花生分離蛋白酶解物對(duì)雞肉肌原纖維蛋白流變性的影響

許時(shí)慧，陳金玉*，關(guān)文強(qiáng)*，張穎璐，張坤生，耿亞鑫，胡方洋，鄧金香，宋健臣

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134；2.天津二商迎賓肉類食品有限公司，天津 300385）

近年來(lái)雞肉產(chǎn)能增加，市場(chǎng)供應(yīng)充足，而且價(jià)格低廉[1]，其中雞胸肉又以高蛋白、高營(yíng)養(yǎng)及低膽固醇等特點(diǎn)著稱，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。在雞胸肉中起主要作用的蛋白質(zhì)是肌原纖維蛋白（myofibrillar protein，MP），MP約占肉中蛋白的55%[2]，對(duì)肉的質(zhì)地、脂肪、香氣及色澤有很重要的影響[3]，肌原纖維蛋白的流變性及凝膠性質(zhì)是影響肉質(zhì)的重要原因，是影響加工性能的一個(gè)重要指標(biāo)[4-6]，也是決定肉制品品質(zhì)的關(guān)鍵因素。

利用植物蛋白來(lái)改善肌原纖維蛋白的功能性質(zhì)，從而豐富肉制品種類并提高其品質(zhì)是當(dāng)前的熱點(diǎn)。如常用的大豆分離蛋白不但能增強(qiáng)產(chǎn)品質(zhì)構(gòu)及持水性[7]、節(jié)約生產(chǎn)成本還可促進(jìn)環(huán)境友好發(fā)展?；ㄉ蛛x蛋白（peanut protein isolate，PPI）也是常用的優(yōu)質(zhì)蛋白。我國(guó)的花生種植面積廣、產(chǎn)量高[8]，是重要的經(jīng)濟(jì)作物。花生含有多種生物活性[9]，能用作穩(wěn)定劑改善食品感官[10]，將其添加到碎肉、塊肉和仿肉等肉制品中可以充當(dāng)營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑、抗氧化劑等，能彌補(bǔ)加工過(guò)程營(yíng)養(yǎng)損失[11]。但是天然的PPI凝膠成形能力較弱，對(duì)MP的加工性質(zhì)、組織結(jié)構(gòu)沒(méi)有明顯的促進(jìn)作用[12]，而將PPI酶解，會(huì)得到由蛋白質(zhì)、小分子肽、氨基酸、糖和脂肪等物質(zhì)組成的酶解產(chǎn)物[13]，這一過(guò)程會(huì)使花生蛋白分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)、內(nèi)部疏水基團(tuán)暴露，花生蛋白分子間疏水相互作用增強(qiáng)，能促進(jìn)其形成凝膠[14-15]。本試驗(yàn)擬將PPI酶解物與MP相結(jié)合，探究PPI酶解物與MP的相互作用，以期為二者的加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雞胸肉（冷藏）：市售；花生分離蛋白：上海源葉生物科技有限公司；NaH2PO4（分析純）、NaCl（分析純）、乙二胺四乙酸[（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），分析純]、無(wú)水乙醇（分析純）：天津市贏達(dá)?；瘜W(xué)試劑廠；堿性蛋白酶（200 U/g）、木瓜蛋白酶（2 000 U/g）、中性蛋白酶（4 800 U/g）：丹麥諾維信有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼[（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH），分析純]、牛血清蛋白（bovine serum albumin,BSA）：美國(guó)Sigma公司；鹽酸（分析純）：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；MgCl2（分析純）：天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠；三聚磷酸鈉（分析純）：天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所。

1.2 試驗(yàn)儀器

SMSTA TA.XT plus質(zhì)構(gòu)儀：英國(guó)Stable MicroSystems公司；Physica MCR301高級(jí)旋轉(zhuǎn)流變儀：奧地利安東帕公司；HW-S24型電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FA2004A電子天平、FD-5N型真空冷凍干燥機(jī)：日本EYELA公司；H1650－W臺(tái)式高速離心機(jī)、H185臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)：長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；IKA T10高速組織勻漿機(jī)：德國(guó)IKA公司；KQ-250B型超聲波清洗機(jī)：昆山市超聲儀器有限公司；EL20型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花生分離蛋白酶解物的制備方法

