小麥類鈣調(diào)素TaCML8-A基因的克隆和表達分析

賈偉哲，焦 博，王 嬌，陳文燁，楊 帆，劉永偉，董福雙，趙立群，周 碩

(1.河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院 生物技術(shù)與食品科學(xué)研究所，河北省植物轉(zhuǎn)基因中心，河北 石家莊 050051)

Ca2+是一種普遍存在于真核生物中的重要細胞信使，其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與了植物的生長發(fā)育以及對各種脅迫的響應(yīng)[1]。生物脅迫(病原體、病毒等)和非生物脅迫(冷、熱、光、干旱等)都會引起細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度的短暫升高，從而形成鈣信號[2]。植物鈣調(diào)素(Calmodulin，CaM)和類鈣調(diào)素(Calmodulin-like protein，CML)是重要的鈣離子結(jié)合蛋白，可感知和響應(yīng)環(huán)境刺激而引起的細胞內(nèi)Ca2+濃度的變化[3]，并激活下游的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。目前在擬南芥中發(fā)現(xiàn)了7個CaM基因和50個CML基因[4]，水稻中有5個CaM基因和32個CML基因[5]。典型的CaM基因高度保守，其本身沒有酶的活性，與Ca2+結(jié)合后構(gòu)象變化，和依賴于CaM介導(dǎo)的無活性酶相互作用使其構(gòu)象進一步發(fā)生改變，激活其催化活性[6-7]。CML是一類鈣調(diào)素鈣受體蛋白，與鈣調(diào)素蛋白的氨基酸相似性大于16%。與含4個EF手型的CaM不同的是，CML含有的EF手型數(shù)目1～6個不等，AtCML1含有1個，AtCML12含有6個[7]。

CaM參與了酶活性調(diào)節(jié)[6]、細胞分裂與分化[8]、光合作用[9]及基因表達等生理過程；在植物鹽脅迫(GmCaM4[10])、滲透脅迫(AmCaM1[11])、冷脅迫(AtCaM4[12])、熱激(AtCaM3[13]和TaCaM1-2[14])及生物脅迫(GmCaM4[10])等信號通路都有參與。與CaM功能相似，CML對脫落酸(AtCML9[15])、干旱(AtCML10[16]和AtCML20[17])、鹽(AtCML18[18])、冷(ShCML44[19])等非生物脅迫與生物脅迫(AtCML9[20]和AtCML42[21])均有響應(yīng)。目前發(fā)現(xiàn)，CML中也存在CaM所沒有的信號序列，如CaM不包含任何棕櫚?；蛉舛罐Ⅴ；稽c，然而在少數(shù)CML中卻有發(fā)現(xiàn)[22]。CaM和CML基因家族的成員數(shù)量差異較大，并且與生物體的基因組大小無關(guān)。進化研究表明，CML比CaM進化得更早，更具多樣化[22]。

鈣調(diào)素/類鈣調(diào)素基因的功能研究在作物物種中研究相對較少。目前小麥中已知10個CaM基因[23]和2個CML基因(TaCML36[24]和TaCML79[25])。本試驗從小麥中成功克隆出類鈣調(diào)素基因TaCML8-A，并研究了其在不同逆境脅迫下的表達特征，旨在為后續(xù)研究其生物學(xué)功能提供基礎(chǔ)理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

供試小麥品種為金禾9123(河北省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)與食品科學(xué)研究所轉(zhuǎn)基因中心實驗室保存)。

正常生長14 d后進行脅迫處理：鹽脅迫(200 mmol/L NaCl)、滲透脅迫(16.1% PEG 6000)和冷脅迫(4 ℃)，分別于0，1，3，6，12，24，48 h取樣；熱激處理(42 ℃)于0，10，20，30，60，120，180 min分別取樣。樣品液氮速凍后，-80 ℃保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物總RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 參照EasyPure Plant RNA Kit(TRANS)試劑盒使用說明提取小麥總RNA，并根據(jù)PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)反轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，于-20 ℃保存。

