鹽酸二甲雙胍藥物中雜質(zhì)測定方法研究進(jìn)展

徐艷梅，卞廣利，高輝，王俊峰，王振剛，高燕霞

（1.河北省藥品醫(yī)療器械檢驗研究院，石家莊 050200； 2.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院藥學(xué)部，石家莊 050000；3.石家莊市華新藥業(yè)有限責(zé)任公司，石家莊 050000； 4.河北天成藥業(yè)股份有限公司，河北滄州 061000）

鹽酸二甲雙胍為口服降糖藥，主要用于治療Ⅱ型糖尿病，即非胰島素依賴型糖尿?。?］，具有多種作用機(jī)制，可延緩胃腸道中葡萄糖的吸收，也可提高胰島素的敏感性，增加外周葡萄糖的利用，從而達(dá)到降低血糖的目的［2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸二甲雙胍除具有降糖作用外，還具有改善血脂、降低血小板聚集性的作用，可改善糖尿病患者的并發(fā)癥［3］，其治療效果較好，且與其它類型降糖藥相比具有較少的副作用，已廣泛用于治療妊娠期糖尿病、老年糖尿病等［4-5］。目前該藥有較多劑型，包括鹽酸二甲雙胍片、鹽酸二甲雙胍腸溶片、鹽酸二甲雙胍緩釋片等，也與其它藥物制成了復(fù)方制劑，例如二甲雙胍格列本脲片（Ⅰ）、二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅱ）等［6］。

各種藥物在生產(chǎn)或儲存過程中均會引入雜質(zhì)，如合成過程中由原料引入的雜質(zhì)，儲存過程中因降解產(chǎn)生的雜質(zhì)等［7］。國家藥品監(jiān)督管理局（CFDA）將所有影響藥物純度的物質(zhì)統(tǒng)稱為雜質(zhì)。藥物中的雜質(zhì)不僅沒有治療作用，反而一些毒性雜質(zhì)會影響患者的用藥安全。二甲雙胍是由雙氰胺與二甲胺鹽酸鹽經(jīng)縮合制備而成［8］，在合成過程中雙氰胺和二甲胺鹽酸鹽不可避免地會有殘留；在其儲存過程中二甲雙胍也會再次降解為雙氰胺，以及近年來新發(fā)現(xiàn)的由二甲胺形成的亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)等［9］，這些雜質(zhì)均對患者的用藥安全有著較大的影響。為保證二甲雙胍類藥物療效，并且保證患者用藥安全，準(zhǔn)確測定并控制二甲雙胍類藥物中的雜質(zhì)對其臨床應(yīng)用具有重要意義，不僅可以加強(qiáng)藥物臨床應(yīng)用的有效性，而且可以減少毒性反應(yīng)的發(fā)生。

對于藥物中不同雜質(zhì)的檢測方法各有不同，到目前為止，已有多種方法用于二甲雙胍類藥物中有關(guān)物質(zhì)的檢測，主要包括高效液相色譜（HPLC）法、離子色譜（IC）法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）法、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（GC-MS/MS）法等。上述方法均可以簡便、高效、準(zhǔn)確地對二甲雙胍類藥物中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行測定。筆者對近年來鹽酸二甲雙胍類藥物中有關(guān)物質(zhì)的測定方法進(jìn)行了總結(jié)，以期為該類藥物中雜質(zhì)的測定與研究提供參考。

1 高效液相色譜法

高效液相色譜法作為近年來發(fā)展較快的分離分析技術(shù)，具有高效、高靈敏度等優(yōu)點，可在短時間內(nèi)完成復(fù)雜樣品的分離［10］，目前在各種分析檢測中應(yīng)用較為廣泛［11］。高效液相色譜法用于鹽酸二甲雙胍類藥物中有關(guān)物質(zhì)的測定主要可分為直接測定法和衍生化高效液相色譜法。

1.1 直接測定法

高效液相色譜具有多種檢測器，例如紫外檢測器、熒光檢測器等［12-13］，檢測范圍較廣，可進(jìn)行多種成分同時測定。英國藥典1998 版規(guī)定二甲雙胍類藥物中雙氰胺雜質(zhì)采用HPLC 法進(jìn)行測定，色譜柱采用陽離子交換柱（SCX），但二甲雙胍的保留時間過長，色譜條件適應(yīng)性較差。陸宇等［14］參考英國藥典，選用反相色譜柱，建立了一種測定鹽酸二甲雙胍中有關(guān)物質(zhì)的HPLC 法，并探討了流動相對色譜行為的影響，結(jié)果表明，雙氰胺的保留時間受乙腈濃度影響最為顯著，通過對流動相進(jìn)行優(yōu)化達(dá)到了改善主要雜質(zhì)雙氰胺與二甲雙胍分離度的目的，二甲雙胍理論塔板數(shù)為5 701，拖尾因子為1.07，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.76%（n=6）。

