dǎo)肥胖引起的腸道微生態(tài)失調(diào)和大腦神經(jīng)炎癥之間的聯(lián)系可能與認(rèn)知功能損傷有關(guān)。腸道菌群組成及其代謝產(chǎn)物調(diào)節(jié)宿主代謝、行為和認(rèn)知功能，與神經(jīng)炎癥、神經(jīng)退行性變的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，腸道菌群已成為防治疾病的新靶點(diǎn)。

黃精取自百合科植物滇黃精、黃精或多花黃精的干燥根莖，屬于藥食同源類中藥材。具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、健脾潤肺、益腎之功效，其主要化學(xué)成分包括黃酮類、皂苷類、多糖類、生物堿類化合物。大量研究證明，黃精具有廣泛的藥理學(xué)活性，包括抗炎［11］、抗衰老［12］、降血糖血脂［13］、免疫調(diào)節(jié)［14］、抗疲勞［15］及神經(jīng)保護(hù)［16］作用。本研究通過觀察黃精水提物對高脂高糖飲食誘導(dǎo)認(rèn)知功能損傷大鼠腸道微生物群、腸道黏膜屏障以及認(rèn)知行為的影響，評估黃精水提物是否能通過改變腸道微生物群而影響腸-腦軸相互作用，進(jìn)而改善高脂高糖大鼠認(rèn)知功能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF 級SD 雄性大鼠40 只，體質(zhì)量（200 ± 20）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號：SCXK（黑）2021－005。所有動物置于SPF 級動物實(shí)驗(yàn)室，溫度（22±2）℃，相對濕度50%～60%，12 h光照/黑暗環(huán)境，自由攝食、飲水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，正常對照組大鼠給予基礎(chǔ)飼料，造模大鼠給予高糖高脂飼料，主要成分包括63.5%基礎(chǔ)飼料，15%豬油，20%蔗糖，1.3%膽固醇，0.2%膽鹽。

1.2 藥品與試劑

水合氯醛（四川佰春科技有限責(zé)任公司，H37022603）；4%多聚甲醛固定液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：P0099）；2.5%戊二醛固定液（上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司，批號：DE0055）；大鼠脂多糖（LPS）ELISA 試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，批號：MM－0647R1）；TLR4 抗體、NF－κBp65 抗體、NLRP3抗體、Caspase－1抗體（萬類生物技術(shù)有限公司，批號：WL00196、WL02169、WL02635、WL03450）；羊抗兔IgG－HRP（萬類生物技術(shù)有限公司，批號：WLA023）；內(nèi)參抗體β－actin（萬類生物技術(shù)有限公司，批號：WL01372）；蘇木素、伊紅染色液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號：C0107、C0109）。

1.3 儀器

WMT－100S Morris 水迷宮視頻分析系統(tǒng)（成都泰盟軟件有限公司）；DZKW－S－4 型電熱恒溫水浴鍋（天津天泰儀器有限公司）；H1850 臺式高速離心機(jī)（北京宏達(dá)恒業(yè)科技有限公司）；梅特勒－托利多AB204－N 型電子天平（上海世義精密儀器有限公司）；VE－180 微型垂直電泳槽、VE－186 轉(zhuǎn)移電泳槽、5200 型化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀（上海天能科技有限公司）；HS－S7120－B型石蠟切片機(jī)（沈陽恒松科技有限公司）；BMG SPECTRO star Nano 高通量微孔板紫外分光光度計(jì)（香港伯齊科技有限公司）；透射電鏡（HITACHI，HT7700，Japan）。

1.4 黃精水提物的制備

多花黃精粉末500 g浸入2 L蒸餾水中浸泡1 h，煮沸后煨40 min，紗布過濾。將藥渣與1 L蒸餾水混合，煮沸后再煨40 min，再次紗布過濾。將2次獲得的藥液混合，混合濾液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中60 ℃濃縮至500 mL，最終生藥濃度為1 g/mL。

