桔皮素對(duì)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的體外作用及作用機(jī)制*

劉瑩瑩，陽(yáng)劉康，盧 偉，張遠(yuǎn)洋，劉 偉△

（1.湖北省十堰市太和醫(yī)院·湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，湖北 十堰 442000； 2.湖北醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，湖北 十堰 442000）

卵巢癌疾病早期缺乏有效的生物診斷標(biāo)志，導(dǎo)致超過(guò)70%的患者確診時(shí)已為晚期，5 年生存率低于30%［1-2］。桔皮素是一種提取于川橘果皮和柑橘莖葉等的黃酮類化合物，具有抗菌、抑制惡性腫瘤細(xì)胞和嗜堿性細(xì)胞組胺釋放等作用［3］，可有效抑制結(jié)腸癌和乳腺癌細(xì)胞體外的增殖［4］。Ras/ 絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（MEK）/ 細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號(hào)通路在癌癥中常被解除調(diào)控，對(duì)于癌癥的發(fā)生起關(guān)鍵作用［5］。約15%的癌癥中存在突變的Ras 致癌形式，約30%的癌癥中ERK 過(guò)度激活對(duì)于Ras/ MEK/ ERK 信號(hào)通路的解除起調(diào)節(jié)作用［6］。此外，在黑色素瘤、甲狀腺癌、結(jié)直腸癌中均發(fā)現(xiàn)Ras/MEK/ERK 信號(hào)通路的異常表達(dá)［7］。盡管MEK 本身的激活突變?cè)谌祟惏┌Y中尚未被發(fā)現(xiàn)，其在ERK 通路中的中心作用被認(rèn)為是治療人類癌癥的重要靶點(diǎn)［8］。本研究中探討了桔皮素對(duì)卵巢癌細(xì)胞的體外作用及其對(duì)Ras/MEK/ERK 信號(hào)通路的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

儀器：BSC - 1100ⅡB2 - X 型生物安全柜、BKQ -B75 型高壓蒸汽滅菌鍋、BJPX - 300L CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（中國(guó)博科公司）；5320R 型離心機(jī)（德國(guó)徠卡公司）；伯樂(lè)Mini - PRO TEAN 型電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；EVOS M7000 型倒置顯微鏡（意大利賽默飛公司）；LAS 4000型成像系統(tǒng)、Bio - Rad 型微孔板閱讀器（美國(guó)GE Healthcare 公司）；BD FACSCantoⅡ型流式細(xì)胞儀（美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司）；VCX 500 型超聲細(xì)胞破碎儀（中國(guó)苑勝公司）。

試藥：桔皮素（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為849542）；阿霉素（南京建成生物有限公司，批號(hào)為621548）；RPMI 1640 培養(yǎng)基（批號(hào)為2154849），胎牛血清（批號(hào)為5549154），胰蛋白酶（批號(hào)為8444124），均購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒8（CCK-8，上海優(yōu)寧維生物有限公司，批號(hào)為2011252）；V-熒光素異硫氰酸酯（FITC）凋亡試劑盒（美國(guó)Sun-Shine公司，批號(hào)為2011594）；Ras 蛋白抗體（批號(hào)為20205949），MEK 蛋白抗體（批號(hào)為20206423），ERK 蛋白抗體（批號(hào)為20205571），β-actin 蛋白抗體（批號(hào)為20178849），均購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；山羊抗兔二抗（武漢三鷹生物有限公司，批號(hào)為59487145）。

細(xì)胞：卵巢癌SKOV3細(xì)胞株（武漢普諾賽生命科技有限公司）。

1.2 方法

細(xì)胞培養(yǎng)：從液氮罐中取卵巢癌SKOV3 細(xì)胞株凍存管1 支進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇，將復(fù)蘇后的細(xì)胞置RPMI 1640培養(yǎng)基中，采用細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行分裝，并放置在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h 后更換培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞覆蓋率達(dá)到70%時(shí)，在培養(yǎng)皿中加入胰蛋白酶進(jìn)行細(xì)胞傳代。在指定時(shí)間內(nèi)，用不同質(zhì)量濃度（2，5，10μmoL/L）的桔皮素和75 nmol/L阿霉素處理細(xì)胞［9］。

細(xì)胞分組：將細(xì)胞分為空白對(duì)照組（A組，0μmol/L），陽(yáng)性對(duì)照組（B組，阿霉素75 nmol/L），桔皮素低、中、高劑量組（分別為C1組、C2組、C3組，桔皮素2，5，10μmol/L）。

細(xì)胞處理：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的卵巢癌SKOV3細(xì)胞，在培養(yǎng)皿中加入1 mL 胰蛋白酶，輕微吹打2 min，使細(xì)胞完全懸浮。將懸浮的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至1.5 mL 離心管中，離心（轉(zhuǎn)速為2 000 r/min）10 min，棄去上清液；加入1 mL RPMI 1640 培養(yǎng)基，并輕微吹打細(xì)胞，使細(xì)胞充分懸浮，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至96孔板中，每孔100μL，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄去96 孔板中的培養(yǎng)基；每孔中依次加入新的RPMI 1640 培養(yǎng)基。按細(xì)胞分組項(xiàng)下方法加入藥物，每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)液。

CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞存活率：取細(xì)胞處理項(xiàng)下的各組細(xì)胞，每孔加入100 μL 培養(yǎng)液和10 μL CCK - 8 溶液，持續(xù)培養(yǎng)3 h，使用Bio - Rad 型微孔板閱讀器讀取450 nm波長(zhǎng)處的吸光度，重復(fù)3次，并計(jì)算細(xì)胞存活率。

改良Matrigel Boyden 室測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞侵襲性：取細(xì)胞處理項(xiàng)下的各組細(xì)胞，將細(xì)胞接種至有基質(zhì)膠的濾膜上，濾膜下室倉(cāng)中放入10%胎牛血清，作為趨化劑，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出濾膜，染色，使用EVOS M7000 型倒置顯微鏡對(duì)濾膜上的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。每個(gè)濾膜隨機(jī)選擇5個(gè)視野，重復(fù)3次，取平均值。

流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率：取細(xì)胞處理項(xiàng)下的各組細(xì)胞，使用FITC凋亡試劑盒，用磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞2 次，用1X 結(jié)合緩沖液在1×106個(gè)細(xì)胞/mL 濃度下懸浮于400μL V-FITC溶液中，黑暗中室溫孵育15 min，加入PI 10 μL，4 ℃避光孵育5 min，立即用BD FACSCanto Ⅱ型流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞，重復(fù)3次。

蛋白免疫印跡法檢測(cè)細(xì)胞Ras，MEK，ERK 蛋白表達(dá)水平：取細(xì)胞處理項(xiàng)下的各組細(xì)胞，取出培養(yǎng)皿，放入無(wú)菌操作臺(tái)，棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，并加入1 mL 磷酸鹽緩沖液和100μL 蛋白酶K 溶液，使細(xì)胞懸浮，采用VCX 500 型超聲細(xì)胞破碎儀作用2 min 破碎細(xì)胞，采用5320R 型離心機(jī)離心（轉(zhuǎn)速為3 000 r/min），4 ℃下處理20 min，取上清液，置1 支新的1.5 mL EP 管中。經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳分離、轉(zhuǎn)膜、封閉，用特異性抗體Ras，MEK，ERK，β-actin于4 ℃下孵育12 h，用1%吐溫清洗孵育后的條帶3 次，二抗孵育2 h，經(jīng)LAS 4000 型成像系統(tǒng)成像，并觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析。計(jì)量資料以±s表示，行單因素方差分析，并采用LSD-t檢驗(yàn)行多重比較。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞存活率、侵襲細(xì)胞數(shù)和凋亡率

與A 組比較，B 組、C1組、C2組、C3組卵巢癌SKOV3的細(xì)胞存活率均顯著降低，細(xì)胞凋亡率均顯著升高，侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少，且C1組、C2組、C3組效應(yīng)呈劑量依賴性（P＜0.05）；但C3組和B 組上述指標(biāo)比較均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。詳見(jiàn)表1、圖1和圖2。

圖2 桔皮素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡率的影響Fig.2 Effect of tangeretin on apoptosis rate of ovarian cancer SKOV3 cells

表1 桔皮素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞存活率、凋亡率、侵襲細(xì)胞數(shù)的影響（±s，n=3）Tab.1 Effect of tangeretin on survival rate，apoptosis rate and invasion number of ovarian cancer SKOV3 cells（±s，n=3）

表1 桔皮素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞存活率、凋亡率、侵襲細(xì)胞數(shù)的影響（±s，n=3）Tab.1 Effect of tangeretin on survival rate，apoptosis rate and invasion number of ovarian cancer SKOV3 cells（±s，n=3）

注：與A組比較，aP ＜0.05；與C1組比較，bP ＜0.05；與C2組比較，cP ＜0.05；與B組比較，dP ＜0.05。表2同。Note：Compared with those in group A，aP ＜0.05（for Tab.1-2）；Compared with those in group C1，bP ＜ 0.05（for Tab.1 - 2）；Compared with those in group C2（for Tab.1 - 2），cP ＜ 0.05；Compared with those in group B，dP ＜0.05（for Tab.1-2）.