取一定量的花生分離蛋白，加入適量去離子水，配制3組蛋白質(zhì)量濃度5%的花生蛋白液，分別加入底物濃度3%的堿性蛋白酶、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶，于各自的最適酶解條件下酶解3 h[13]，使用1 mol/L NaOH溶液和1 mol/L HCl溶液維持體系pH值穩(wěn)定，待反應(yīng)結(jié)束后，用沸水加熱10 min滅酶，冷卻至室溫25℃左右，以4 000 r/min離心20 min，棄沉淀收集上清液即為酶解液，進(jìn)行真空冷凍干燥，最終得到酶解產(chǎn)物粉末。

1.3.2 酶解液的超濾分離

按1.3.1的方法制得花生蛋白酶解液，通過(guò)UF超濾膜（截留分子量為3 kDa）進(jìn)行超濾，在25℃下以4 500 r/min離心30 min，收集下層濾液（截留分子量<3 kDa），確定酶解物的分子量。

1.3.3 提取MP

MP的提取參考胡方洋等[16]和Chen等[17]的方法，將雞胸肉及提取液（0.002 mol/L MgCl2、0.1 mol/L NaCl、0.001 mol/L EDTA、0.1 mol/L Na2HPO4pH=7）從 4℃冰箱取出，洗凈切成肉糜狀，用4倍體積的MP提取液[0.002 mol/L MgCl2、0.1 mol/L NaCl、0.001 mol/L EDTA、0.1 mol/L Na2HPO4（pH=7）]高速勻漿（8 000 r/min），充分混勻，在4℃、4 500 r/min條件下離心20 min，取沉淀，重復(fù)離心3次，再向所得沉淀中加入4倍體積的0.1 mol/L NaCl溶液，與上述相同的離心條件下重復(fù)離心3次，棄上清液，最后沉淀即為MP（4℃冷藏，需7 d內(nèi)用完）。

1.3.4 PPI酶解物與MP共混體系的制備

將1.3.1得到的酶解產(chǎn)物凍干粉以不同的添加量與MP進(jìn)行復(fù)配，添加量分別為0%、2%、4%、6%、8%、10%，用0.1 mol/L NaCl制備成20 mg/mL的蛋白溶液，利用勻漿機(jī)中速攪拌30 s，控制溫度不超過(guò)室溫25℃，測(cè)定其流變學(xué)特性。

1.3.5 共混凝膠的制備

分別將1.3.1制得的堿性蛋白酶、中性蛋白酶及木瓜蛋白酶酶解物的凍干粉以 0%、2%、4%、6%、8%、10%的比例與MP混合，用0.1 mol/L NaCl制備成40 mg/mL[18]的蛋白溶液，放入水浴鍋從20℃開(kāi)始升溫，升溫至75℃，保持10 min，加熱結(jié)束后用碎冰快速冷卻，放入4℃冰箱12 h后取出備用。

1.3.6 流變學(xué)的測(cè)定

1.3.6.1 剪切稀化的測(cè)定

分別取不同比例的適量樣品（按1.3.4制備的PPI堿性蛋白酶酶解物、中性蛋白酶酶解物及木瓜蛋白酶酶解物與MP共混體系）置于流變儀的測(cè)定平臺(tái)上，選用PP 50（直徑為25 mm）的錐板模具，恒定溫度24℃，測(cè)定樣品的表觀黏度（η）在剪切速率（γ）從0.01 s-1～300 s-1遞增過(guò)程中的變化。

1.3.6.2 動(dòng)態(tài)溫度剪切掃描

參考Chen等[19]的方法將制備好不同組分與比例的樣品取3 mL置于流變儀測(cè)定平臺(tái)上，選用P/0.5的探頭，板間距1 mm，振幅1 Pa，頻率固定為1 Hz，溫度從20℃升至90℃，再?gòu)?0℃降至20℃，記錄溫度變化過(guò)程中儲(chǔ)能模量G′、損耗模量G″的變化，繪制曲線。