1.5 動物分組、造模及給藥

40只SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常對照組（Control 組）、模型組（Model 組）、黃精水提物低劑量組（HJL 組）和黃精水提物高劑量組（HJH組），每組10只。正常對照組大鼠自由進(jìn)食基礎(chǔ)飼料，其余組大鼠自由攝食高脂高糖飼料以建立認(rèn)知功能損傷模型，共喂養(yǎng)12 周。造模結(jié)束后各組大鼠開始行灌胃治療，每日上午HJL、HJH組大鼠分別給予1、1.5 g/kg黃精水提物灌胃，Control 組和Model 組大鼠給予生理鹽水灌胃，共干預(yù)6周。

1.6 標(biāo)本采集與處理

行為學(xué)檢測結(jié)束后，所有大鼠禁食水過夜，次日給予10%水合氯醛腹腔注射麻醉，麻醉起效后置于冰上操作，用手術(shù)直剪刀沿肋弓水平至雙側(cè)腋中線后，向上剪開后返起胸壁打開胸腔，鈍性剝離直至暴露心臟，心臟取血，于室溫靜置2 h 后，3 000 r/min 離心取上清，分裝后于－80 ℃保存。左心室內(nèi)灌注4 ℃預(yù)冷的PBS 緩沖液，眼科剪于右心耳處剪開一個小口，直至心臟流出無血色液體為止。斷頭取腦，剝離出完整腦組織，于左側(cè)大腦半球分離海馬組織，置于凍存管內(nèi)，迅速液氮冷凍，隨后轉(zhuǎn)移至－80 ℃冰箱保存，用于Western Blot 分析。右側(cè)大腦半球小心分離海馬CA1 區(qū)，取約1 mm3組織塊，置于2.5%戊二醛固定液中4 ℃固定，用于透射電鏡分析。取無糞便充盈的結(jié)腸組織，用生理鹽水沖洗干凈，置于4%多聚甲醛固定液中，4 ℃冰箱內(nèi)存放，待用。取結(jié)腸內(nèi)3～4粒糞便顆粒，放入無菌EP管中，立即速凍并于－80 ℃冰箱中低溫保存。

1.7 檢測指標(biāo)

1.7.1 行為學(xué)檢測

采用Morris 水迷宮（MWM）檢測大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，評估其認(rèn)知功能。MWM 使用黑色圓形水池（深度60 cm，直徑150 cm），將平臺固定于第二象限，水池中注入自來水，其水位高于平臺2 cm，水溫控制在22～24 ℃。將大鼠頭朝池壁放入水中，隨機(jī)選取入水點(diǎn)，檢測時間60 s。記錄大鼠找到水下平臺時間，如果60 s內(nèi)找到，則讓動物在平臺上停留10 s休息，若未找到平臺，則引導(dǎo)動物到平臺，停留10 s。每只動物每日訓(xùn)練3次，每次訓(xùn)練間隔15～20 min，連續(xù)4 d。視頻跟蹤系統(tǒng)記錄動物位置、游泳距離及時間。最后一次訓(xùn)練結(jié)束后第2天，撤除平臺，將動物由原先平臺象限的對側(cè)放入水中，記錄動物在60 s內(nèi)穿越原平臺象限潛伏期、次數(shù)、總路徑和平均速度等。以此作為檢測動物空間學(xué)習(xí)、記憶能力指標(biāo)。

1.7.2 體質(zhì)量監(jiān)測從造模開始直至大鼠灌胃結(jié)束，每周稱重1 次，記錄其體質(zhì)量變化，以此調(diào)整藥物灌胃劑量。

1.7.3 血清生化指標(biāo)檢測

采用己糖激酶法檢測血清葡萄糖（GLU）含量，酶比色法檢測血清總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL－C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL－C）含量，比色法檢測血清甘油三酯（TG）含量，采用全自動生化分析儀進(jìn)行測定。

1.7.4 組織形態(tài)學(xué)觀察

各組大鼠結(jié)腸經(jīng)過固定、梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋后制作成蠟塊。切片機(jī)制備5 μm結(jié)腸組織切片，進(jìn)行蘇木素－伊紅（HE）染色，在光學(xué)顯微鏡下詳細(xì)觀察結(jié)腸組織病理變化。

