鐵皮石斛內(nèi)生真菌Fusarium sp.TP-G1 的次生代謝產(chǎn)物研究*

宋小仙，徐 進，羅明和，張 應(yīng)，2△

（1.重慶市中藥研究院，重慶 400065； 2.重慶市疾病預(yù)防控制中心，重慶 400042）

植物內(nèi)生菌是與健康植物共生或僅一段時間寄生在植物體內(nèi)的微生物，與植物共生或寄生，相互影響，與植物體一樣能產(chǎn)生大量結(jié)構(gòu)新穎的活性次生代謝產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，植物含有或產(chǎn)生的活性產(chǎn)物極可能來自其內(nèi)生菌。微生物資源可進行基因工程改造，并通過發(fā)酵工程等技術(shù)提高其產(chǎn)量，環(huán)境友好，可持續(xù)利用，是目前藥用植物研究的重要方向。鐵皮石斛味甘，性微寒，含有多種生物活性成分，其提取物具有抗腫瘤、抗凝血、調(diào)血脂、調(diào)血壓、提高免疫力和抗衰老等藥用價值和保健功效。前期研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌Fusariumsp.TP-G1的次生代謝產(chǎn)物trichosetin，beauvericins，enniatins，fusaric acid 具有抗菌、抗腫瘤、降血壓等活性，提示植物內(nèi)生菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物與藥用植物的功效有一定關(guān)聯(lián)性［1-6］。本研究中以藥用植物鐵皮石斛內(nèi)生真菌Fusariumsp.TP-G1為研究對象，并對其大米發(fā)酵產(chǎn)物的次生代謝物進行初步研究。本研究中對Fusariumsp.TP-G1 的次生代謝產(chǎn)物進行分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定，發(fā)現(xiàn)已知的6種化合物中化合物3至化合物6為新的氨基醇類天然產(chǎn)物?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器Agilent 600 MHz DD2 型核磁共振儀（600/150 MHz，四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)）；Bruker amazon SL 型離子肼質(zhì)譜儀；Agilent 1260型高效液相色譜儀（配有PDA檢測器）；YMC-pack ODS-A型色譜柱（250 mm×10 mm，5μm）；HS-GF254硅膠薄層板（煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司）。

試劑：乙腈（色譜純，安徽時聯(lián)特種溶劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.2 菌株來源

植物內(nèi)生真菌Fusariumsp.TP-G1 是從藥用植物鐵皮石斛中分離而來，并已鑒定［1］。

1.3 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯（200 g/L），切成小塊，加水煮沸30 min，用紗布過濾，取濾液，加葡萄糖（20 g/ L）、海鹽（30 g/ L）、2%瓊脂粉，115 ℃滅菌30 min。

馬鈴薯葡萄糖水（PDB）培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基配方中不加2%瓊脂粉，115 ℃滅菌30 min。

大米培養(yǎng)基：大米100 g，酵母粉0.2%，NaH2PO40.02%，KNO30.05%，NaCl 1%，121 ℃滅菌30 min。

1.4 菌株的發(fā)酵培養(yǎng)

吸取50 mL PDB 培養(yǎng)基，置250 mL 錐形瓶中，從PDA 平板上接入真菌Fusariumsp.TP - G1 的菌絲體，于28 ℃、200 r/ min 搖床上培養(yǎng)2 d，作為發(fā)酵種子液，分別轉(zhuǎn)入含300 g 大米培養(yǎng)基的2 L 錐形瓶中，室溫靜置發(fā)酵30 d，共發(fā)酵2.5 kg。

1.5 發(fā)酵產(chǎn)物提取和分離

將靜置發(fā)酵產(chǎn)物用甲醇浸提，甲醇經(jīng)蒸餾濃縮后得到總浸膏，粗浸膏伴樣，過一正相柱，用氯仿- 甲醇體系（100∶0，99∶1，98∶2，96∶4，94∶6，92∶8，90∶10，85∶15，80∶20，5∶5，V/V）梯度洗脫，得Fr.A1～A10 共10 個餾分。Fr.A2 采用正相硅膠氯仿-甲醇體系和乙酸乙酯-石油醚體系反復(fù)純化，分離獲得化合物1（50 mg）、化合物2（30 mg）。Fr.A（3-5）合并后，采用中壓反相液相色譜（MPLC）法（條件為5%～60%乙腈50 min，60%～100%乙腈40 min），分別得到Fr.B1～B5。Fr.B1～B3合并后，采用相同條件MPLC 法獲得Fr.C1～C8。Fr.C2 和Fr.C7 分別采用高效液相色譜（HPLC）法制備獲得化合物4（20 mg）、化合物3（18 mg）。Fr.C 4～6合并后，采用HPLC法制備獲得化合物5（15 mg）、化合物6（16 mg）。

