維藥多傘阿魏的化學成分研究

金鵬飛，李敏，李韶勇，尹宏權，唐生安

（1. 北京醫(yī)院 藥學部 國家老年醫(yī)學中心 中國醫(yī)學科學院老年醫(yī)學研究院 北京市藥物臨床風險與個體化應用評價重點實驗室(北京醫(yī)院)，北京 100730；2. 天津醫(yī)科大學 藥學院 天津市臨床藥物關鍵技術重點實驗室，天津 300070；3. 北京理工大學 化學與化工學院，北京 102488）

多傘阿魏(Ferula. ferulaeoides(Steud.) Korov.)屬于傘形科(Apiaceae)阿魏屬Ferula L.，主要分布于地中海、中亞及其鄰近地區(qū)[1]. 此外，多傘阿魏是我國新疆地區(qū)所特有的植物資源，主要分布于我國新疆地區(qū)的沙丘、沙地等地方，也是我國新疆維吾爾族的傳統(tǒng)民間用藥，被廣泛用于治療胃潰瘍、風濕性關節(jié)炎等疾病[2].

研究表明，多傘阿魏主要含有倍半萜類、倍半萜香豆素等化學成分. 倍半萜類化合物多以酯或內酯的形式存在，且多具有生物活性[1]. 現(xiàn)代藥理學表明，多傘阿魏中分離純化得到的香豆素類化合物DAW-22可以上調caspase-8和PARP的表達以及下調Bcl-2的表達來誘導細胞凋亡[3]，并且可以有效抑制惡性外周神經鞘瘤(MPNST)的增殖[4]. 在對多傘阿魏提取物抗腫瘤活性的研究中，發(fā)現(xiàn)多傘阿魏香豆素類化合物能夠抑制人肝癌細胞株(SMMC-7 721)和人胃癌細胞(SGC-7 901)的增殖[5]. 為了明確多傘阿魏的主要化學成分，以便進一步開發(fā)和利用，本文采用各種柱色譜分離技術以及多種現(xiàn)代波譜學手段從多傘阿魏藥材中分離鑒定15個單體化合物，其中包含7個萜類化合物，8個香豆素類化合物，分別為1- (2- hydroxyl-4- methoxybenzoyl)- 2S*- hydroxy- 5,9,13- trimethyl-4(E),8(E),12- tetradecatrien- 1- one (1)，愈創(chuàng)木醇 (2)，1-(2,4- dihydroxyphenyl)- 3,7,11- trimethyl- 3- vinyl-6(E),10- dodecadiene- 1- one (3)，dshamirone (4)， 2,3-dihydro-7- hydroxy- 2S*,3R*- dimethyl- 2- [4,8-dimethyl- 3(E),7- nonadienyl]- furo[3,2-c]coumarin (5)，3- (2-hydroxyl-4-methoxybenzoyl)- 4S*,5R*- dimethyl- 5- [4,8- dimethyl-3(E),7(E)- nonadien- 1- yl]tetrahydro- 2- furanone (6)，fukanedone A (7)，2,3- dihydro- 7- methoxy- 2S*,3R*-dimethyl- 2- [4- methyl- 5- (4-methyl-2-furyl)- 3(E)-pentenyl]- furo[3,2-c]coumarin (8)，傘 形 花 素 (9)，2,3-dihydro- 7- methoxy- 2S*,3S*- dimethyl- 3- [4,8- dimethyl-3(E),7- nonadienyl]- furo[3,2-c]coumarin (10)，2,3-dihydro- 7- methoxy- 2S*,3R*- dimethyl- 3- [4,8-dimethyl-3(E),7-nonadienyl]- furo[3,2-c]coumarin (11)，2,3-dihydro- 7- hydroxy- 2S*,3R*- dimethyl- 3- [4,8- dimethyl-3(E),7- nonadienyl]- furo[3,2-c]coumarin (12)，2,3-dihydro- 7- methoxy- 2S*,3R*- dimethyl- 2- [4,8- dimethyl-3(E),7- nonadienyl]- furo[3,2-c]coumarin (13)，2,3-dihydro- 7- methoxy- 2R*,3R*- dimethyl- 2- [4,8- dimethyl-3(E),7- nonadienyl]- furo[3,2-c]coumarin (14)，ferulaeone C (15). 其中，化合物1 為新雜萜類化合物，并通過計算電子圓二色譜(ECD)確定了其絕對構型(結構見圖1)，化合物 9從該植物中首次分離得到. 此外，對分離得到的單體化合物在人源乳腺癌腫瘤細胞(MCF-7)上進行細胞毒活性篩選實驗，對其抗乳腺癌活性進行初步評價.