大鼠海馬組織經(jīng)過1%鋨酸/1.5%亞鐵氰化鉀后固定，PBS漂洗，梯度酒精-丙酮脫水，無水丙酮及環(huán)氧樹脂618 包埋劑浸透，包埋，修塊，超薄切片機(jī)切100 nm組織切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛染色，于透射電鏡下觀察并攝片。

1.7.5 血清及糞便LPS測定

采用ELISA 法檢測血清中及糞便中LPS 的濃度水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，最終于562 nm 處測量吸光度值，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。

1.7.6 糞便16s RNA測序

從每個糞便樣本中提取DNA，之后PCR 擴(kuò)增。針對細(xì)菌16s rRNA 的V3～V4 區(qū)設(shè)計(jì)引物，利用正向引物（5′－3′）：CCTACGGGNGGCWGCAG（341 F）和反向引物（5′－3′）：GACCTACHVGGGTATCTAATCC（806 F）擴(kuò)增，繼而通過Illumina PE250測序平臺進(jìn)行測序和數(shù)據(jù)處理，后續(xù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1.7.7 蛋白免疫印跡法（Western Blot 法）檢測大鼠海馬TLR4、NF－κBp65、NLRP3、Caspase－1 蛋白的表達(dá)

取大鼠海馬組織樣本約0.2 g，用RIPA 裂解液、PMSF 及磷酸化蛋白酶抑制劑提取總蛋白。取蛋白質(zhì)40 μg 進(jìn)行SDS－PAGE 凝膠電泳，利用PVDF 膜轉(zhuǎn)膜。經(jīng)過BSA 封閉后，一抗β－actin（1∶1 000）、TLR4（1∶500）、P－NF－ κBp65（1∶500）、NLRP3（1∶500）、Caspase－1（1∶500），4 ℃孵育過夜，經(jīng)漂洗、二抗孵育后，ECL 發(fā)光顯色，系統(tǒng)成像。采用Image J 進(jìn)行蛋白條帶灰度值定量分析。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Graphpad Prism 8軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值± 標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean ± SEM）表示。組間差異采用One－way ANOVA 方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃精水提物對高脂高糖飲食大鼠體質(zhì)量的影響

造模前，各組大鼠體質(zhì)量無明顯差異。喂食高脂高糖飼料后，大鼠體質(zhì)量逐漸增加，發(fā)展為肥胖大鼠。隨喂養(yǎng)時間的延長，其體質(zhì)量明顯增加，肥胖情況更加突出（P<0.05 或P<0.01），見圖1。給予6 周黃精水提物干預(yù)治療后，在干預(yù)期內(nèi)觀察到，在不影響能量攝入的情況下，HJL、HJH 組大鼠體質(zhì)量增幅低于Model 組大鼠，并呈劑量依賴性，提示黃精水提物可以有效抑制高脂高糖飲食所致的大鼠體質(zhì)量增加，見圖2。

圖1 不同時間點(diǎn)各組大鼠體質(zhì)量變化圖

圖2 各組大鼠體質(zhì)量變化圖

2.2 黃精水提物對高脂高糖飲食大鼠血糖、血脂水平的影響

與Control 組比較，Model 組大鼠血清中GLU 含量明顯升高（P< 0.01），給予黃精水提物干預(yù)后，HJH組及HJL 組大鼠血清GLU 含量有所降低（P< 0.05 或P< 0.01），但未恢復(fù)至正常范圍內(nèi)。結(jié)果表明黃精水提物對高脂高糖飲食誘導(dǎo)大鼠葡萄糖穩(wěn)態(tài)失衡具有一定調(diào)節(jié)作用。與Control 組相比，Model 組大鼠血清TC、TG、LDL－C 含量升高（P< 0.05 或P< 0.01），HDL－C 含量顯著下降（P< 0.01），提示高脂高糖飲食可導(dǎo)致大鼠血脂紊亂。經(jīng)黃精水提物干預(yù)后大鼠血清中TC 下降，HJH 組更為顯著（P< 0.01）。與Model 組相比，HJH 組大鼠TG、LDL－C 水平明顯降低（P< 0.05）。結(jié)果表明，黃精水提物可以通過下調(diào)甘油三酯及游離脂肪酸水平改善高脂高糖大鼠血脂代謝紊亂。見圖3。

