食品中抗生素抗性基因及檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

胡燕玲，陳亞波，金倩儀

（中山市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東中山 528400）

抗生素（Antibiotics）是20 世紀(jì)醫(yī)學(xué)研究上的重要發(fā)現(xiàn)之一，主要應(yīng)用于治療和預(yù)防疾病、促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育等[1]?？股貙儆谝志鷦?，對(duì)機(jī)體內(nèi)微生物的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)具有較大的抑制能力，在含量較低的濃度下就可以在某種程度上抑制甚至消滅其他微生物[2]。自抗生素問世后，廣泛被應(yīng)用于治療人與動(dòng)植物的疾病，曾被認(rèn)為是可以治愈任何細(xì)菌感染的靈丹妙藥。我國養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的濫用十分嚴(yán)重。調(diào)查顯示，2007 年我國抗生素年生產(chǎn)量達(dá)到210 000 t，其中46.1%用于畜牧養(yǎng)殖業(yè)；2013 年我國生產(chǎn)248 000 t 抗生素，國內(nèi)使用約162 000 t，其中84 240 t 用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)，主要用于養(yǎng)豬業(yè)與養(yǎng)雞業(yè)，磺胺類、大環(huán)內(nèi)酯類、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類及其他抗生素所占比例分別為5%、26%、17%、7%、21%和24%[3-5]?？股禺a(chǎn)生的耐藥性已經(jīng)是全世界共同面對(duì)的問題，從世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)記載獲知，目前每年全世界感染耐藥性病原微生物的人數(shù)達(dá)200 萬，有高達(dá)14 000 人以上因耐藥菌具有抗生素抗性基因而醫(yī)治無效死亡[6]?，F(xiàn)階段，我國僅有大型醫(yī)院會(huì)嚴(yán)格控制抗生素的濫用情況，但在食品原料方面，如水產(chǎn)品養(yǎng)殖、畜禽養(yǎng)殖及蔬果種植業(yè)中非法使用和添加抗生素的現(xiàn)象仍未得到改善。養(yǎng)殖業(yè)中各種添加濫用抗生素的情形尤為突出，促使微生物中抗性基因向更加復(fù)雜多樣化的耐藥模式轉(zhuǎn)變、擴(kuò)散且持續(xù)長(zhǎng)久的存在?？股乜剐曰蛟谌藗?nèi)粘Ｉ瞽h(huán)境中持續(xù)長(zhǎng)時(shí)間的存在以及在不同寄主的傳播水平通常比抗生素本身帶來的危害更加嚴(yán)重，因此食品中抗生素抗性基因檢測(cè)研究已成為食品科學(xué)領(lǐng)域新的研究熱點(diǎn)[7]。

1 國內(nèi)外抗生素抗性基因研究現(xiàn)狀

現(xiàn)有國內(nèi)外資料記載對(duì)抗生素抗性基因（Antibiotic Resistance Genes，ARGs）的研究重點(diǎn)集中于大自然氣體等環(huán)境介質(zhì)、水質(zhì)和土壤。LU 等[8]對(duì)遼河一帶水質(zhì)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)所有水體中都能檢測(cè)到3 種磺胺類耐藥基因，是因?yàn)轲B(yǎng)殖戶在養(yǎng)殖過程中長(zhǎng)期使用抗生素，也可能是ARGs 的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的富集。KERRY 等[9]研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖池塘中攜帶ARGs的耐藥性菌株種類和數(shù)量多于未使用過抗生素的河流。MUZIASARI 等[10]研究的波羅的海漁場(chǎng)海水中抗生素抗性基因污染情況顯示，漁場(chǎng)檢測(cè)到豐富的ARGs，盡管漁場(chǎng)中沒有使用氨基糖苷類抗生素，但在農(nóng)場(chǎng)沉積物中富含氨基糖苷類抗生素的抗性基因，說明水體中ARGs 污染較嚴(yán)重。目前在食品領(lǐng)域中對(duì)于ARGs 的研究在樣品類型和檢測(cè)手段方面都在不斷拓展，研究成果豐碩。