圖1 化合物1的化學結構Fig. 1 The chemical structure of compound 1

1 儀器與材料

Bruker AVANCE III-400M 型核磁共振儀(德國Bruker公 司)；Varian 7.0 T ESI-MS(Varian Inc.，CA，USA)；Jasco J-810 圓二色光譜儀(日本Jasco公司)；LC2060 型高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；真空旋轉蒸發(fā)器R系列(余姚新波儀表公司)；Sephadex LH-20 (GE公司)；柱色譜硅膠(100～200、200～300、300～400 目)以及薄層板色譜硅膠GF 254均為由青島海洋化工有限公司產品；機械超聲波清洗機(北京科璽世紀科技有限公司)；提取分離用分析純有機試劑(天津市津東天正精細化學試劑廠)；氘代試劑(美國Cambridge Isotope Laboratories, Inc.).

MCF-7細胞株(美國ATCC公司)；MTT(北京索萊寶科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；PBS(北京索萊寶科技有限公司)；胰蛋白酶(美國Gibco公司)；DMSO(阿拉丁試劑(上海)有限公司)；5% CO2細胞培養(yǎng)箱(美國賽默飛世爾科技公司)；CKX31 倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；96孔細胞培養(yǎng)板(美國Corning公司).

藥材購買于新疆烏魯木齊，經天津醫(yī)科大學藥學院唐生安副教授鑒定，確定為傘形科阿魏屬植物多傘阿魏Ferula. ferulaeoides(Steud.) Korov.， 標本(T20190819)保存于天津醫(yī)科大學藥學院.

2 方法與結果

2.1 提取分離

室溫下，將多傘阿魏藥材(997 g)粉碎后，用95%的乙醇回流提取3次，提取物減壓濃縮后得總浸膏340 g. 總浸膏用水混懸后，用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇依次各萃取3次，濃縮后分別得到石油醚層萃取物(70 g)，乙酸乙酯層萃取物(148 g)，正丁醇層萃取物(17 g)，水層(70 g).

首先選取多傘阿魏的乙酸乙酯部位，將其用正相硅膠色譜柱進行分離，利用100～200目硅膠拌樣后，用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(20∶1、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1，v/v)梯度洗脫，得到22個組分Fr. 1～22，其中Fr.4被鑒定為化合物2(5.2 g). 將Fr. 7(8.5 g)經Sephadex LH-20凝膠色譜柱(二氯甲烷∶甲醇 = 1∶1，v/v)分離，得到8個組分Fr.7.1～7.8. 其中，將Fr. 7.6(94.4 mg)經半制備HPLC(甲醇∶水 = 9∶1，v/v)分離純化得到11個組分Fr. 7.6.1～7.6.11，其中Fr. 7.6.6被鑒定為化合物3(3.4 mg)；Fr.7.2(1.27 g)經半制備HPLC分離，以甲醇-水(96∶4，v/v)為流動相等度洗脫，濃縮得到化合物8(3.3 mg)、9(2.2 mg)、10(5.6 mg)、11(5.1 mg)、13(41.0 mg)、14(14.4 mg)；Fr. 7.4(3.32 g)經半制備HPLC(甲醇∶水 = 95∶5，v/v)分離純化得到化合物12(1.4 mg)、15(3.1 mg). Fr. 7.6.7經半制備HPLC純化，以甲醇-水(89∶11，v/v)洗脫，濃縮得到化合物4(20.8 mg).