圖3 各組大鼠血糖、血脂水平比較

2.3 黃精水提物對高脂高糖飲食大鼠認(rèn)知功能損傷的影響

Mirros 水迷宮是用于評價動物空間學(xué)習(xí)記憶能力的行為學(xué)檢測方法，可通過不同模式評價動物的參考記憶和工作記憶能力［17］，并以此評估其認(rèn)知功能。造模結(jié)束后對大鼠行Mirros水迷宮測試。定位航行測試中，與正常飲食組相比，高脂高糖飲食大鼠前4 d 訓(xùn)練中潛伏期明顯延長（P<0.05或P<0.01）；第5天水迷宮空間探索中，第一次穿越平臺時間明顯延長（P<0.01），穿越平臺次數(shù)減少（P<0.05），見表1。提示高脂高糖飲食大鼠12 周時表現(xiàn)出參考記憶和工作記憶受損。經(jīng)黃精水提物干預(yù)后再次進(jìn)行評價，與Model組相比，HJH 組、HJL 組前4 d 潛伏期明顯縮短（P<0.01，P< 0.05）；HJH 組、HJL 組大鼠第一次穿越平臺所在象限時間均明顯縮短（P< 0.01），HJH 組大鼠穿越平臺次數(shù)明顯增加（P< 0.01），見表2。結(jié)果提示，黃精水提物具有改善高脂高糖飲食所致大鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退、提高認(rèn)知功能的作用。

表1 不同時間點(diǎn)高脂高糖大鼠認(rèn)知功能評價比較（±s）

表1 不同時間點(diǎn)高脂高糖大鼠認(rèn)知功能評價比較（±s）

注：與正常飲食組相比，#P<0.05，##P<0.01。

組別正常飲食組高脂高糖組穿越平臺次數(shù)（次）3.17±1.72 1.00±0.63#n 10 30第1天（s）53.50±9.18 55.30±4.63##第2天（s）44.50±10.10 50.20±6.91第3天（s）33.80±4.79 45.10±9.68#第4天（s）23.20±9.08 40.30±7.18##第一次穿越平臺時間（s）14.20±8.61 42.20±7.31##

表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)認(rèn)知功能情況比較（±s）

表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)認(rèn)知功能情況比較（±s）

注：與Control組相比，##P<0.01；與Model組相比，*P<0.05，**P<0.01。

組別Control組Model組HJL組HJH組穿越平臺次數(shù)（次）4.16±1.16 0.83±0.75##2.00±0.89*2.83±1.17**n 10 10 10 10第1天（s）39.70±7.39 57.90±4.42##47.70±8.73*42.50±7.56**第2天（s）33.40±9.37 55.10±9.61##44.60±10.40 36.30±10.80**第3天（s）25.00±7.04 51.90±8.92##38.80±11.2*27.30±7.84**第4天（s）17.80±4.83 47.80±6.84##29.30±7.84**26.20±6.30**第一次穿越平臺時間（s）10.50±3.39 33.20±5.91##16.10±4.35**15.60±4.84**

2.4 黃精水提物對高脂高糖飲食大鼠血清及糞便中LPS的影響

高脂高糖飲食引起的腸-腦軸病理改變與循環(huán)血液中LPS 水平的增加有關(guān)。LPS 是高度促炎因子，會加重肥胖期間體內(nèi)的炎癥狀態(tài)，觸發(fā)全身性炎癥性疾?。?8］。如圖4 所示，與Control 組相比，Model 組大鼠血清、糞便中LPS 含量均顯著升高（P<0.01）。與Model組相比，黃精水提物給藥組LPS 含量顯著降低（P<0.01），呈現(xiàn)劑量依賴性降低。推測高脂高糖飲食可能改變了大鼠腸道菌群多樣性，并導(dǎo)致腸道黏膜屏障受損，腸道菌群代謝物釋放大量LPS，通過受損的腸壁進(jìn)入循環(huán)血液中，促使循環(huán)中LPS 的高水平表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明黃精水提物能夠以劑量依賴的方式有效降低高脂高糖飲食大鼠腸道內(nèi)和循環(huán)中的LPS水平。