1.2.2 引物設(shè)計與合成 根據(jù)拼接的TaCML8-A基因序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計了克隆基因全長的引物和qRT-PCR引物，內(nèi)參選用小麥18SrRNA，所有引物序列均由生工生物上海有限公司合成(表1)。

表1 引物序列信息Tab.1 Primer sequence information

1.2.3TaCML8-A基因的克隆序列分析 以金禾9123的cDNA為模板，使用TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase試劑盒對TaCML8-A基因進行擴增。反應(yīng)體系為50 μL：cDNA模板2 μL，TaCML8-A-F/R引物各2 μL，F(xiàn)astPfu Ply DNA聚合酶1 μL，5×PCR緩沖液10 μL，PCR Stimulant 10 μL，無核酸酶水23 μL。擴增程序為：95 ℃ 5 min(預(yù)變性)；95 ℃ 30 s(變性)，62 ℃ 30 s(退火)，72 ℃ 1 min(延伸)，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃保存。目的片段回收并與T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，利用菌落PCR鑒定陽性克隆并進行測序驗證。

1.2.4TaCML8-A基因的生物信息學(xué)分析 使用生物信息學(xué)軟件對小麥TaCML8-A基因進行分析(表2)。

表2 生物信息學(xué)分析軟件及內(nèi)容Tab.2 Bioinformatics analysis software and content

1.2.5 融合表達載體構(gòu)建及亞細胞定位分析 亞細胞定位選用pEGAD載體，該載體存在EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切位點。設(shè)計引物TaCML8-A-F-EcoRⅠ和TaCML8-A-R-Hind Ⅲ，擴增目的基因，回收后用EcoRⅠ和Hind Ⅲ進行酶切并回收；而后與經(jīng)過EcoRⅠ和Hind Ⅲ酶切并回收的pEGAD-35S-EGFP載體片段進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后進行重組子篩選，將鑒定正確的融合表達載體通過凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞，并利用農(nóng)桿菌侵染法對煙草葉片葉肉細胞進行瞬時表達，以pEGAD空載體為對照，暗培養(yǎng)2 d后在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP和DAPI的熒光信號。

1.2.6TaCML8-A基因的組織表達分析 根據(jù)已得到的TaCML8-A基因為模板，利用TaKaRa SYBR Green qPCR試劑盒進行qRT-PCR反應(yīng)，檢測小麥不同組織及不同脅迫下TaCML8-A基因的表達水平。反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 2.5 μL，上下游引物各0.5 μL，qPCR Master Mix(2×)10 μL，ROX Dye 0.4 μL，去離子水 6.1 μL。反應(yīng)程序為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 34 s，40個循環(huán);在72 ℃延伸時收集熒光信號。根據(jù)擴增曲線計算基因和樣本對應(yīng)的Ct值，逆境脅迫處理0 h的表達量設(shè)為“1”，組織特性檢測將幼嫩的根中目的基因的表達量設(shè)為“1”，相對表達量采用2-ΔΔCt方法計算，每個樣品設(shè)置3個重復(fù)。最后數(shù)據(jù)用SPSS進行顯著性分析，并用Prism 8繪制柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 TaCML8-A基因克隆及序列分析

以小麥cDNA為模板進行擴增，得到一條519 bp左右的序列(圖1)，將目的條帶連接到T載體上，測序結(jié)果表明，其核苷酸序列與TaCML8-A基因序列一致。TaCML8-A基因的開放閱讀框為519 bp，編碼172個氨基酸序列，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量為18.31 ku，等電點為4.54。包含PTZ00184和FRQ1超家族，含有4個EF-hand結(jié)構(gòu)域(圖2)，分別位于

D2000.D2000 DNA Marker；TaCML8-A.TaCML8-A基因的擴增片段。D2000.D2000 DNA Marker；TaCML8-A.Gene amplification of TaCML8-A.