將Fr. 10和Fr. 11充分混勻，經正相硅膠色譜柱，用石油醚-乙酸乙酯系統(tǒng)(8∶1、4∶1、2∶1、1∶1，v/v)梯度洗脫得到11個組分Fr. 10.1～10.11，其中Fr. 10.1被鑒定為化合物5(781.6 mg). Fr.10.3經半制備HPLC純化，以甲醇-水(88∶12，v/v)等度洗脫，得到化合物1(2.7 mg)和7(3.8 mg)；減小流動相極性(甲醇∶水 =90∶10，v/v)將Fr. 10.4經半制備HPLC純化，得到化合物6(6.9 mg).

2.2 結構鑒定

化合物1：黃色油狀物，易溶于甲醇. HR-ESI-MS給出其準分子離子峰m/z455.260 2 [M+CH3COO]-(計算值455.259 0)，結合1H-NMR，13C-NMR數(shù)據推測分子式為C24H34O4，不飽和度為8.1H-NMR譜給出3個苯環(huán)質子信號 [δH7.56 (1H, d,J= 8.6 Hz, H-6′)，6.49(1H, d,J= 2.4 Hz, H-5′)，6.47(1H, s, H-3′) ]，3個烯質子信號 [δH5.18 (1H, t,J= 7.3 Hz, H-4)，5.09 (1H, m,overlapped, H-8)，5.09 (1H, m, overlapped, H-12) ]，3個甲基質子信號 [δH1.51 (3H, s, Me-5)，1.59 (3H, s, Me-9)，1.60 (3H, s, Me-13) ]，1個 甲 氧 基 質 子 信 號 [δH3.86(3H, s, OMe) ]，3個亞甲基質子信號 [δH2.40 (1H, m, H-3)，2.62 (1H, m, H-3)，2.04 (2H, m, H-7)，2.04 (2H, m, H-11) ]，1個次甲基質子信號 [δH5.07 (1H, t,J= 7.1 Hz,H-2) ].13C-NMR和DEPT 135譜顯示出24個碳信號：1個羰基碳信號(δC203.7)，1組苯環(huán)碳信號(δC110.6，165.8，101.1，163.1，108.2，131.3)，6個烯碳信號(δC117.6，139.6，124.4，135.2，123.9，131.1)，5個甲基碳信號(δC25.7，16.3，16.0，17.7，55.7)，5個亞甲基碳信號(δC35.5，39.8，26.8，39.7，26.5)，1個次甲基碳信號(δC71.9)，上述的一維波譜數(shù)據以及文獻[6]的數(shù)據對比，推測化合物1為倍半萜類化合物.

分析1H -1H COSY譜，發(fā)現(xiàn)7組自旋耦合系統(tǒng)，分別為H-3 / H-4，H-5 / Me-5，H-7 / H-8，H-9 / Me-9，H-11 /H-12，H-13 / Me-13，H-5′ / H-6′；分析HMBC譜，發(fā)現(xiàn)存在H-2 / C-1；H-3 / C-2, 4, 5；H-4 / C-5Me；H-7 / C-6,8；H-8 / C-9Me；H-11 / C-10, 12；H-12 / C-13Me遠程相關信號. 綜合上述2D NMR信號確定了化合物1倍半萜部分的結構；在HMBC譜中發(fā)現(xiàn)苯環(huán)質子(δH6.49)與δC110.6(C-1')存在遠程相關，表明苯環(huán)與倍半萜部分通過C-1′相連接(圖2).

圖2 化合物1主要的HMBC及1H-1H COSY相關Fig. 2 Key HMBC and 1H-1H COSY correlations of compound 1

根據化合物1的ROESY譜，2位羥基無任何NOE相關信號，因此無法通過NOE法確定2位羥基的立體構型. 本文采用了計算ECD法來確定化合物1的絕對構型，測定化合物1的ECD譜，化合物1的實驗ECD譜圖譜顯示在206 nm出現(xiàn)正的Cotton效應，這一結果與(2S)-1的計算ECD譜圖基本一致(圖3)，因此確定化合物1的絕對構型為(2S).

