優(yōu)化的免疫親和柱凈化-高效液相色譜法檢測 食品中的玉米赤霉烯酮

胡 云，王 帥，鄒勇平，周元元，盧 偉，劉衍彤

（揚(yáng)州市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，江蘇揚(yáng)州 225000）

玉米赤霉烯酮是鐮刀屬真菌污染玉米、小麥等谷物后產(chǎn)生的具有雌激素效應(yīng)的真菌毒素，我國對食品中玉米赤霉烯酮的限量要求有著嚴(yán)格的規(guī)定[1-3]。目前，常用的食品中玉米赤霉烯酮檢測方法較多[4]，與液相色譜-質(zhì)譜法相比，液相色譜法的操作更為簡便，且設(shè)備價(jià)格適中，與熒光分光光度法相比，液相色譜法可實(shí)現(xiàn)大批量樣品的連續(xù)檢測，檢測效率更高，是檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)用于毒素檢測的首選方法。免疫親和層析是毒素分析中最常用的凈化方法之一，通過將抗體包埋在凝膠中制備的免疫親和柱具有易于制備和儲存、無需激活等優(yōu)點(diǎn)[5]。已有研究表明[6]，上樣、淋洗和洗脫條件都會影響免疫親和柱的柱回收率，雖然國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了免疫親和柱的通用凈化方法[4]，但在具體應(yīng)用中，為了實(shí)現(xiàn)痕量真菌毒素的準(zhǔn)確檢測，對商品化的免疫親和柱的使用仍有進(jìn)一步優(yōu)化的必要。本文對玉米粉、玉米油、醋和黃酒中的玉米赤霉烯酮的提取和凈化方法進(jìn)行優(yōu)化，通過色譜柱分離以及熒光檢測器檢測，建立了一種靈敏、準(zhǔn)確的食品中玉米赤霉烯酮的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

玉米粉、玉米油、醋和黃酒均購于超市；玉米赤霉烯酮免疫親和柱，3 mL/支，江蘇省蘇微微生物研究有限公司；934-AH 玻璃纖維濾紙，英國Whatman 公司。

1.1.2 試劑

甲醇、乙腈，色譜純，默克；氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀，分析純，國藥；吐溫-20，化學(xué)純，國藥；超純水，由Milli-Q 超純水機(jī)制備；玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液（50.8 mg·L-1）；溶劑（乙腈），色譜級，安譜。

1.2 儀器與設(shè)備

1260 高效液相色譜儀（配置FLD 檢測器），美國Agilent 公司；Milli-Q 超純水儀，美國Millipore公司；S210-K 酸度計(jì)，美國METTLER TOLEDO公司；XSR204 電子分析天平，美國METTLER TOLEDO 公司；AH40 全自動均質(zhì)器，?？萍瘓F(tuán)股份公司；Fotector Plus 高通量全自動固相萃取儀，?？萍瘓F(tuán)股份公司；Auto EVA 80 全自動平行濃縮儀，?？萍瘓F(tuán)股份公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 前處理方法

（1）提取。①玉米粉。稱取玉米粉48 g 于均質(zhì)瓶中，參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤霉烯酮的測定》（GB 5009.209—2016）的方法[4]，加入4 g氯化鈉和100 mL 提取液（乙腈∶水=60 ∶40），于18 000 r·min-1高速均質(zhì)200 s，立刻轉(zhuǎn)移至離心管中，于6 000 r·min-1離心10 min，準(zhǔn)確移取10.0 mL 上清液加入50.0 mL 水稀釋并混勻，經(jīng)玻纖濾紙過濾后備用。②玉米油。按照玉米粉的提取方法提取玉米油。③醋。稱取醋40 g，滴加50%（v/v）氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH 值至7.4，參照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤霉烯酮的測定》（GB 5009.209—2016）的方法[4]，乙腈定容至100.0 mL，全部轉(zhuǎn)移至均質(zhì)瓶中，于 18 000 r·min-1高速均質(zhì)200 s，立刻用玻纖濾紙過濾，準(zhǔn)確移取10.0 mL 濾液，加入50.0 mL 水稀釋并混勻，經(jīng)玻纖濾紙過濾后備用。④黃酒。黃酒無需調(diào)節(jié)酸度，其余提取步驟與醋相同。

（2）凈化。取10.0 mL 備用的濾液，以2 秒/滴的速度通過已放置至室溫的玉米赤霉烯酮免疫親和柱，先用10 mL 0.1%吐溫20-PBS 淋洗，再用 10 mL 水淋洗，淋洗速度1 秒/滴，直至淋洗液全部通過免疫親和柱，吹干柱體至無殘留淋洗液，將1.5 mL 甲醇以0.5 mL·min-1的流速分3 次低速洗脫，收集全部洗脫液。