第17—52個，53—87個，94—129個，130—165個氨基酸，其中包含4個鈣離子結(jié)合位點，分別位于第29—41個，66—77個，107—118個，141—155個氨基酸(圖3)。

圖2 預(yù)測的TaCML8-A蛋白保守結(jié)構(gòu)域Fig.2 Predicted conserved domain of TaCML8-A protein

橫線為EF手型結(jié)構(gòu)域；虛線為Ca2+結(jié)合結(jié)構(gòu)域。The horizontal line is EF-hand domain；The dotted line is the Ca2+ binding domain.

2.2 TaCML8-A蛋白的生物信息學(xué)分析

利用NCBI選取了與TaCML8-A基因同源的5個物種的氨基酸序列進行比對，這5個同源的物種分別為野生稻(Oryzabrachyantha)(OB05G34390)、水稻(Oryzasativa)(OsCML14：Os05g0577500)、短柄草(Brachypodiumsylvaticum)(BrADI_2g15570v3)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)(AtCML15：AT1G18530)和小麥(Triticumaestivum)(TaCML8-B：TraesCS3A02G446400、TaCML9-A：TraesCS3A02G216300)。結(jié)果顯示(圖3)，TaCML8-A與TaCML8-B親緣關(guān)系最近，為98.26%；與水稻OsCML14和野生稻OB05G34390相似性分別為79.17%和78.11%；與短柄草BrADI_2g15570v3相似性為77.19%；與小麥TaCML9-A相似性為60.47%；與擬南芥AtCML15相似性為60.26%。

將TaCML8-A的氨基酸序列與來自小麥、玉米、水稻、野生稻、短柄草、黃瓜、煙草和擬南芥的氨基酸序列進行系統(tǒng)進化樹分析，結(jié)果顯示(圖4)，TaCML8-A與已報道的水稻OsCML14和短柄草BrADI_2g15570v3親緣關(guān)系較近，同屬CML家族，表明TaCML8-A可能具有植物類鈣調(diào)素基因的生物學(xué)功能。

圖4 8種植物的CaM/CML蛋白系統(tǒng)進化樹分析Fig.4 Phylogenetic tree of CaM/CML proteins in 8 plants

2.3 TaCML8-A蛋白的亞細胞定位

構(gòu)建了GFP-TaCML8-A的亞細胞定位載體，并利用農(nóng)桿菌侵染煙草葉片的方法，在激光共聚焦顯微鏡下觀察到TaCML8-A蛋白在細胞核、細胞膜中均有表達(圖5)。

圖5 TaCML8-A蛋白在煙草葉肉細胞的亞細胞定位Fig.5 Subcellular localization of TaCML8-A protein in tobacco mesophyll cells

2.4 TaCML8-A基因組織表達分析

為了研究TaCML8-A的組織表達特異性，分別選取小麥幼嫩的根和地上部分以及成熟的根、莖、葉、花和種子進行定量PCR分析，結(jié)果顯示，TaCML8-A基因在小麥幼嫩的根、幼嫩的地上部分和成熟的根、莖、葉和花中均有表達，但表達豐度不同；在種子和花中幾乎不表達(圖6)。以在幼嫩根中的表達量為“1”，TaCML8-A基因在成熟根中表達水平顯著高于其他組織，其表達量是幼嫩根中的1.144倍，在幼嫩的地上部分、成熟的莖和葉中的表達量依次為在幼嫩根中表達量的20.4%，1.6%，12.6%。

1.幼嫩根；2.幼嫩的地上部分；3.成熟根；4.成熟莖；5.成熟葉；6.成熟花；7.種子。不同小寫字母表示差異顯著(P <0.05)。圖7同。

2.5 TaCML8-A基因的表達特性

為了研究TaCML8-A是否參與植物應(yīng)對非生物脅迫，將長至三葉期的小麥分別置于鹽(NaCl)、滲透(PEG)、冷(4 ℃)脅迫處理0，1，3，6，12，24，48 h，熱激處理0，10，20，30，60，120，180 min，對TaCML8-A進行表達分析，結(jié)果如圖7所示。NaCl處理時，TaCML8-A基因在根和地上部分的表達量變化趨勢相似，均為1 h表達量達到最高，隨后下降，24 h又有所上升，后下降。在根中表達量最高時上升約為5倍，而在地上部分上升約為75倍。