對于鹽酸二甲雙胍緩釋片中有關(guān)物質(zhì)的測定，重點在于雙氰胺與鹽酸二甲雙胍的分離，由于鹽酸二甲雙胍含有胍基，極性較大，在一般的反相流動相中出峰的保留時間極短，孫桂榮等［15］建立了離子對反相色譜法測定鹽酸二甲雙胍緩釋片中雙氰胺及其它有關(guān)物質(zhì)的方法，結(jié)果顯示各成分之間分離效果良好，同時考察了鹽酸二甲雙胍及雙氰胺的最大吸收波長，最終選擇232 nm 作為檢測波長，該方法能夠準(zhǔn)確、迅速地對鹽酸二甲雙胍中的雜質(zhì)進(jìn)行測定。王臨潤等［16］通過加大流動相中水相的比例，并對溶劑進(jìn)行選擇，解決了倒峰對雙氰胺積分的影響問題，該方法采用雙波長進(jìn)行測定，以218 nm 作為測定雙氰胺的波長，以232 nm 作為測定其它雜質(zhì)的波長，測定結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。韓杰［17］建立了測定鹽酸二甲雙胍片中有關(guān)物質(zhì)的HPLC 法，選用甲醇-0.77%乙酸銨溶液為流動相，使得鹽酸二甲雙胍的理論塔板數(shù)大于2 000，主峰與各雜質(zhì)峰均達(dá)到基線分離，應(yīng)用該方法對二甲雙胍中的未知雜質(zhì)總量進(jìn)行了測定，獲得了良好的效果。上述研究多是對雙氰胺一種雜質(zhì)進(jìn)行測定，而錢好等［18］采用HPLC 法對鹽酸二甲雙胍口服溶液中的多種雜質(zhì)進(jìn)行了測定，通過對流動相、柱溫、洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，最終成功地對降解雜質(zhì)雙氰胺及其它副產(chǎn)物如雜質(zhì)B （4，6-二胺基-1，3，5-三嗪-2-基胍）、雜質(zhì)C （N，N-二甲基-1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺）、三聚氰胺（1，3，5-三嗪-2，4，6-三胺）和雜質(zhì)E （1-甲基雙胍鹽酸鹽）進(jìn)行了測定，該方法簡便高效，利于操作。

1.2 衍生化高效液相色譜法

高效液相色譜法應(yīng)用較廣，但對于一些沒有紫外吸收的物質(zhì)，很難直接進(jìn)行測定。二甲雙胍類藥物中常見的雜質(zhì)二甲胺不僅具有輕微的腐蝕作用及強(qiáng)烈的刺激作用［19］，而且易于與體內(nèi)的亞硝酸根形成N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)，但二甲胺是典型的低分子有機(jī)胺，其結(jié)構(gòu)簡單，沒有明顯的紫外吸收，無法通過高效液相色譜法直接進(jìn)行測定，因此需要先進(jìn)行柱前衍生化，將其轉(zhuǎn)化成有紫外吸收的物質(zhì)，然后進(jìn)行檢測。甘加明等［20］以芴甲氧羰酰氯的乙腈溶液作為衍生化試劑，將樣品進(jìn)行衍生化，采用高效液相色譜法對鹽酸二甲雙胍腸溶膠囊中的二甲胺進(jìn)行測定，該方法專屬性強(qiáng)，準(zhǔn)確度高，其中芴甲氧羰酰氯衍生胺類化合物具有反應(yīng)迅速、檢測靈敏度高、可以衍生伯胺和仲胺類化合物等優(yōu)點。馮超等［21］以氯甲酸-9-芴甲酯作為衍生化試劑，對二甲雙胍藥物中的二甲胺進(jìn)行衍生，并對衍生化時間及衍生化試劑比例進(jìn)行了考察，在此基礎(chǔ)上建立了簡便、反應(yīng)迅速的衍生化反相高效液相色譜法測定鹽酸二甲雙胍原料藥中二甲胺的方法，選擇的衍生化試劑具有反應(yīng)較快、操作方便的優(yōu)點。張一平等［22］對提取溶劑進(jìn)行優(yōu)化，選擇對二甲雙胍溶解度較大的甲醇作為溶劑，以2，4-二硝基氟苯作為衍生化試劑，對鹽酸二甲雙胍緩釋片中的二甲胺進(jìn)行了測定。上述研究均采用衍生化的方法測定二甲胺的含量，為二甲胺的準(zhǔn)確測定提供了新的思路。在衍生化反應(yīng)過程中，衍生化試劑的選擇及比例的確定，對于測定結(jié)果有較大的影響。