（3）濃縮。將洗脫液于45 ℃、0.5 L·min-1氮?dú)獯抵两?，流動相定容?.0 mL，濾膜過濾后上機(jī)分析。

1.3.2 液相色譜條件

色譜柱：Eclipse Plus C18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），美國Agilent 公司；流動相：乙腈∶水∶甲醇=46 ∶46 ∶8；流速：1.0 mL·min-1，柱溫：35 ℃，進(jìn)樣量：100 μL；激發(fā)波長：274 nm，發(fā)射波長：440 nm。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別移取2 μL、10 μL、20 μL、40 μL 和100 μL玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液于10 mL 容量瓶中，流動相定容至刻度，配制得10.16 ng·mL-1、50.80 ng·mL-1、101.60 ng·mL-1、203.20 ng·mL-1和508.00 ng·mL-1的玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 優(yōu)化提取方法

真菌毒素的免疫親和柱為單克隆抗體結(jié)合的凝膠顆粒，已有研究表明，玉米赤霉烯酮和抗體之間的相互作用受有機(jī)溶劑影響[6]，將玉米赤霉烯酮溶于水、PBS、10%的乙腈水溶液后過柱，回收率大于95%，但是，將玉米赤霉烯酮溶于20%的乙腈水溶液后過柱，回收率則降低為86%，因此，玉米赤霉烯酮過柱時(shí)，溶液中乙腈的比例不宜高于10%。按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤霉烯酮的測定》（GB 5009.209—2016）的提取方法[4]，樣品經(jīng)提取、稀釋、過濾，濾液中乙腈的比例為12%～18%，影響玉米赤霉烯酮免疫親和柱的回收率。因此，實(shí)驗(yàn)調(diào)整了提取方法，優(yōu)化的提取方法為調(diào)整提取液中乙腈的濃度，由90%降至60%；此外，在稀釋步驟中，將1 ∶4 的稀釋比調(diào)整為1 ∶5 的稀釋比，同時(shí)為了不影響檢測方法的靈敏度，適當(dāng)增加樣品的稱樣量。經(jīng)過優(yōu)化，樣品中玉米赤霉烯酮的最低回收率從75.6%提升至81.3%。

2.1.2 優(yōu)化免疫親和柱的凈化條件

洗脫步驟影響免疫親和柱的柱回收率，為了使玉米赤霉烯酮盡可能多地被洗脫，采用了低流速分次洗脫的方法。用2.0 mL甲醇洗脫柱載量為1 117.6 ng的玉米赤霉烯酮，分4 次，每次以0.5 mL·min-1的低速向免疫親和柱中注入0.5 mL 甲醇，等待10 s，注入和等待期間不使甲醇流出，然后，以0.5 mL·min-1的流速慢洗脫，待此部分甲醇全部流出后，進(jìn)行下一次洗脫，直至2.0 mL 甲醇洗脫液全部流出。此方法的玉米赤霉烯酮洗脫情況見圖1。由圖1 可知，第1 次、第2 次和第3 次的甲醇洗脫液中玉米赤霉烯酮的量分別為217 ng、595 ng 和276 ng，第4 次的甲醇洗脫液中沒有檢測到玉米赤霉烯酮，說明1.5 mL甲醇分3 次低速洗脫，可以使玉米赤霉烯酮全部洗脫。3 次洗脫液的玉米赤霉烯酮的總量為1 088 ng，柱回收率達(dá)到97.4%，可見，采用1.5 mL 甲醇以 0.5 mL·min-1的低流速分3 次洗脫的方法，能使玉米赤霉烯酮的免疫親和凈化達(dá)到較為理想的柱回收效果。

圖1 甲醇低流速分次洗脫時(shí)玉米赤霉烯酮的分布情況

將4.1 ng、10.2 ng、50.8 ng、101.6 ng、203.2 ng、304.8 ng、406.4 ng、508.0 ng、609.6 ng、711.2 ng、812.8 ng、914.4 ng、1 016.0 ng、1 219.2 ng、1 422.4 ng、1 524.0 ng、1 625.6 ng、1 727.2 ng、1 828.8 ng 和 2 032.0 ng 的玉米赤霉烯酮分別注入免疫親和柱，在優(yōu)化的免疫親和柱凈化條件下，考察柱回收率，結(jié)果見圖2。當(dāng)玉米赤霉烯酮的載柱量在4.1 ～1 828.8 ng 時(shí)，柱回收率在80.9%～101.5%，玉米赤霉烯酮免疫親和柱的柱效較高，當(dāng)玉米赤霉烯酮的載柱量在2032.0 ng 時(shí)，柱回收率在69.8%，柱效開始降低，由此可見對于玉米赤霉烯酮含量較高的樣品，要獲得較為精準(zhǔn)的檢測結(jié)果，應(yīng)將濾液進(jìn)一步稀釋后，再由免疫親和柱凈化。