圖3 化合物1的實測和計算ECD譜圖Fig. 3 Experimental and calculated ECD spectra of compound 1

根據Scifinder和Reaxy 數(shù)據庫檢索，確定化合物1為新化合物，命名為1- (2- hydroxyl- 4- methoxybenzoyl)- 2S*- hydroxy- 5,9,13- trimethyl- 4(E),8(E),12-tetradecatrien- 1- one.

化合物2：黃色油狀物. HR-ESI-MSm/z: 223 [M+H]+，分子式為C15H26O .1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ:2.43 (2H, m, H-1), 1.97 (2H, m, H-2), 2.55 (1H, m, H-3),1.83 (1H, m, H-4), 1.56 (1H, m, H-5), 1.58 (2H, m, H-6),1.73 (2H, m, H-7), 2.22 (1H, m, H-8), 1.16 (3H, s, H-1'),1.19 (3H, s, H-3'), 0.96 (3H, d,J= 6.9 Hz, H-3Me), 1.00(3H, d,J= 7.2 Hz, H-8Me);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 35.4 (C-1), 30.9 (C-2), 46.3 (C-3), 27.9 (C-4), 49.6 (C-5), 33.8 (C-6), 27.3 (C-7), 33.7 (C-8), 138.9 (C-9), 140.0(C-10), 25.9 (C-1'), 73.6 (C-2'), 27.4 (C-3'), 19.9 (C-3Me),19.8 (C-8Me). 以上數(shù)據與文獻報道基本一致[6-8]. 故鑒定化合物2 為Guaiol.

表1 化合物1的1H-NMR和 13C-NMR數(shù)據(400/100 MHz, CDCl3)Tab. 1 1H-NMR and 13C-NMR data of compound 1 (400/100 MHz, CDCl3)

化合物3：黃色油狀物. HR-ESI-MSm/z: 357 [M+H]+，分子式為C23H32O3.1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 2.89 (2H, d,J= 1.6 Hz, H-2), 1.52 (2H, m, H-4), 1.95(2H, overlapped, H-5), 5.08 (1H, m, H-6), 1.95 (2H,overlapped, H-8), 2.04 (2H, m, H-9), 5.08(1H, m, H-10),1.68 (3H, s, H-12), 1.17 (3H, s, H-3Me), 1.58 (3H, s, H-7Me), 1.60 (3H, s, H-11Me), 5.87 (1H, dd,J= 10.8, 17.4 Hz, H-Vinyl-CH), 4.96 (1H, br d,J=17.5 Hz, H-Vinyl-CH2), 5.02 (1H, br d,J=10.8Hz, H- Vinyl-CH2), 6.36 (1H,overlapped, H-3'), 6.37 (1H, overlapped, H-5'), 7.64 (1H,d,J=8.9 Hz,H-6');13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 204.1(C-1), 47.1 (C-2), 40.3 (C-3), 41.0 (C-4), 22.9 (C-5), 124.3(C-6), 135.2 (C-7), 39.7 (C-8), 26.7 (C-9), 124.2 (C-10),131.4 (C-11), 25.7 (C-12), 23.2 (C-3Me), 16.0 (C-7Me),17.7 (C-11Me), 145.8 (C-Vinyl-CH), 112.2 (C-Vinyl-CH2), 115.1 (C-1'), 165.5 (C-2'), 103.5 (C-3'), 162.6(C-4'),107.5 (C-5'), 133.3 (C-6'). 以上數(shù)據與文獻報道基本一致[9-10]. 故鑒定化合物3 為1- (2,4-dihydroxyphenyl)-3,7,11-trimethyl-3-vinyl-6(E),10-dodecadiene-1-one.