2 離子色譜法

離子色譜（IC）法是利用離子交換的原理，連續(xù)對共存的多種陰離子或陽離子進(jìn)行分離、定性和定量的方法。離子色譜法在檢測陽離子時靈敏度較高、重復(fù)性好，目前采用離子色譜檢測甲磺酸伊馬替尼中二甲胺的研究已有報道［23］，但使用該方法對二甲雙胍類藥物中二甲胺的測定研究較少。李慧敏等［24］以甲磺酸水溶液作為淋洗液，通過對淋洗液濃度及流量等色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了離子色譜-直接電導(dǎo)法測定鹽酸二甲雙胍藥物中二甲胺殘留的方法，并對該方法的專屬性、線性、回收率等進(jìn)行了考察，結(jié)果表明，該方法可準(zhǔn)確快速地對鹽酸二甲雙胍中的二甲胺進(jìn)行測定。楊芹等［25］也以甲磺酸溶液作為淋洗液，對淋洗液濃度及流量進(jìn)行了考察，最終選擇20 mmol/L 甲磺酸溶液為淋洗液，以1.0 mL/min 的流量進(jìn)行洗脫，采用戴安lonpac CS12A（250 mm×4 mm）陽離子交換柱作為色譜柱，建立了測定二甲胺的離子色譜-直接電導(dǎo)法，該方法快速、準(zhǔn)確、簡便。上述研究表明，離子色譜-直接電導(dǎo)法作為一種常用的檢測手段，通過液相色譜法來檢測被測物中的陰、陽離子，可達(dá)到快速、準(zhǔn)確地檢測鹽酸二甲雙胍類藥物中二甲胺的目的，且操作較為簡便，結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。

3 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

基因毒性雜質(zhì)由于微量存在即可引起人體致癌、致畸變等嚴(yán)重不良反應(yīng)而逐漸引起人們的高度重視［26］。二甲雙胍合成原料中的二甲胺易于形成N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)，例如NDMA（對亞硝基二甲基苯胺）、NDEA（N-亞硝基二乙胺）、NMBA（N-亞硝基-N-甲基-4-氨基丁酸）、NEIPA（N-亞硝基-N-乙基異丙胺）、NDIPA（N-亞硝基二異丙胺）、NDBA（N-亞硝基二丁胺）、NDPA（N-亞硝基二丙胺）等，因此需對二甲雙胍類藥物中潛在的N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行控制。鹽酸二甲雙胍類藥物中N-亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)含量極低，而且種類較多，導(dǎo)致分離檢測較為困難，常規(guī)檢測方法難以準(zhǔn)確測定，而液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)集液相色譜的高效分離與質(zhì)譜較強(qiáng)的檢測能力于一體［27］，具有較高的靈敏度。近年來隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)已經(jīng)廣泛用于微量成分的分析測定［28］。徐艷梅等［29］對色譜柱、溶劑、流動相等條件進(jìn)行了考察，以APCI 源（大氣壓化學(xué)電離源）為離子源，采用MRM（多反應(yīng)監(jiān)測）模式，建立了高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定二甲雙胍格列本脲片（Ⅰ）中N-亞硝基二甲胺的方法。郭常川等［30］對樣品處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，根據(jù)藥物及雜質(zhì)的溶解性，選擇水作為提取溶劑，建立了HPLC-MS/MS 法測定二甲雙胍原料藥及制劑中NDMA 的方法。陳鴻玉等［31］采用HPLC-MS/MS法對二甲雙胍片中的基因毒性雜質(zhì)進(jìn)行了測定，并且對測定結(jié)果不確定度進(jìn)行了評價。上述研究均采用APCI 源進(jìn)行測定，而劉博等［32］選用以十八烷基鍵合相硅膠為填充劑的色譜柱，采用ESI 源為離子源，以0.1%甲酸-水為流動相A、0.1%甲酸-甲醇為流動相B，采用線性梯度洗脫方式進(jìn)行洗脫，建立了測定鹽酸二甲雙胍緩釋片中7 種亞硝胺雜質(zhì)含量的HPLC-MS/MS 法，該方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度好。上述研究表明，鹽酸二甲雙胍及其制劑中亞硝胺類基因毒性雜質(zhì)可以采用APCI 或ESI 離子源、MRM（多反應(yīng)監(jiān)測）模式進(jìn)行測定。但NDMA 等小分子物質(zhì)采用ESI 離子源電離響應(yīng)值比較低，故建議采用APCI 作為離子源，可有效電離亞硝胺類物質(zhì)，獲得較低的檢測限和較好的回收率，從而準(zhǔn)確測定鹽酸二甲雙胍及其制劑中的亞硝胺類雜質(zhì)。