1.3.7 質(zhì)構(gòu)性質(zhì)的測(cè)定

將1.3.5制備的共混凝膠置于質(zhì)構(gòu)儀測(cè)試臺(tái)面進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定參數(shù)：探頭P/0.5、測(cè)前速度1.0 mm/s、測(cè)試速度1.0 mm/s、測(cè)后速度1.0 mm/s、觸發(fā)力為5 g、壓縮比40%，測(cè)試中的最大力即為破斷強(qiáng)度，對(duì)應(yīng)的壓縮距離為凹陷深度，凝膠強(qiáng)度等于二者的乘積[20]，測(cè)定一次重新?lián)Q一個(gè)測(cè)量位置，每個(gè)樣測(cè)3次，每組3個(gè)平行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007、Origin 8.5對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析及繪圖。每個(gè)試驗(yàn)平行3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解物成分分析

酶解物成分分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 PPI酶解物成分組成Table 1 Composition of PPI hydrolysate

采用超濾離心管對(duì)制備的PPI酶解物進(jìn)行膜超濾分離，得到了2種分子量組成的抗氧化肽。由表1可知，中性蛋白酶酶解物的級(jí)分I占24.18%，級(jí)分II占85.82%；堿性蛋白酶酶解物的級(jí)分I占32.33%，級(jí)分II占67.67%，級(jí)分II比級(jí)分I占比多；木瓜蛋白酶酶解物的級(jí)分I占54.27%，級(jí)分II占45.37%。

2.2 不同酶解物對(duì)MP功能的影響

2.2.1 對(duì)流變學(xué)性質(zhì)的影響

2.2.1.1 剪切稀化現(xiàn)象

混合體系的表觀黏度剪切速率的變化見(jiàn)圖1。

圖1 不同的花生蛋白酶解物與肌原纖維蛋白共混體系的剪切稀化現(xiàn)象Fig.1 Shear thinning of different peanut protein hydrolysates and myofibrillar protein blends

由圖1可知，隨著剪切速率在0～300 s-1逐漸增加，表觀黏度先快速降低而后趨于平緩，添加PPI及其不同酶解物與MP組成的溶液均隨剪切速率的增大而降低，存在剪切稀化現(xiàn)象，屬于非牛頓流體[21]。而添加PPI酶解物后，共混溶液的表觀黏度均增大。原因可能是因?yàn)楣不祗w系間的分子間作用力增強(qiáng)，緊密連接，阻礙了其流動(dòng)速度，對(duì)混合液施加剪切力后，破壞了MP分子與改性酶解物小分子之間的纏繞，分子間氫鍵斷裂，作用力越大破壞效果越明顯，從而表現(xiàn)出表觀黏度減小；當(dāng)未施加剪切力時(shí)，中性蛋白酶解PPI/MP共混體系的表觀黏度增大梯度較明顯，當(dāng)剪切力增大到一定值后，共混體系間的分子無(wú)法重新取向，此時(shí)表觀黏度維持在一個(gè)穩(wěn)定范圍[22]，趨近于一個(gè)常數(shù)。

還可看出，在沒(méi)有剪切速率的影響下，添加了PPI或其酶解物的表觀黏度均明顯高于未添加，而且隨著酶解PPI的添加量的增加，呈現(xiàn)先增大后減小的特點(diǎn)，其中在添加量為4%時(shí)最大，而直接加入PPI會(huì)降低體系的黏度，說(shuō)明PPI酶解物在一定添加量下能增加混合體系的黏度，這可能與PPI酶解后性質(zhì)改變有關(guān)。如抗氧化作用的增加可能會(huì)使MP的分子形態(tài)更加緊致，而酶解后蛋白分解成氨基酸與MP分子作用范圍更加全面，使共混體系不易流動(dòng)變形；表觀黏度會(huì)隨著添加量的增加而減弱之后平緩，這可能是因?yàn)榈鞍字g的結(jié)合作用已經(jīng)被完全破壞，不會(huì)再出現(xiàn)新的變化。

2.2.1.2 溫度掃描分析

混合體系的儲(chǔ)能模量隨溫度的變化見(jiàn)圖2。

圖2 不同的花生蛋白酶解物與肌原纖維蛋白共混體系的儲(chǔ)能模量Fig.2 Storage modulus of the blend system of different peanut proteolysis products and myofibril protein