化合物4：黃色油狀物. HR-ESI-MSm/z: 357 [M+H]+，分子式為C23H32O3.1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:2.93 (2H, t,J= 7.4 Hz, H-2), 2.42 (2H, q,J= 7.4, 14.8 Hz,H-3), 5.17 (1H, t,J= 6.8 Hz, H-4), 1.98 (2H, m, H-6),2.06 (2H, m, H-7), 5.09 (1H, m, H-8), 1.98 (2H, m,H-10), 2.06 (2H, m, H-11), 5.09 (1H, m, H-8), 1.68(3H, s, H-14), 1.63 (3H, s, H-5Me), 1.59 (3H, s, H-9Me), 1.59 (3H, s, H-13Me), 6.40 (1H, overlapped,H-3′), 6.38 (1H, overlapped, H-5′), 7.66 (1H, d,J=8.8 Hz, H-6');13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 204.9 (C-1),38.1 (C-2), 23.3 (C-3), 122.3 (C-4), 136.9 (C-5), 39.7 (C-6), 26.5 (C-7), 124.0 (C-8), 135.1 (C-9), 39.7 (C-10), 26.8(C-11), 124.4 (C-12), 131.4 (C-13), 25.7(C-14), 16.1 (C-5Me), 16.0 (C-9Me), 17.7 (C-13Me), 113.8 (C-1'), 165.1(C-2'), 103.5 (C-3'), 162.8 (C-4'), 107.9 (C-5'), 132.5 (C-6'). 以上數(shù)據與文獻報道基本一致[9-10]. 故鑒定化合物4為Dshamirone.

化合物5：黃色油狀物. HR-ESI-MSm/z: 383 [M+H]+，分子式為C24H30O4.1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:3.30 (1H, q,J= 7.0, 14.0 Hz, H-3), 7.11 (1H, d,J= 2.1 Hz,H-6), 6.87 (1H, dd,J= 2.2, 8.6 Hz, H-8), 7.53 (1H, d,J=8.6 Hz, H-9), 1.81 (2H, m, H-1'), 2.11 (2H, m, H-2'), 5.10(1H, t,J= 7.0 Hz H-3'), 1.95 (2H, m, H-5'), 2.03 (2H, m,H-6'), 5.08 (1H, t,J= 6.8 Hz, H-7'), 1.66 (3H, s, H-9'),1.46 (3H, s, H-2Me), 1.31 (3H, d,J= 7.1 Hz, H-3Me),1.58 (3H, s, H-4'Me), 1.58 (3H, s, H-8'Me);13C-NMR(100 MHz, CDCl3)δ: 97.2 (C-2), 41.9 (C-3), 103.2 (C-3a),162.4 (C-4), 156.7 (C-5a), 103.3 (C-6), 160.8 (C-7), 113.4(C-8), 124.2 (C-9), 105.8 (C-9a), 166.1 (C-9b), 41.7 (C-1'), 22.1 (C-2'), 123.1 (C-3'), 136.0 (C-4'), 39.6 (C-5'),26.6 (C-6'), 124.2 (C-7'), 131.5 (C-8'), 25.7 (C-9'), 20.5 (C-2Me), 14.1 (C-3Me), 16.0 (C-4'Me), 17.7 (C-8'Me). 以上數(shù)據與文獻報道基本一致[11]. 故鑒定化合物5為2,3-dihydro-7-hydroxy-2S*,3R*-dimethyl-2-[4,8- dimethyl-3(E),7-nonadienyl]-furo[3,2-c]coumarin.