2 結(jié)果與分析

各化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

化合物1：1H NMR（CDCl3600 MHz）δH：5.54（1H，dd，J =5.4，2.4 Hz），5.36（1H，m），5.19（1H，dd，J =7.2，15.0 Hz），5.15（1H，d，J =7.8，15.6 Hz），3.61（1H，m），1.01（3H，d，J=6.6 Hz，CH3-21），0.92（3H，s，CH3- 19），0.89（3H，d，J =7.2 Hz，CH3- 28），0.82（3H，d，J=6.6 Hz，CH3-26），0.80（3H，d，J=6.6 Hz，CH3- 27），0.61（3H，s，CH3- 18）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）δC：12.3（C - 18，CH3），16.5（C - 28，CH3），17.8（C-19，CH3），19.9（C-26，CH3），20.2（C-27，CH3），21.3（C-11，CH2），21.3（C-21，CH3），23.2（C-15，CH2），28.5（C-16，CH2），32.2（C-2，CH2），33.3（C-25，CH），37.3（C-1，CH2），38.6（C-10，C），39.3（C-12，CH2），40.6（C-20，CH），41.0（C-4，CH2），43.0（C-24，CH），43.1（C-13，C），46.5（C-9，CH），54.8（C-14，CH），56.0（C - 17，CH），70.7（C - 3，CH），116.5（C-7，CH），119.8（C - 6，CH），132.2（C - 23，CH），135.8（C-22，CH），140.0（C-5，C），141.6（C-8，C）。與文獻［7］報道的麥角甾醇的核磁數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物1為麥角甾醇。

化合物2：1H NMR（CDCl3600 MHz）δH：6.21（1H，d，J =8.4 Hz），6.47（1H，d，J =8.4 Hz），5.19（1H，d，J=7.8，15 Hz），5.11（1H，d，J=7.8，15 Hz），3.93（1H，m）；13C NMR（CDCl3，150 MHz）δC：12.9（C - 18，CH3），17.5（C-28，CH3），18.1（C-19，CH3），19.6（C-21，CH3），20.0（C-26，CH3），20.6（C-11，CH2），20.9（C- 27，CH3），23.4（C-16，CH2），28.6（C-15，CH2），30.1（C-2，CH2），33.1（C-25，CH），34.7（C-4，CH2），37.0（C-10，C），37.1（C-1，CH2），39.4（C-12，CH2），39.7（C-20，CH），42.7（C-24，CH），44.6（C-13，C），51.1（C-18，CH3），51.7（C-14，CH），56.2（C-17，CH），66.5（C-3，CH），79.4（C - 5，C），82.1（C - 8，C），130.7（C - 6，CH），132.3（C - 22，CH），135.2（C - 23，CH），135.4（C-7，CH）。與文獻［8］報道的（22E，24R）-ergosta-6，22-dien-3β，5α，8α-triol的核磁數(shù)據(jù)一致，故確定該化合物2為（22E，24R）-ergosta-6，22-dien-3β，5α，8α-triol。

化合物3：H譜低場區(qū)的5 個芳環(huán)H質(zhì)子信號結(jié)合C譜低場區(qū)的C原子信號提示結(jié)構(gòu)中可能含有1 個單取代苯環(huán)，而二維多鍵碳氫關(guān)系（HMBC）譜中7.20/130.5；7.25/127.3，130.5；7.29/129.4，140.1 的相關(guān)信號進一步驗證單取代苯環(huán)片段。高場區(qū)通過異核單量子關(guān)系（HSQC），HMBC 譜中的相關(guān)信號可推測2 個脂肪鏈片段。上述3個片段通過二維HMBC譜中2.71，2.9/130.5，140.1；7.25/38.6；3.80/140.1，158.0連接成化合物3的結(jié)構(gòu)。最后，根據(jù)高分辨獲得的分子式C14H21NNaO3，鑒定化合物3 為tert - butyl（1 - hydroxy - 3 - phenylpropan-2-yl）carbamate。其核磁數(shù)據(jù)歸屬為，1H NMR（CD3OD 600 MHz）δH：1.40（9H，s），2.71（1H，dd，J=8.4，13.2 Hz，），2.90（1H，dd，J=6，13.8 Hz），3.52（2H，d，J=5.4 Hz），3.80（1H，m），7.20（1H，t，J=6.0 Hz），7.27（4H，m）；13C NMR（CD3OD，150 MHz）δC：28.9，38.6，55.4，64.6，80.0，127.3，129.4，130.5，140.1，158.0；（+）-HR-ESI-MSm/z274.141 7（［M+Na］+，計算得到C14H21NNaO3，274.141 4）。與文獻［9］報道的tert-butyl（1-hydroxy-3-phenylpropan-2-yl）carbamate 的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物3 為tert -butyl（1 - hydroxy - 3 - phenylpropan - 2 - yl）carbamate。