G′的變化用于檢測(cè)食品的凝膠化[23]。G′表示凝膠結(jié)構(gòu)中由彈性變形量變化而引起的能量變化[24]。由圖2可知，測(cè)定溫度變化范圍是20℃～90℃～20℃，G′在45℃～55℃時(shí)開(kāi)始緩慢增加，凝膠網(wǎng)絡(luò)開(kāi)始初步形成，部分肌球蛋白的頭部開(kāi)始變性并交聯(lián)形成松散的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[25]；當(dāng)溫度高于55℃后，G′開(kāi)始下降，肌球蛋白尾部開(kāi)始變性，尾部超螺旋結(jié)構(gòu)解旋會(huì)破壞前期形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[26]；當(dāng)溫度在63℃～90℃之間，G′開(kāi)始重新上升，由于共價(jià)二硫鍵和疏水相互作用而形成永久性不可逆交聯(lián)的肌球蛋白絲[27]，當(dāng)溫度下降時(shí)，凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)增強(qiáng)，G′急劇上升，可能是酶解物與MP會(huì)通過(guò)非共價(jià)相互作用單獨(dú)重新分配和形成凝膠。

其中在50℃～60℃之間，添加PPI酶解物的MP溶液的G′先增大后減小，可能是肌球蛋白尾部的變性被抑制，之前的網(wǎng)狀凝膠結(jié)構(gòu)不會(huì)輕易被破壞；在降溫階段，PPI酶解物/MP共混體系相較PPI/MP共混體系的G′均有明顯增大，表明PPI酶解產(chǎn)物對(duì)MP的結(jié)構(gòu)有促進(jìn)作用，提高G′的作用優(yōu)于PPI，在添加量為4%時(shí)增強(qiáng)效果最大。

混合體系的損耗模量隨溫度的變化見(jiàn)圖3。

圖3 不同的花生蛋白酶解物與肌原纖維蛋白共混體系的損耗模量Fig.3 Loss modulus of the blend system of different peanut proteolysis products and myofibril protein

G″表示加熱過(guò)程中黏性的變化，表示物質(zhì)受到外力作用時(shí)的變形程度[28]，可以反映MP結(jié)構(gòu)的折疊和聚集[24]。圖2和圖3中G′和G″的變化趨勢(shì)相似，添加花生分離蛋白和酶解后的PPI均改變了MP原本的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，酶解后的PPI改變作用更加明顯，原因可能是PPI酶解后產(chǎn)生的活性多肽改變了MP的氧化能力，影響其G″的變化。在升溫階段50℃～60℃出現(xiàn)一次最大值，然后快速下降，繼續(xù)加熱，G″緩慢上升。在降溫階段，隨著溫度的降低G″急劇增加，在相同的溫度下，PPI及其酶解物在添加量為4%時(shí)增幅最大，與G′的變化重合。在堿性蛋白酶解PPI與MP共混體系中，酶解物添加量為10%的情況下，對(duì)MP的G″的作用最小；在木瓜蛋白酶解PPI與MP共混體系與中性蛋白酶解PPI與MP共混體中，酶解物添加量從2%～4%G″逐漸增加，超過(guò)4%之后，隨著添加量的增加而逐漸降低，但3種酶解物均增加了MP分子的G″。

2.2.2 PPI酶解物對(duì)凝膠強(qiáng)度的影響

混合體系的凝膠強(qiáng)度隨PPI及其酶解物添加量的變化見(jiàn)圖4。

圖4 不同的花生蛋白酶解物與肌原纖維蛋白共混體系的蛋白凝膠強(qiáng)度Fig.4 Protein gel strength of blends of different peanut protein hydrolysates and myofibrillar proteins

