以凝固型發(fā)酵乳為樣本探究pH對大腸菌群的影響

◎ 李玉平，李 鵬，孫叢叢，凌 森

（河北三元食品有限公司，河北 石家莊 050700）

溶液的pH值等于溶液中氫離子濃度的負對數(shù)，代表了溶液的酸堿度。pH值是影響微生物生長的一個關(guān)鍵因素，微生物會因細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變性和核酸的變異出現(xiàn)生物活性下降的現(xiàn)象；當pH有所改變時，營養(yǎng)物質(zhì)會因受到影響而發(fā)生改變，導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的有效利用率降低，微生物的生長速度隨之下降[1]。不同微生物適宜生存的pH環(huán)境不同，在溫度、水分等條件適宜的情況下，菌體內(nèi)酶的活性在最適pH或最適pH區(qū)間時最高，生長速度也最快，環(huán)境的pH發(fā)生變化會在一定程度上影響微生物的生長速度，在一定pH區(qū)間外微生物會受到損傷而死亡[1]。

大腸菌群（Coliforms）一般指一群在特定培養(yǎng)條件下能夠發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽孢桿菌[2]。該菌群與人們的生活息息相關(guān)，常出現(xiàn)在糞便和被糞便污染的地帶。大腸菌群計數(shù)是評價食品衛(wèi)生狀況的重要指標之一，在食品衛(wèi)生方面中得到廣泛使用[3]。大腸菌群含量的高低不僅可以反映食品被糞便污染的程度，還可以直接影響食品的儲存期、口感和人體健康。大腸菌群是條件性致病菌，其較強的產(chǎn)毒能力決定了其具有較低的感染劑量，感染大腸菌群后的中毒反應(yīng)有發(fā)熱、嘔吐、腹瀉和腹痛等。一直以來人們都在不斷關(guān)注著影響大腸菌群檢測結(jié)果準確性的因素及注意事項，持續(xù)探究著大腸菌群的生存特點。為了得到更加準確的大腸菌群計數(shù)結(jié)果，首先要熟練掌握國家檢驗標準，從方法的適用性、培養(yǎng)基及試劑的滅菌要求、使用溫度和使用量、操作步驟（樣品稀釋、接種時間、培養(yǎng)溫度和時間）、平板計數(shù)和證實試驗到結(jié)果報告等每個環(huán)節(jié)都要嚴格按照標準要求進行。在研究大腸桿菌的生存特點時發(fā)現(xiàn)，在不同的極端環(huán)境下，大腸桿菌會產(chǎn)生不同的應(yīng)激機制，有針對性地對抗高壓、低溫、高熱和高酸等壓力帶來的威脅。近幾年有不少學(xué)者對大腸桿菌的耐酸性進行了研究，不同的酸性條件下大腸桿菌的生長情況也不盡相同。

李小媚等[4]研究表明，pH值為5.0～7.0時，大腸桿菌（0157:H7）可以良好地生長；pH值為2.0～4.0時，大腸桿菌（0157:H7）的生長受到了抑制；當pH值＜2.0時，大腸桿菌（0157:H7）幾乎被全部殺死。另外，當環(huán)境中的pH值不同時，大腸桿菌（0157:H7）所呈現(xiàn)出來的形態(tài)也有所不同，當環(huán)境的pH值降低時細胞由長桿狀變成短桿狀或橢圓狀，由此可見大腸桿菌（0157:H7）對酸的耐受性較強，可以很好地對抗酸性環(huán)境對其生長的影響。這一特性使得酸性果汁、乳制品等酸性或發(fā)酵食品極易被大腸桿菌污染，同時也反映出了在對食品進行大腸菌群計數(shù)檢驗過程中，pH是影響檢測結(jié)果的重要因素之一[5]。為探究不同pH值對大腸菌群生長的影響，本試驗以凝固型發(fā)酵乳為樣本，采用平板計數(shù)的方法，分別對存放前后的已接種等量大腸埃希氏菌的不同pH值的樣本稀釋液進行大腸菌群計數(shù)。通過比較存放前后大腸菌群含量的變化來判定pH對大腸菌群生長的影響[6]。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

滅菌吸管、直徑為90 mm的無菌平皿、無菌錐形瓶、試管和水浴鍋，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；（36±1）℃電熱恒溫培養(yǎng)箱，DNP-9272BS-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；pH計，DELTA320，梅特勒托利多有限公司；電子天平，T1000，常熟市雙杰測試儀器廠；高壓滅菌器，YXQ-100A，上海博訊實業(yè)有限公司。

1.2 試劑

0.85%無菌生理鹽水、1 mol·L-1NaOH 溶液、1 mol·L-1HCl溶液，均為自制。

1.3 培養(yǎng)基

本次試驗使用的培養(yǎng)基均按照《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》（GB 4789.28—2013）的要求進行質(zhì)量驗收，且驗收合格的商品化脫水合成培養(yǎng)基。

結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA）：嚴格按照培養(yǎng)基標簽上的方法進行配制，臨用前制備。

煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯：嚴格按照培養(yǎng)基標簽上的方法進行配制，分裝至放有倒置玻璃小導(dǎo)管的試管中，每管10 mL，121℃條件下高壓滅菌15 min。