組別A組B組C1組C2組C3組藥物濃度0 75 nmol/L 2μmol/L 5μmol/L 10μmol/L細(xì)胞存活率（%）98.11±8.55 31.17±6.29abc 78.22±8.62ad 55.35±8.53abd 31.26±6.74abc細(xì)胞凋亡率（%）14.83±4.37 61.84±5.89abc 24.59±4.28ad 41.28±4.77abd 61.71±5.36abc侵襲細(xì)胞數(shù)（個(gè)）169.57±13.55 71.53±11.53abc 131.55±12.78ad 102.87±12.89abd 72.45±11.77abc

2.2 Ras，MEK，ERK 蛋白表達(dá)水平

與A 組比較，B 組、C1組、C2組、C3組卵巢癌SKOV3細(xì)胞Ras，MEK，ERK 蛋白表達(dá)水平均顯著降低，且C1組、C2組、C3組效應(yīng)呈劑量依賴性（P＜0.05）；C3組和B組上述指標(biāo)比較均無(wú)顯著差異（P＞0.05）。詳見(jiàn)表2和圖3。

圖3 桔皮素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞Ras，MEK，ERK蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of tangeretin on the expression of Ras，MEK and ERK protein in ovarian cancer SKOV3 cells

表2 桔皮素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞Ras，MEK，ERK蛋白表達(dá)水平的影響（±s，n=3）Tab.2 Effect of tangeretin on the expression levels of Ras，MEK and ERK proteins in ovarian cancer SKOV3 cells（±s，n=3）

表2 桔皮素對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞Ras，MEK，ERK蛋白表達(dá)水平的影響（±s，n=3）Tab.2 Effect of tangeretin on the expression levels of Ras，MEK and ERK proteins in ovarian cancer SKOV3 cells（±s，n=3）

組別A組B組C1組C2組C3組藥物濃度0 75 nmol/L 2μmol/L 5μmol/L 10μmol/L Ras/β-actin 0.92±0.08 0.17±0.04 abc 0.69±0.07ad 0.32±0.05abd 0.21±0.05abc MEK /β-actin 0.81±0.07 0.15±0.04 abc 0.57±0.06ad 0.35±0.05abd 0.17±0.04abc ERK/β-actin 0.94±0.09 0.27±0.05abc 0.82±0.09ad 0.59±0.08abd 0.38±0.05abc

3 討論

卵巢癌的發(fā)病率在女性惡性腫瘤中僅次于宮頸癌和子宮體癌，卵巢上皮癌是死亡率最高的婦科腫瘤［10］。由于卵巢體積小且位于盆腔內(nèi)，卵巢癌早期無(wú)明顯臨床癥狀，易錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)間，導(dǎo)致癌細(xì)胞擴(kuò)散至盆腔內(nèi)的臟器時(shí)，疾病已發(fā)展至晚期，增加了臨床治療的難度［11］。桔皮素具有抑制癌細(xì)胞增殖、黏附、轉(zhuǎn)移、凋亡等潛在的抗癌作用［12］，可通過(guò)降低過(guò)氧化應(yīng)激引起的前列腺癌細(xì)胞中相關(guān)氧化應(yīng)激因子的表達(dá)水平來(lái)抑制細(xì)胞的侵襲和逆轉(zhuǎn)。此外，桔皮素還可減弱乳腺癌、肝癌和肺癌細(xì)胞的生存能力，并誘導(dǎo)其凋亡［13］。本研究中檢測(cè)了不同濃度的桔皮素對(duì)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的影響，由表1 可知，桔皮素可促進(jìn)卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的凋亡，抑制其增殖，減弱其侵襲能力，且呈劑量依賴性，表明桔皮素可有效減慢卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的增殖速度，通過(guò)抑制其侵襲能力而阻止腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散，同時(shí)通過(guò)增加其細(xì)胞凋亡率而延緩疾病進(jìn)程。

Ras/MEK/ERK 信號(hào)通路與機(jī)體氧化應(yīng)激密切相關(guān)，其異常高表達(dá)在多種癌癥的轉(zhuǎn)移過(guò)程中起關(guān)鍵作用［14］。ERK 是機(jī)體中維持細(xì)胞氧化還原平衡的關(guān)鍵翻譯因子［15］，其表達(dá)的增加可誘導(dǎo)下游基因Ras 和MEK的表達(dá)，使細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激因子羥自由基水平升高，進(jìn)一步加重機(jī)體氧化應(yīng)激，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和遷移的活性增加，加重病情［16］。由表2 可知，未對(duì)卵巢癌SKOV3細(xì)胞進(jìn)行任何處理時(shí)，Ras，MEK，ERK 蛋白均呈高表達(dá)；給予桔皮素干預(yù)后，Ras，MEK，ERK 的蛋白表達(dá)均下調(diào)，且具有明顯的劑量依賴性?？梢?jiàn)桔皮素可能通過(guò)調(diào)節(jié)Ras/MEK/ERK 信號(hào)通路來(lái)降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，下調(diào)細(xì)胞氧化應(yīng)激因子的表達(dá)，從而抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞的增殖和侵襲，并促進(jìn)其凋亡。

綜上所述，桔皮素可有效抑制卵巢癌SKOV3 細(xì)胞的增殖與侵襲，并促進(jìn)其凋亡，效果與桔皮素的劑量密切相關(guān)，作用機(jī)制可能與抑制Ras/MEK/ERK 信號(hào)通路的蛋白表達(dá)有關(guān)，但具體作用機(jī)制有待深入探究。