圖4 黃精水提物對高脂高糖大鼠糞便及血清中LPS含量的影響

2.5 黃精水提物對高脂高糖飲食大鼠腸道菌群的影響

通過Illumina PE 250 測序評價黃精對高脂高糖大鼠腸道菌群的影響。總共1 731 個OTUs 中，4 組樣本共享119 個OTUs。Model 組與Control 組總共1 075 個OTUs，共享185個OTUs；HJH組與Control組共1 289個OTUs，共享325 個OTUs；HJL 組與Control 組共1 218個OTUs，共享有263個OTUs。提示HJH組與正常組大鼠腸道菌群物種相似度更高。見圖5。

圖5 各組大鼠腸道菌群OTUs交叉情況

腸道菌群的LEFSe分析可以提供樣品組間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的生物標(biāo)志物，見圖6。通過LDA 值分布圖顯示，Control、Model、HJH、HJL 組中分別具有45、11、7、12 個顯著差異的微生物物種分類群。其中，Model組中變形菌門Pseudochelatococcus、Helicobacter 屬及擬桿菌門的Alloprevotella屬是特異微生物群。

圖6 各組大鼠腸道菌群LEFSe分析結(jié)果

在各組大鼠腸道菌群樣本中共16 個門，其中核心微生物群主要集中在厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacterioidetes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）中，見圖7。Metastates分析提示Model組的擬桿菌門菌群數(shù)量增加，而厚壁菌門及放線菌門菌群數(shù)量減少，HLH、HJL 組增加了擬桿菌門菌群豐度。厚壁菌門/擬桿菌門（F/B）是微生物發(fā)酵的能量產(chǎn)出指標(biāo)之一［19］。Control、Model、HJL、HJH 組中F/B 比值分別為10.9、2.6、11.7、12.1，提示黃精水提物可以有效降低高脂高糖飲食大鼠擬桿菌門豐度，逆轉(zhuǎn)厚壁菌門/擬桿菌門比值，調(diào)節(jié)大鼠大腸菌群的平衡。

圖7 各組大鼠腸道菌群門水平的相對豐度

2.6 黃精水提物對高脂高糖飲食大鼠腸道黏膜屏障作用的影響

HE染色結(jié)果顯示，正常組大鼠黏膜層、黏膜下層、肌層、漿膜層完整，黏膜層腺體排列整齊，覆蓋大量絨毛，未見炎細(xì)胞浸潤及增生。Model組可見部分黏膜腺體管腔變小、萎縮，腺體間距增大，腺體底部與肌層距離增大；部分上皮細(xì)胞變性壞死，伴有大量炎細(xì)胞浸潤。給予黃精水提物干預(yù)后，上述病理改變均有不同程度的改善，見圖8。結(jié)果提示，高糖高脂飲食可造成大鼠結(jié)腸黏膜腺體損傷、炎性改變、腸道屏障功能受損；黃精水提物可以較好地改善高脂高糖飲食大鼠結(jié)腸黏膜腺體形態(tài)，減少炎細(xì)胞浸潤，有助于恢復(fù)腸道屏障功能。也有相關(guān)研究證實(shí)，單純高脂飲食動物的腸道屏障功能會受到損傷，這可能與炎癥反應(yīng)激活相關(guān)［20］。故本研究中黃精水提物對高脂高糖大鼠的腸道黏膜具有保護(hù)、修復(fù)作用。