蛋白的凝膠是因外界條件變化導(dǎo)致蛋白產(chǎn)生不同程度的變性開(kāi)始伸展，然后蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與溶劑之間相互作用，最后蛋白質(zhì)之間相互聚集，形成致密的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分離蛋白及其酶解物與MP共混凝膠隨PPI及其酶解物添加量變化的變化趨勢(shì)。添加2%的PPI酶解物對(duì)MP凝膠強(qiáng)度的影響不大，而同樣的添加量下未酶解的PPI會(huì)降低MP的凝膠強(qiáng)度；當(dāng)添加量升至4%時(shí)，共混蛋白凝膠強(qiáng)度明顯增加，其中PPI/MP凝膠強(qiáng)度增加3.80%～14.84%；堿性酶解PPI/MP凝膠強(qiáng)度增加15.03%～45.09%；中性酶解PPI/MP凝膠強(qiáng)度增加了9.70%，木瓜蛋白酶解PPI/MP凝膠強(qiáng)度增加了54.13%，而后又隨添加量的增加而減小，這可能是酶解導(dǎo)致PPI變性，球狀結(jié)構(gòu)展開(kāi)，埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的活性基團(tuán)暴露[12]，增強(qiáng)PPI與MP之間的分子相互作用，表明PPI酶解物在4%的添加量下，形成的混合蛋白結(jié)構(gòu)較為緊致，形成的凝膠也比較牢固，從而增強(qiáng)MP的凝膠[29]。圖4反映了花生強(qiáng)度，其中木瓜蛋白酶酶解物與堿性蛋白酶酶解物增加MP的凝膠強(qiáng)度的作用較為明顯。當(dāng)添加量超過(guò)4%后，可能因?yàn)閮煞N蛋白質(zhì)的自身相互作用增強(qiáng)，MP分子形成凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)時(shí)的阻力增大[30-32]，導(dǎo)致蛋白凝膠強(qiáng)度下降，當(dāng)PPI及其酶解物超過(guò)一定量與MP作用會(huì)阻礙或破壞MP原有的蛋白結(jié)構(gòu)，不利于其形成致密的凝膠結(jié)構(gòu)。

2.2.3 不同酶解物對(duì)凝膠質(zhì)構(gòu)的影響

混合體系的彈性、黏結(jié)性和回復(fù)性隨PPI酶解物添加量的變化見(jiàn)圖5。

圖5 不同的花生蛋白酶解物與肌原纖維蛋白共混體系的蛋白凝膠質(zhì)構(gòu)Fig.5 Protein gel structure of blends of different peanut protein hydrolysates and myofibrillar proteins

凝膠質(zhì)構(gòu)是蛋白質(zhì)在食品加工過(guò)程的一個(gè)重要的屬性，對(duì)食品品質(zhì)有重要影響，其中彈性、黏結(jié)性及回復(fù)性等性質(zhì)的改變反映了蛋白的變性情況。由圖5可知，隨著各蛋白酶所得酶解物添加量逐漸增加，蛋白的彈性、黏結(jié)性及回復(fù)性均呈現(xiàn)不同的變化。在堿性蛋白酶解PPI/MP共混體系中，彈性最大增加了4.55%，黏結(jié)性增加，回復(fù)性變化不大；在中性蛋白酶解PPI/MP共混體系中，在PPI酶解物添加量為4%時(shí)，彈性最大增加了27.45%；在木瓜蛋白酶解PPI/MP共混體系中，混合蛋白的凝膠彈性增加了21.86%，添加量在4%時(shí)最大，回復(fù)性和黏結(jié)性均有所增加，由此可推測(cè)，在肉類制品中添加經(jīng)酶處理改性的PPI能增強(qiáng)食品的彈性，改善食品品質(zhì)。

3 結(jié)論

MP與PPI及其酶解物復(fù)配后，在4%的添加量下，PPI酶解物對(duì) MP 的 G′、G″、表觀黏度、凝膠強(qiáng)度、彈性、回復(fù)性及黏結(jié)性等均有促進(jìn)作用，其中，PPI中性蛋白酶酶解物對(duì)MP的流變學(xué)性質(zhì)的改善作用優(yōu)于堿性蛋白酶酶解物、木瓜蛋白酶酶解物及PPI，主要體現(xiàn)在對(duì)G′及凝膠彈性的影響上；3種PPI酶解物均能增強(qiáng)MP的凝膠強(qiáng)度（增幅在9.7%～54.13%）及質(zhì)構(gòu)特性，與流變學(xué)變化相一致。說(shuō)明PPI經(jīng)過(guò)酶解后能有效改善MP的蛋白特性，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)，對(duì)實(shí)際生產(chǎn)加工具有重要的實(shí)際意義。