1.4 試驗方法

1.4.1 菌懸液

本次試驗使用的是從美國典型菌株保藏中心購入的大腸埃希氏菌，菌懸液由儲備菌株在BHI（非選擇性肉湯）中培養(yǎng)過夜后制得[7]。

1.4.2 樣品稀釋

無菌條件下，準確稱量50 g樣本于裝有50 mL無菌生理鹽水的容器中，充分混勻，共制備6份，對稀釋液分別編號為S0、S1、S2、S3、S4和S5，用1 mol·L-1NaOH 溶液和 1 mol·L-1HCl溶液調(diào)節(jié)各稀釋液的pH值，測得各稀釋液的pH值依次為4.4（未調(diào)pH）、2.0、3.0、4.4（未調(diào)pH）、5.3和6.8。

1.4.3 大腸菌群計數(shù)

（1）對S0（未接種）進行大腸菌群計數(shù)測試。用無菌吸管吸取S0稀釋液于2個無菌培養(yǎng)皿中，每皿2 mL，此接種量相當于1 mL樣本原液，記為100；同樣量取2 mL S0稀釋液至裝有8 mL無菌生理鹽水的試管中，振蕩均勻，用無菌吸管量取上述勻液至2個無菌平皿，每皿1 mL，此接種量相當于0.1 mL樣本原液，記為10-1。另取1 mL無菌生理鹽水至無菌培養(yǎng)皿中，作為空白對照。

（2）對S1～S5（接種）進行大腸菌群計數(shù)測試。向稀釋液S1、S2、S3、S4和S5中分別加入ATCC 25922大腸埃希氏菌的工作菌懸液1 mL，振蕩均勻，用無菌吸管吸取各個已接種的稀釋液，分別接種至2個無菌平皿，每皿2 mL，記為100；量取2 mL各稀釋液于盛有8 mL無菌生理鹽水的試管中，充分混勻，記為10-1；用無菌吸管量取10-1勻液1 mL于盛有9 mL生理鹽水的試管中（吸管尖端不要觸及稀釋液面），充分混勻，制成10-2的樣品勻液。按前面的操作，制成10倍遞增系列稀釋液。每個稀釋度，換用1支無菌吸管。取多個連續(xù)稀釋度，每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1 mL。

（3）向所有平皿中倒入46 ℃左右的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂，每皿需倒15～20 mL。順時針搖晃平皿，使培養(yǎng)基和接種的樣液混合充分，放置一段時間，至瓊脂完全凝固后，倒入3～4 mL VRBA覆蓋整個平板。完全凝固后，將平皿倒置，在（36±1）℃條件下培養(yǎng)18～24 h。

（4）接種完成后，將稀釋液S1～S5放置6.5 ℃環(huán)境中存放1 d，重復(fù)上述操作。

（5）培養(yǎng)結(jié)束后，嚴格按照《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》（GB 4789.3—2016）9.3的規(guī)定，計數(shù)典型和可疑菌落數(shù)。典型菌落是紫紅色，有紅色的膽鹽沉淀環(huán)在其周圍。嚴格按照《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)》（GB 4789.3—2016）9.4證實試驗的規(guī)定，從VRBA平板上取10個典型單個菌落，轉(zhuǎn)種于BGLB肉湯試管內(nèi)，于（36±1）℃條件下培養(yǎng)24～48 h，結(jié)果BGLB肉湯管均有氣體產(chǎn)生。

2 結(jié)果與分析

試樣S0（未接種）的計數(shù)結(jié)果為＜1 CFU·g-1，說明樣本沒有被大腸菌群污染；分別對S1～S55個試樣的各稀釋度平板進行大腸菌群計數(shù)，結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，試樣的pH值為4.4～6.8時，存放前后大腸菌群數(shù)量沒有明顯變化，數(shù)量級不變，由此可見，大腸菌群有較強的耐酸性；試樣的pH值=3時，存放前后大腸菌群含量由7.8×106CFU·g-1減少至1.3×104CFU·g-1，pH值的降低明顯影響了大腸菌群的生物活性；試樣的pH值＜3時，存放后大腸菌群幾乎全部死亡，含量由7.5×106CFU·g-1減少至0，大腸菌群在酸性較高的環(huán)境下受到嚴重損傷而死亡。綜上，本次試驗結(jié)果表明，當大腸菌群含量較大時，不同的pH值對大腸菌群有不同程度的影響，pH值在4.4～6.8時對大腸菌群沒有明顯抑制性；pH值≤3時對大腸菌群有顯著抑制性。

圖1 試樣S1～S5存放前后大腸菌群含量變化趨勢圖

3 結(jié)論

大腸菌群對酸有較強的耐受性，在pH值≤3的條件下受到顯著抑制。大腸菌群計數(shù)是評價食品衛(wèi)生污染狀況的重要指標，為了準確得到食品中大腸菌群的含量，檢測過程應(yīng)注意培養(yǎng)基以及樣品勻液的pH值，調(diào)節(jié)pH值至國家標準要求的范圍。另外，產(chǎn)品在存放過程中pH值的變化也會對大腸菌群的含量有影響，因此要注意檢測的及時性。