1.1 國內(nèi)研究發(fā)展現(xiàn)狀

近年來食品領(lǐng)域中ARGs 的研究逐漸成為熱點(diǎn)。葉蕾[11]最早以廣州市水產(chǎn)養(yǎng)殖品作為研究對(duì)象，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和16S rRNA 測(cè)序方法研究水產(chǎn)養(yǎng)殖品中耐藥共生菌的耐藥水平，分析耐藥決定因子和耐藥菌菌體類型，發(fā)現(xiàn)505 株多重耐藥細(xì)菌中，耐磺胺藥物的sulI 基因以及多重耐藥細(xì)菌含有Ⅰ型整合子整合酶基因intI 的約有1/4。其中含耐磺胺藥物sulII 基因的多重耐藥菌占15%，含抗四環(huán)素tetE基因的多重耐藥菌占5%。在多重耐藥細(xì)菌中的分布比中抗紅霉素耐藥基因ermB、ermC 以及β 內(nèi)酰胺酶編碼抗性基因blaTEM、blaCMY 的占比分別為1.3%和0.3%及4.5%和1.7%。劉宗保[12]利用熒光定量PCR 對(duì)廈門市某養(yǎng)殖場(chǎng)的部分豬肉樣品中的耐藥基因進(jìn)行定量分析，使用變性梯度凝膠電泳（Denatured Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）研究生豬養(yǎng)殖場(chǎng)環(huán)境及豬肉樣品的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，使用宏基因組高通量測(cè)序的方法分析養(yǎng)殖場(chǎng)土壤中的耐藥基因分布情況。結(jié)果表明，豬肉樣品中ARGs 污染嚴(yán)重，養(yǎng)殖場(chǎng)土壤中存在大量的耐藥基因，并發(fā)現(xiàn)新的耐藥基因。馮淑貞等[13]應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)對(duì)采集自內(nèi)蒙古錫林郭勒牧區(qū)的11 份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中常見抗生素抗性基因豐度進(jìn)行了絕對(duì)定量檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)22 種常見抗性基因均有檢出。王慧平[14]對(duì)ARGs 研究是在總DNA 水平上采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)系統(tǒng)分析ARGs 的污染狀況，樣品來源為市售水產(chǎn)品、蔬果產(chǎn)品、肉制品和某養(yǎng)殖場(chǎng)豬糞便樣品，結(jié)果表明各個(gè)樣品中均存在一定程度的ARGs污染。超市的污染最低，其次是水產(chǎn)品市場(chǎng)，來自菜市場(chǎng)的水產(chǎn)品及蔬菜樣品抗生素抗性基因污染最為嚴(yán)重。食品是ARGs 進(jìn)入人體的直接載體，因此對(duì)各類食品中的抗生素抗性基因進(jìn)行定量和分布狀況研究有著深遠(yuǎn)的意義。蝦類、魚類產(chǎn)品是常見的食材，但水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)普遍濫用抗生素，對(duì)人體健康造成了威脅[15]。李娟等[16]選取養(yǎng)殖場(chǎng)周邊農(nóng)田10 份蔬菜樣品，通過PCR 方法，分析研究了喹諾酮類、氯霉素類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和磺胺類等5 類ARGs分布情況。四環(huán)素類ARGs 和磺胺類ARGs 殘留最高，且范圍最廣，蔬菜表面、內(nèi)部檢出率分別為70%和100%。其次是喹諾酮類ARGs，蔬菜表面、內(nèi)部檢出率分別為100%和60%。結(jié)果表明，畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)周邊的蔬菜ARGs 污染較為嚴(yán)重，可能會(huì)導(dǎo)致蔬菜內(nèi)部細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，進(jìn)而通過食物鏈傳播進(jìn)入人體。但總體來說，對(duì)食品中ARGs 的研究尚缺乏系統(tǒng)性，樣品類型覆蓋面不夠，且研究的技術(shù)手段仍局限于PCR 或熒光定量PCR，至今鮮見有采用宏基因組方法研究食品中ARGs 的文獻(xiàn)報(bào)道。因此，人們對(duì)食品中存在哪些ARGs 尚缺乏深刻的認(rèn)識(shí)。