圖8 黃精水提物對高脂高糖大鼠結(jié)腸黏膜病理形態(tài)的影響（HE，×200）

2.7 黃精水提物對高脂高糖飲食大鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu)的影響

Control 組大鼠可見神經(jīng)細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞膜及核膜界限清晰，細(xì)胞核清楚，胞質(zhì)中線粒體無腫脹、無空泡，突觸結(jié)構(gòu)豐富。Model 組可見神經(jīng)元排列紊亂，細(xì)胞膜及核膜界限不清，部分細(xì)胞核固縮，胞漿中線粒體腫脹，出現(xiàn)空泡，突觸數(shù)目明顯減少。HJH 組及HJL組可見神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，雙膜界限基本清楚，細(xì)胞核基本清晰，胞漿中個別線粒體輕微腫脹，HJH組未見空泡樣變性，突觸結(jié)構(gòu)尚可。見圖9。從各組海馬的病理形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果看出，長期高糖高脂飲食誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥損傷大鼠海馬組織的神經(jīng)細(xì)胞，黃精水提物能有效改善神經(jīng)細(xì)胞病理損害。

圖9 各組大鼠海馬組織超微結(jié)構(gòu)情況

2.8 黃精水提物對高脂高糖飲食大鼠海馬組織TLR4/NF－κB炎癥信號通路相關(guān)蛋白的影響

為研究高脂高糖飲食大鼠腸道內(nèi)毒素LPS誘導(dǎo)腦內(nèi)促炎細(xì)胞因子表達(dá)的機(jī)制，通過Western Blot法檢測了腦內(nèi)NF－κB 信號通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，見圖10。與Control 組 相比，Model 組TLR4、NF－κBp65（Pp65）、NLRP3 蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P< 0.01）。與Model 組相比，HJH、HJL 組均可降低高脂高糖大鼠海馬組織TLR4、P－p65、NLRP3 蛋白表達(dá)量（P<0.01）。各組大鼠海馬組織中Caspase－1 蛋白表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖10。提示黃精水提物能夠降低高脂高糖飲食大鼠海馬組織中LPS誘發(fā)的TLR4/NF－κB炎癥信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)。

圖10 黃精水提物對高脂高糖大鼠海馬組織中TLR4、p－p65、NLRP3、Caspase－1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

隨著現(xiàn)代生活水平的提高，高脂高糖飲食結(jié)構(gòu)已經(jīng)成為影響人類健康的隱形殺手。長期高能量膳食使機(jī)體熱量攝入代謝失衡，造成脂肪堆積，誘發(fā)肥胖癥以及糖、脂代謝類疾病［21］。從代謝－神經(jīng)認(rèn)知功能障礙的角度來看，肥胖本身和肥胖引起的代謝紊亂等因素的改變可以影響認(rèn)知，在認(rèn)知功能損傷的早期就起到關(guān)鍵的作用［22］。本實(shí)驗(yàn)中顯示，高脂高糖飲食誘導(dǎo)的大鼠體質(zhì)量、血糖、血脂相關(guān)指標(biāo)升高，存在肥胖狀態(tài)及糖、脂代謝異常，而黃精水提物對高脂高糖飲食所致大鼠代謝改變具有一定調(diào)節(jié)作用。