化合物6：黃色油狀物. HR-ESI-MSm/z: 415 [M+H]+，分子式為C25H34O5.1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:6.45 (1H, d,J= 2.3 Hz, H-3), 6.51 (1H, dd,J= 2.4, 9.0 Hz,H-5), 7.69 (1H, d,J= 9.1 Hz, H-6), 4.24 (1H, d,J=11.9 Hz, H-8), 3.15 (1H, m, H-1'), 1.82 (2H, m, H-3'), 2.19(2H, m, H-4'), 5.10 (1H, m, overlapped, H-5'), 2.00 (2H,m, H-7'), 2.07 (2H, m, H-8'), 5.10 (1H, m, overlapped, H-9'), 1.69 (3H, s, H-11'), 1.61 (3H, s, H-10'Me), 1.63 (3H, s,H-6'Me), 1.35 (3H, s, H-2'Me), 1.07 (3H, d,J= 6.8 Hz, H-1'Me), 3.86 (3H, s, H-OMe), 12.50 (3H, s, H-OH);13CNMR (100 MHz, CDCl3)δ: 113.9 (C-1), 166.3 (C-2),100.9 (C-3), 166.9 (C-4), 108.4 (C-5), 133.0 (C-6), 196.0(C-7), 54.5 (C-8), 171.2 (C-9), 41.2 (C-1'), 87.9 (C-2'),39.7 (C-3'), 22.3 (C-4'), 123.0 (C-5'), 136.2 (C-6'), 39.7 (C-7'), 26.6 (C-8'), 124.2 (C-9'), 131.5 (C-10'), 25.7 (C-11'),17.7 (C-10'Me), 16.1 (C-6'Me), 20.6 (C-2'Me), 13.5 (C-1'Me), 55.7 (C-OMe). 以上數(shù)據與文獻報道基本一致[12].故鑒定化合物6為3-(2-hydroxyl-4-methoxybenzoyl)-4S*,5R*-dimethyl-5-[4,8-dimethyl- 3(E),7(E)-nonadien-1-yl]tetrahydro-2-furanone.

化合物7：黃色油狀物. HR-ESI-MSm/z: 415 [M+H]+，分子式為C25H34O5.1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ:6.45 (1H, d,J= 2.4 Hz, H-3), 6.51 (1H, dd,J= 2.5, 9.0 Hz,H-5), 7.68 (1H, d,J= 9.1 Hz, H-6), 4.26 (1H, d,J=12.1 Hz, H-8), 3.10 (1H, m, H-1'), 1.58 (2H, m, H-3'), 2.18(2H, m, H-4'), 5.11 (1H, m, overlapped, H-5'), 2.00 (2H,m, H-7'), 2.07 (2H, m, H-8'), 5.11 (1H, m, overlapped, H-9'), 1.69 (3H, s, H-11'), 1.62 (3H, s, H-10'Me), 1.64 (3H, s,H-6'Me), 1.52 (3H, s, H-2'Me), 1.09 (3H, d,J= 7.0 Hz, H-1'Me), 3.86 (3H, s, H-OMe), 12.49 (3H, s, H-OH);13CNMR (100 MHz, CDCl3)δ: 113.9 (C-1), 166.3 (C-2),100.9 (C-3), 167.0 (C-4), 108.4 (C-5), 133.0 (C-6), 196.0(C-7), 54.4 (C-8), 171.2 (C-9), 44.0 (C-1'), 87.5 (C-2'),35.5 (C-3'), 22.0 (C-4'), 123.1 (C-5'), 136.4 (C-6'), 39.7 (C-7'), 26.7 (C-8'), 124.2 (C-9'), 131.5 (C-10'), 25.7 (C-11'),17.7 (C-10'Me), 16.2 (C-6'Me), 23.8 (C-2'Me), 12.8 (C-1'Me), 55.7 (C-OMe). 以上數(shù)據與文獻報道基本一致[11].故鑒定化合物7為Fukanedone A.