1.2 國外研究發(fā)展現(xiàn)狀

宏基因組學(xué)是一種新的基因組學(xué)技術(shù)，通過提取樣品中全部微生物總DNA，構(gòu)建基因組文庫，研究全部微生物的基因組，并探究微生物群落結(jié)構(gòu)和功能。宏基因組學(xué)具有巨大的應(yīng)用前景，可用于分析微生物群體的多樣性與豐度、環(huán)境中微生物群體基因組成及功能，可用于研究微生物與環(huán)境、宿主間的關(guān)系，也能在發(fā)現(xiàn)具有特定功能的基因以及衡量微生物群落宏基因組表達(dá)水平等方面廣泛應(yīng)用[17-18]。但宏基因組學(xué)方法主要應(yīng)用于環(huán)境領(lǐng)域[19-20]。近年來，隨著人們食品安全意識(shí)的提高，越來越認(rèn)識(shí)到食品中抗生素抗性基因殘留在人類健康和環(huán)境污染等方面的嚴(yán)重性。隨著宏基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在自然環(huán)境、動(dòng)植物和人體內(nèi)檢測(cè)到越來越多的ARGs，利用宏基因組學(xué)技術(shù)可以研究存在于不同領(lǐng)域的ARGs，建立完整的宏基因組文庫，也可以研究ARGs 的抗生素耐藥機(jī)制與傳播途徑之間的聯(lián)系。相比于普通PCR、熒光定量PCR或高通量PCR，利用宏基因組學(xué)方法可在更大程度上幫助人們更全面地了解ARGs 在不同環(huán)境中的豐度與多樣性變化，對(duì)構(gòu)建或完善現(xiàn)有的宏基因組文庫、研究ARGs 對(duì)人們的潛在威脅具有重要意義。但基于高通量測(cè)序的宏基因組學(xué)方法在食品領(lǐng)域的應(yīng)用仍較少[21]，特別是在水產(chǎn)品、畜禽產(chǎn)品、發(fā)酵食品等食品中ARGs 的研究上尚屬空白。

2 食品中抗生素抗性基因檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

ARGs 被認(rèn)定為21 世紀(jì)新型污染物，目前針對(duì)ARGs 的大多數(shù)研究主要集中在土壤、飲用水和生活污水等環(huán)境領(lǐng)域，對(duì)于食品領(lǐng)域中ARGs 的研究報(bào)道不多[22-25]。在當(dāng)今人們?cè)絹碓疥P(guān)注食品安全的大環(huán)境下，關(guān)于食品中抗性基因的豐度研究也應(yīng)該受到關(guān)注。最近的研究顯示，蝦、魚和貝類等水產(chǎn)品中磺胺類、四環(huán)素類、氨基糖苷類抗生素抗性基因檢出6 類抗生素抗性基因（tetA、tetB、tetM、sul Ⅱ、floR、aphA-1、aadA、ermB、cmlA）和Ⅰ類整合子5’端整合酶基因intI1、3’端磺胺耐藥基因sul Ⅰ、季銨鹽化合物及溴化乙錠的耐藥基因qacEΔ1[26]；發(fā)酵乳制品中檢出tetO、ermB、cat 等22 種常見抗性基因[27]。以上研究結(jié)果顯示，由于ARGs 在環(huán)境及食物鏈中的基因水平轉(zhuǎn)移，食品中ARGs 的污染越來越嚴(yán)重，需采用更先進(jìn)的技術(shù)全面分析ARGs 的多樣性和豐度。然而目前食品領(lǐng)域ARGs 的檢測(cè)分析主要基于熒光定量PCR 技術(shù)，該技術(shù)單管檢測(cè)基因數(shù)量少，無法全面高通量地分析樣品中的所有ARGs。采用高通量測(cè)序的宏基因組學(xué)方法分析食品中ARGs 的研究至今鮮見報(bào)道，迫切需要采用高通量技術(shù)手段對(duì)食品樣品中的ARGs 進(jìn)行分析，并評(píng)價(jià)其在食品中的多樣性和豐度。