圖2 玉米赤霉烯酮免疫親和柱柱效（4.1 ～2 032.0 ng）

2.2 方法的線性范圍與檢出限、定量限

玉米赤霉烯酮在10.16 ～508.00 ng·mL-1時(shí)，校正曲線y=0.047 93x+0.013 76，相關(guān)系數(shù)為0.999 96。分別以優(yōu)化后的前處理方法處理玉米粉、玉米油、醋和黃酒，其中，玉米粉和玉米油中玉米赤霉烯酮的檢出限為0.42 μg·kg-1，定量限為1.4 μg·kg-1，醋和黃酒中玉米赤霉烯酮的檢出限為0.35 μg·kg-1，定量限為 1.2 μg·kg-1，低于國家標(biāo)準(zhǔn)中5 ～50 μg·kg-1的檢出限，17 ～165 μg·kg-1的定量限，說明優(yōu)化后的檢測方法具有較高的檢測靈敏度。

2.3 方法的加標(biāo)回收率與精密度

依據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中玉米赤霉烯酮的測定》（GB 5009.209—2016）中規(guī)定的定量限[4]和《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中規(guī)定的最高殘留限量[3]，選擇定量限點(diǎn)、標(biāo)準(zhǔn)曲線中合適點(diǎn)和接近最高殘留限量的點(diǎn)（標(biāo)準(zhǔn)沒有規(guī)定的則選擇標(biāo)準(zhǔn)曲線中濃度較高的點(diǎn)）進(jìn)行3 水平的加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平重復(fù)6 次，計(jì)算平均加標(biāo)回收率和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)，結(jié)果見表1[7]。

表1 樣品中玉米赤霉烯酮的加標(biāo)回收率及實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)

4 種食品中玉米赤霉烯酮的平均加標(biāo)回收率在81.3%～107.6%，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)在0.1%～4.3%，符合國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的檢驗(yàn)方法確認(rèn)的技術(shù)要求[7]。4 種食品中，黃酒中玉米赤霉烯酮3 水平加標(biāo)回收率較其他3 種食品低，可能是因?yàn)辄S酒中含有一定量的醇類有機(jī)物，在一定程度上影響了免疫親和柱的柱效。在市場中隨機(jī)購買的玉米油和玉米粉中均檢出了玉米赤霉烯酮，但是，國家標(biāo)準(zhǔn)僅規(guī)定了玉米粉等谷物及其制品中玉米赤霉烯酮的限量要求，對玉米油沒有作出規(guī)定，今后有必要對市場中玉米油的玉米赤霉烯酮含量進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測，并進(jìn)行分析評估。

2.4 方法的準(zhǔn)確度

對玉米油質(zhì)控樣品中玉米赤霉烯酮的含量進(jìn)行檢測，結(jié)果為105.8 μg·kg-1，該質(zhì)控樣品中玉米赤霉烯酮的特性值為108.6 μg·kg-1，特性值區(qū)間為89.8 ～127.4 μg·kg-1，說明優(yōu)化的檢測方法準(zhǔn)確度高，適用于食品中玉米赤霉烯酮的檢測。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了食品中玉米赤霉烯酮的提取條件和免疫親和柱的凈化方法，柱回收率較優(yōu)化前有了提高，方法靈敏度高，檢出限和定量限均低于國家標(biāo)準(zhǔn)方法，定量結(jié)果準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)使用了均質(zhì)器、固相萃取儀和平行濃縮儀，在實(shí)現(xiàn)大批量檢測的同時(shí)，獲得了優(yōu)于人工操作的、穩(wěn)定的平行檢測結(jié)果。綜上，本方法適用于食品中玉米赤霉烯酮含量的檢測。自然界中的玉米赤霉烯酮普遍存在，除了污染谷物、飼料、食用和藥用草藥外[6,8-9]，存在于霉菌產(chǎn)毒菌絲的菌絲體和孢子中的玉米赤霉烯酮還會污染農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境中的空氣[10]，進(jìn)而對動物和工人健康造成潛在危害。玉米赤霉烯酮在動物體內(nèi)產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物α-玉米赤霉烯醇和β-玉米赤霉烯醇具有與玉米赤霉烯酮同樣的類雌激素效應(yīng)，且容易污染牛奶和奶制品[11]。因此，對國家標(biāo)準(zhǔn)沒有作限量要求的食品以及環(huán)境進(jìn)行玉米赤霉烯酮及其代謝產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測和安全性評估是今后需要努力的方向。