圖7 TaCML8-A基因在各種脅迫下的相對表達Fig.7 Relative expression of TaCML8-A gene in abiotic stresses

滲透處理時，TaCML8-A基因在根中的表達量變化較明顯，1 h表達量達到最高，上升約5.5倍，而后下降；在地上部分中的表達量1 h上升約24倍，而后下降，12 h又上升，隨后下降至初始水平。

冷處理時，TaCML8-A基因在根中的表達量1 h上升約8倍，而后下降，6 h又有所上升，24 h開始下降；在地上部分中的表達量1 h顯著上升約160倍，隨后下降，6 h上升約120倍，而后下降，24 h上升約20倍，隨后下降。

熱激處理時，TaCML8-A基因在根中的表達量受到誘導(dǎo)，10 min上升約8倍，隨后下降；而在地上部分中的表達量受到明顯的抑制，10 min下降約3倍，隨后的不同時間點表達變化不大。

3 結(jié)論與討論

CML對鹽、干旱等非生物脅迫均表現(xiàn)出一定敏感性。擬南芥AtCML18參與鹽脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)[18]；AtCML24能正向調(diào)節(jié)植物對脫落酸的反應(yīng)，而負向調(diào)節(jié)植物對離子脅迫的抗性[26]；AtCML10能通過調(diào)節(jié)抗壞血酸的合成，調(diào)節(jié)植物抵抗干旱、臭氧和紫外線的應(yīng)激反應(yīng)[27]。AtCML20可能作為植物體內(nèi)的Ca2+信號響應(yīng)蛋白，參與調(diào)控氣孔運動與植物抗干旱過程[17]。水稻OsCML4[28]和OsCML31[5]均正調(diào)節(jié)了植物的耐旱性。番茄ShCML44過表達植株對寒冷、干旱和鹽堿脅迫均表現(xiàn)出明顯的耐受性，并且發(fā)芽率高，幼苗生長好[19]。

本研究從小麥中成功克隆出類鈣調(diào)素基因TaCML8-A。通過生物信息學(xué)分析得知，TaCML8-A基因CDS區(qū)全長為519 bp，編碼172個氨基酸，含有4個EF-hand結(jié)構(gòu)域，其中包含4個鈣離子結(jié)合位點。氨基酸序列比對和系統(tǒng)進化樹分析發(fā)現(xiàn)，TaCML8-A基因與水稻OsCML14蛋白的同源性高于其他物種。亞細胞定位顯示，TaCML8-A蛋白質(zhì)在細胞核和細胞膜中均有分布。qRT-PCR結(jié)果顯示，TaCML8-A基因在小麥的不同組織中均有表達，且在成熟的根中表達量最高。在受到鹽、滲透、冷和熱脅迫處理后的TaCML8-A基因表達量變化不同，結(jié)果顯示，在NaCl、滲透和冷脅迫處理中，TaCML8-A基因在地上部分和根中的表達均上升，3 h下降，且在地上部分的表達量上升幅度遠大于根中，表明植物可能通過提高TaCML8-A基因的表達來響應(yīng)鹽、滲透和冷脅迫，待適應(yīng)逆境后，TaCML8-A基因的表達下降；熱激時TaCML8-A基因在根和地上部分分別受到誘導(dǎo)和抑制，從而發(fā)揮不同的功能。本研究中，TaCML8-A的表達受到鹽、滲透、冷和熱脅迫的誘導(dǎo)或抑制，說明該基因可能參與調(diào)控植物的非生物脅迫，為隨后研究其生物學(xué)功能提供了堅實的基礎(chǔ)理論支撐。