基因芯片技術(shù)在ARGs 檢測(cè)中也有一定的應(yīng)用。基因芯片技術(shù)是將數(shù)以萬計(jì)、甚至百萬計(jì)的DNA 探針固定于固相載體上形成DNA 微陣列，將樣品核酸用熒光或同位素等方法標(biāo)記，通過與芯片探針雜交檢測(cè)樣本內(nèi)的多種特定DNA 序列，通過計(jì)算機(jī)分析，即可得到樣品中大量基因序列特征和基因表達(dá)信息。由于基因芯片進(jìn)行一次雜交即可獲得樣品中大量序列信息，且具有靈敏、準(zhǔn)確、多參數(shù)同步分析、高度并行性和快速全自動(dòng)分析的特點(diǎn)，研究者常將其用于樣品中大量耐藥基因的檢測(cè)，研究對(duì)象主要是環(huán)境樣品，基因芯片技術(shù)應(yīng)用于食品中ARGs 的研究鮮見報(bào)道。該技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中也存在一些不足之處，主要是由于目前大部分芯片檢測(cè)采用熒光染料而非基于探針技術(shù)，因此存在基因芯片檢測(cè)ARGs時(shí)特異性不強(qiáng)等問題。為了更好地發(fā)揮基因芯片高通量、快速的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)，迫切需要根據(jù)已知的耐藥基因序列設(shè)計(jì)出相應(yīng)的特異性強(qiáng)的探針，從而有效避免假陽性、假陰性以及特異性等問題。而TaqMan 微流體基因芯片（TaqMan Low-Density Arrays，TLDA）技術(shù)的出現(xiàn)，為研究食品中ARGs 提供了新的思路。TaqMan 微流體芯片具備384 個(gè)微孔反應(yīng)腔，每個(gè)微孔可按需求預(yù)先包埋針對(duì)特定檢測(cè)靶標(biāo)設(shè)計(jì)的DNA引物對(duì)和對(duì)應(yīng)的TaqMan 探針。采用TaqMan 微流體芯片檢測(cè)樣品時(shí)，只需加入待檢測(cè)樣品的核酸及PCR 預(yù)混液配制的溶液即可在一次PCR 擴(kuò)增過程中，完成多個(gè)樣品、多個(gè)靶標(biāo)的檢測(cè)。該基因芯片的優(yōu)點(diǎn)是高通量篩查，多樣品、多基因靶點(diǎn)的同時(shí)檢測(cè)；單孔單重?cái)U(kuò)增，避免相互干擾；操作簡(jiǎn)便，省時(shí)省力，5 min 完成上樣，無需復(fù)雜的微量液體移動(dòng)裝置；標(biāo)準(zhǔn)化程度高，消除系統(tǒng)誤差，利于實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果比較。由于其采用TaqMan 探針，可以極大提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性?？梢灶A(yù)見，微流體基因芯片TaqMan 將會(huì)在ARGs 的檢測(cè)分析方面發(fā)揮積極作用。然而目前未見基于TaqMan 探針的微流體芯片技術(shù)應(yīng)用于食品中ARGs 的研究報(bào)道。

3 結(jié)語

目前，食品中ARGs 的研究缺乏系統(tǒng)性，且研究手段較為局限，不能全面了解各類食品中ARGs的分布規(guī)律。國內(nèi)外已有一些采用PCR、熒光定量PCR 分析食品中ARGs 的報(bào)道，但是對(duì)于采用基于高通量測(cè)序的宏基因組學(xué)和基于TaqMan 探針的基因芯片技術(shù)檢測(cè)食品中ARGs 的研究尚屬空白，特別是人們對(duì)于各類食品中ARGs 的多樣性和豐度以及遷移規(guī)律的認(rèn)識(shí)還有待探究。宏基因組學(xué)作為近年發(fā)展出來的一種新的基因組學(xué)技術(shù)，通過宏基因組學(xué)分析可以全面了解研究對(duì)象的基因組成、功能以及微生物群落結(jié)構(gòu)信息。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展以及測(cè)序成本的降低，該方法在研究基因組成及微生物群落多樣性方面應(yīng)用越來越廣泛。本研究所涉及的另一技術(shù)基因芯片技術(shù)，該技術(shù)在食品領(lǐng)域應(yīng)用主要在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)和致病菌檢測(cè)方面，國內(nèi)外未見有應(yīng)用于水產(chǎn)品、畜禽產(chǎn)品、發(fā)酵食品等食品中ARGs 的報(bào)道。TaqMan 微流體基因芯片（TaqMan Low-Density Arrays，TLDA）技術(shù)，對(duì)水產(chǎn)品、畜禽產(chǎn)品、蔬菜、發(fā)酵食品等樣品中的ARGs 類型、相對(duì)豐度、多樣性，同時(shí)篩選出上列不同類型樣品中共有及特有的ARGs 保守序列，后續(xù)通過TaqMan 微流體芯片等基因芯片方法開發(fā)針對(duì)性的ARGs 芯片及建立快速ARGs 檢測(cè)方法。由于使用TaqMan 探針，相比于其他基因芯片技術(shù)，檢測(cè)特異性和靈敏度將更具優(yōu)勢(shì)?；赥aqMan 微流體基因芯片技術(shù)的ARGs 高通量基因芯片的研發(fā)，可為今后食品安全監(jiān)管、評(píng)估市售食品安全性提供重要的技術(shù)支撐和保障，無疑在食品中ARGs 研究的深度及廣度方面具有較大的學(xué)術(shù)價(jià)值。