化 合 物4：1H NMR（CD3OD 600 MHz）δH：2.79（1H，dd，J=6.6，13.2Hz），2.85（1H，dd，J=6.6，13.8Hz），4.09（2H，m），4.33（1H，m），7.21（2H，d，J= 7.8 Hz），7.23（1H，d，J= 7.8 Hz），7.30（2H，t，J= 7.8 Hz）；13C NMR（CD3OD，150 MHz）δC：41.9，54.9，70.7，128.0，129.8，130.5，137.8，162.1。與文獻［10］報道的化合物（1-hydroxy - 3 - phenylpropan - 2 - yl）carbamic acid 的核磁數(shù)據(jù)基本一致，故鑒定化合物4為該化合物。

化合物5：1H NMR（DMSO -d6600 MHz）δH：2.78（1H，dd，J=9.0，13.8 Hz），2.94（1H，dd，J=4.8，13.8 Hz），3.42（1H，m），3.49（1H，m），4.15（1H，m），4.84（1H，t，J= 6.6 Hz），7.13（1H，t，J= 6.6 Hz），7.24（4H，m），7.41（2H，t，J=7.8 Hz），7.47（1H，t，J=7.2 Hz），7.77（2H，d，J=7.8 Hz），8.15（1H，d，J=8.4 Hz）；13C NMR（DMSO -d6，150 MHz）δC：36.9，53.7，63.3，126.3，127.6，128.5，128.6，129.5，131.4，135.2，139.9，166.4。與文獻［11］報道的化合物N-（1-hydroxy-3-phenylpropan-2-yl）benzamide 的核磁數(shù)據(jù)一致，故鑒定該化合物為化合物5。

化合物6：H譜、C譜的低場區(qū)信號，結(jié)合二維HMBC譜可推測含有兩個單取代苯環(huán)。而高場區(qū)的H 譜、C 譜信號及1 個肽鍵C 原子信號173.9，結(jié)合二維HSQC，HMBC譜中4.14/139.8，173.9，38.0，64.4；3.45/130.2，173.9，137.0，提示化合物6 中含有1 個連苯環(huán)并含有1 個肽鍵的脂肪鏈片段。二維HMBC 譜中信號2.70，2.92/ 130.5，139.8；7.17/ 38.0；3.45/ 130.2，137.0；7.14/ 44.1 顯示含有1 個肽鍵的脂肪鏈片段通過2 個—CH2與兩個單取代苯環(huán)分別連接成化合物6的結(jié)構(gòu)。最后，根據(jù)高分辨獲得的分子式C17H19NNaO2進一步確認，鑒定化合物6為N-（1-hydroxy-3-phenylpropan-2 - yl）- 2 - phenylacetamide。其核磁數(shù)據(jù)歸屬為，1H NMR（CD3OD 600 MHz）δH：2.70（1H，dd，J= 9.0，13.8 Hz），2.91（1H，dd，J= 6.0，13.8 Hz），3.42（1H，d，J=14.4 Hz），3.46（1H，d，J=14.4 Hz），3.53（2H，d，J=5.4 Hz），4.13（1H，m），7.13（2H，d，J=7.8 Hz），7.17（3H，m），7.22（5H，m）；13C NMR（CD3OD，150 MHz）δC：38.0，44.1，54.3，64.4，127.4，127.9，129.5，129.6，130.2，130.5，137.0，139.8，173.9.（+）- HR - ESI -MSm/z292.131 1 （［M + Na］+，計 算 得 到C17H19NNaO2，292.130 8）。與文獻［12］報道的化合物N-（1 - hydroxy - 3 - phenylpropan - 2 - yl）- 2 -phenylacetamide 的核磁數(shù)據(jù)一致，故鑒定化合物6 為該化合物。

3 討論

本研究中鐵皮石斛內(nèi)生真菌Fusariumsp.TP - G1的大米發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得化合物3 至化合物6 的氨基醇類天然產(chǎn)物，并對上述化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定，發(fā)現(xiàn)菌株的營養(yǎng)和生長條件對其次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)生重大影響。氨基醇類化合物是一類用途廣泛的有機化合物，在化學(xué)合成和藥物化學(xué)中都有重要應(yīng)用［11］。在化學(xué)合成中，氨基醇類化合物可用作手性助劑拆分不對稱合成中的外消旋混合物；在藥物化學(xué)中，氨基醇是某些重要藥物的藥效基團，如抗逆轉(zhuǎn)錄病毒蛋白酶抑制劑沙奎那韋、利托那韋、洛匹那韋、印地那韋、奈非那韋和安普列那韋，可特異性地使蛋白酶失活，阻止人類免疫缺陷病毒的復(fù)制。目前，主要通過化學(xué)合成獲得氨基醇類化合物，但其化學(xué)反應(yīng)條件劇烈，產(chǎn)量低，純化困難［11］。前期研究發(fā)現(xiàn)，化合物3 至化合物6 僅可通過化學(xué)合成獲得。本研究中從鐵皮石斛內(nèi)生真菌Fusariumsp.TP-G1的大米發(fā)酵產(chǎn)物中分離獲得4 個新的天然氨基醇類次生代謝產(chǎn)物，表明微生物是氨基醇類化合物的新供體，后期可通過微生物的基因工程改造來獲得更多的氨基醇類化合物，并對其生物合成機制進一步進行闡釋。