腸道微生態(tài)是近年來生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)。腸－腦軸是腸道與中樞神經(jīng)系統(tǒng)之間對話機(jī)制的重要節(jié)點(diǎn)。機(jī)體腸道環(huán)境包括腸道組織細(xì)胞、附著于腸壁上的黏膜層和定植在腸腔內(nèi)的腸道微生物群［23］。腸道微生物在宿主體內(nèi)受到遺傳和環(huán)境因素影響表現(xiàn)出個體差異性，除宿主遺傳基因組的固定因素外，腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成和功能多樣性往往處于動態(tài)變化。環(huán)境因素中，飲食在調(diào)節(jié)腸道菌群組成和功能方面起著關(guān)鍵作用［24］。有研究證實(shí)高脂肪飲食增加了擬桿菌門的種群數(shù)量，同時降低了厚壁菌門和放線菌門的種群數(shù)量［25］。這與筆者實(shí)驗(yàn)中高脂高糖模型大鼠腸道菌群檢測結(jié)果相似。高能量飲食被認(rèn)為是導(dǎo)致腸道微生態(tài)失調(diào)及腸壁屏障作用減弱的主要原因，一方面飲食誘導(dǎo)腸道某些革蘭氏陰性菌的增殖，其代謝產(chǎn)物中釋放的內(nèi)毒素增加，引發(fā)腸壁局部炎癥，導(dǎo)致腸壁通透性增加；另一方面會減少腸道內(nèi)可以有效降低LPS水平、改善腸道屏障功能有益菌如雙歧桿菌［26－27］。故高脂高糖飲食通過改變腸道微生物群和損害腸道屏障功能，導(dǎo)致LPS 泄漏，從而增加循環(huán)中的LPS 水平，使機(jī)體處于低度慢性炎癥狀態(tài)。在本研究中證實(shí)高脂高糖飲食大鼠腸道內(nèi)容物中及循環(huán)血液中LPS升高。腸道菌群產(chǎn)生的內(nèi)毒素等有害代謝產(chǎn)物會影響血腦屏障（BBB）的通透性，有毒物質(zhì)進(jìn)入腦內(nèi)誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活和神經(jīng)元凋亡，形成神經(jīng)炎癥，導(dǎo)致記憶缺陷和認(rèn)知功能損傷，這也是AD 等神經(jīng)退行性疾病重要的致病因素［28］。本研究中，在12 周的高糖高脂飲食喂養(yǎng)下，大鼠開始出現(xiàn)空間記憶和學(xué)習(xí)障礙，表現(xiàn)為認(rèn)知能力下降。實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃精水提物可以抑制腸道炎癥、改善腸黏膜而發(fā)揮屏障保護(hù)作用，并且調(diào)控腸道菌群，調(diào)節(jié)菌群多樣性及其豐度，降低代謝性內(nèi)毒素水平。

Toll 樣受體4（Toll－like－receptor 4，TLR4）是一種脂多糖受體，是介導(dǎo)多種炎癥通路的重要分子，其在腦內(nèi)小膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中表達(dá)，識別LPS 后通過激活NF－κB 信號通路參與炎癥介質(zhì)的釋放［29］。NF－κB是一種多效性轉(zhuǎn)錄因子，它可以調(diào)控參與炎癥反應(yīng)的基因，并刺激多種細(xì)胞信號通路，導(dǎo)致炎癥因子的產(chǎn)生增加。在人類第22、48 號染色體上存在NF－κB 結(jié)合位點(diǎn)，由5 個成員組成：NF－κB－1（p50）、NF－κB－2（p52）、Rel－A（p65）、Rel－B 和c－Rel。只有p65 和c－Rel 是有效的轉(zhuǎn)錄激活因子。經(jīng)LPS 刺激后，NF－κB 信號通路通過IκBα 磷酸化而激活，導(dǎo)致p65 的核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而啟動炎癥相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)［30］。故抑制NF－κB 介導(dǎo)的細(xì)胞和分子過程可能為神經(jīng)炎癥相關(guān)的神經(jīng)疾病提供一個潛在的靶點(diǎn)。活化的NF－κB 進(jìn)一步上調(diào)NLRP3的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，高水平的NLRP3 mRNA 是形成有效炎癥小體的關(guān)鍵［31］。NLRP3 炎癥小體包括含NLR 家族PYRIN 域蛋白3（NOD－，LRR－and pyrin domaincontaining 3，NLRP3）、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis associated speck－like protein，ASC）和胱冬肽酶－1（Caspase－1）［32］。NLRP3 炎癥小體在神經(jīng)炎癥反應(yīng)發(fā)生中發(fā)揮著關(guān)鍵介導(dǎo)作用。本研究采用的黃精水提物可干預(yù)高脂高糖飲食大鼠腦內(nèi)上調(diào)的TLR4/NF－κB炎癥信號通路及NLRP3 炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)，從而阻斷炎性信號通路的激活，抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，改善認(rèn)知功能損傷。

本研究中黃精水提物能夠改善高脂高糖飲食所致大鼠認(rèn)知損傷的作用機(jī)制可能與改變腸道菌群結(jié)構(gòu)及多樣性、保護(hù)腸道屏障功能、抑制LPS生成有關(guān)以及改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥有關(guān)。但其機(jī)制仍不完善，值得進(jìn)一步研究。