4 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)相似，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)通過氣相色譜實現(xiàn)復(fù)雜化合物的有效分離，通過靈敏度較高的質(zhì)譜進(jìn)行測定，該方法尤其適用于易揮發(fā)性成分的測定。文松松等［33］對提取溶劑及提取時間進(jìn)行了優(yōu)化，選用EI 為離子源，采用SRM（選擇反應(yīng)監(jiān)測）模式，建立了測定鹽酸二甲雙胍藥物中NDMA 的GC-MS/MS 法。由于基因毒性雜質(zhì)NDMA 在二氯甲烷中具有較高的溶解度，而二甲雙胍在二氯甲烷中不溶，為減少主成分的干擾，徐小力等［34］對提取溶劑進(jìn)行了考察，最終選用二氯甲烷作為提取溶劑，采用MRM 模式，建立了GC-MS/MS 法測定鹽酸二甲雙胍緩釋片中基因毒性雜質(zhì)的方法。程奇珍等［35］也建立了測定二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅱ）中NDMA 含量的GC-MS/MS 法，結(jié)果表明，該方法線性范圍寬，線性相關(guān)性好，準(zhǔn)確度較高，重復(fù)性及精密度良好，滿足二甲雙胍格列本脲膠囊（Ⅱ）中NDMA 基因毒性雜質(zhì)殘留量的測定要求。張巖琛等［36］對HPLC-MS/MS 法及GC-MS/MS 法測定二甲雙胍原料藥及其制劑中基因毒性雜質(zhì)的結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，兩種方法無明顯差異。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定基因毒性雜質(zhì)，影響測定結(jié)果的主要因素為提取溶劑的選擇，既要滿足溶解度的要求，又要使主成分和輔料不影響測定結(jié)果。由于鹽酸二甲雙胍易溶于水，故在鹽酸二甲雙胍原料測定過程中采用水作為溶劑即可，但是在制劑測定過程中添加了輔料羥丙甲纖維素，而羥丙甲纖維素遇水膨脹，故在制劑的測定過程中應(yīng)盡量避免使用水作為溶劑。甲醇、乙醇、乙腈等溶劑溶脹體積較大，不適用于氣相色譜或氣相色譜-質(zhì)譜法的溶劑，可采用N，N-二甲基甲酰胺等溶劑。

表1 總結(jié)了鹽酸二甲雙胍類藥物中雜質(zhì)的檢測方法。

表1 鹽酸二甲雙胍類藥物中雜質(zhì)測定方法匯總

5 結(jié)語

鹽酸二甲雙胍藥物中的有關(guān)物質(zhì)主要有原料雙氰胺、二甲胺殘留以及二甲胺形成的基因毒性雜質(zhì)等，對于二甲胺的測定主要有衍生化高效液相色譜法及離子色譜法，其中衍生化較為繁雜，需要選擇合適的衍生化試劑，并且對于衍生的條件較難選擇，目前應(yīng)用較多的是離子色譜法，而對于雙氰胺的測定主要應(yīng)用高效液相色譜法。對于二甲雙胍類藥物而言，基因毒性雜質(zhì)含量較低且種類較多，測定較為困難，目前主要應(yīng)用HPLC-MS/MS 或GC-MS/MS進(jìn)行測定。未來繼續(xù)探索更簡便、更迅速的測定方法為研究人員提出了挑戰(zhàn)。希望本綜述可以為鹽酸二甲雙胍類藥物中有關(guān)物質(zhì)的測定提供參考。