化合物8：黃色油狀物. HR-ESI-MSm/z: 409 [M+H]+，分子式為C25H28O5.1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:3.28 (1H, q,J= 7.1, 14.2 Hz, H-3), 6.84 (1H, br s, H-6),6.82 (1H, dd,J= 2.0, 9.0 Hz, H-8) , 7.52 (1H, d,J= 9.0 Hz,H-9), 1.82 (2H, m, H-1'), 2.15 (2H, m, H-2'), 5.19 (1H, t,J= 7.8 Hz, H-3'), 3.19 (2H, s, H-5'), 5.86 (1H, s, H-7'),7.06 (1H, s, H-9'), 1.45 (3H, s, H-2Me), 1.30 (3H, d,J= 6.9 Hz, H-2Me), 1.58 (3H, s, H-4'Me), 1.97 (3H, s, H-8'Me), 3.87 (3H, s, H-OMe);13C-NMR (100 MHz,CDCl3)δ: 96.7 (C-2), 42.0 (C-3), 103.6 (C-3a), 161.3 (C-4), 156.9 (C-5a), 100.7 (C-6), 163.1 (C-7), 112.2 (C-8),123.8 (C-9), 106.2 (C-9a), 165.1 (C-9b), 41.5 (C-1'), 22.2(C-2'), 125.4 (C-3'), 132.8 (C-4'), 38.4 (C-5'), 154.0 (C-6'),108.9 (C-7'), 120.5 (C-8'), 137.8 (C-9'), 20.5 (C-2Me),14.1 (C-3Me), 15.9 (C-4'Me), 9.8 (C-8'Me), 55.7 (C-OMe).以上數(shù)據與文獻報道基本一致[12]. 故鑒定化合物8為2,3-dihydro-7-methoxy-2S*,3R*-dimethyl-2-[4-methyl- 5-(4-methyl-2-furyl)-3(E)-pentenyl]-furo[3,2-c]coumarin.

化合物9：黃色油狀物. HR-ESI-MSm/z: 367 [M+H]+，分子式為C24H30O3.1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ:6.25 (1H, d,J= 9.5 Hz, H-3), 7.64 (1H, d,J= 9.4 Hz, H-4), 7.36 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-5), 6.83 (2H, m, H-6), 6.83(2H, m, H-8), 2.01 (2H, m, H-1'), 1.96 (2H, m, H-2'), 5.08(1H, m, H-3'), 5.08 (1H, m, H-5'), 2.12 (2H, m, H-6'), 2.14(2H, m, H-7'), 5.47 (1H, t,J= 6.2 Hz, H-9'), 4.60 (2H, d,J= 6.6 Hz, H-11'), 1.77 (3H, s, H-12'), 1.60 (3H, s, H-13'),1.67 (3H, s, H-14'), 1.59 (3H, s, overlapped, H-15');13CNMR (100 MHz, CDCl3)δ: 160.1 (C-2), 112.6 (C-3),143.3 (C-4), 128.8 (C-5), 112.9 (C-6), 161.9 (C-7), 101.3(C-8), 155.9 (C-9), 113.1 (C-10), 26.7 (C-1'), 26.1 (C-2'),118.4 (C-3'), 131.2 (C-4'), 123.5 (C-5'), 39.6 (C-6'), 39.4(C-7'), 135.5 (C-8'), 124.3 (C-9'), 135.5 (C-10'), 65.4 (C-11'), 25.7 (C-12'), 16.0 (C-13'), 17.6 (C-14'), 16.7 (C-15').以上數(shù)據與文獻報道基本一致[13-14]. 故鑒定化合物9為Umbelliprenin. 根據Scifinder和Reaxy 數(shù)據庫檢索，確定化合物9為首次從該植物中分離得到.

化合物10：黃色油狀物. HR-ESI-MSm/z: 397 [M+H]+，分子式為C25H32O4.1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:4.62 (1H, q,J= 6.8, 13.5 Hz, H-2), 6.85 (1H, d,J= 2.3 Hz,H-6), 6.83 (1H, dd,J= 2.3, 6.9 Hz, H-8), 7.54 (1H, d,J=9.4 Hz, H-9), 1.63 (2H, m, H-1'), 1.95 (2H, m, H-2'), 5.05(1H, overlapped, H-3'), 1.91 (2H, m, H-5'), 2.02 (2H, m, H-6'), 5.05 (1H, overlapped, H-7'), 1.66 (3H, s, H-9'), 1.54(3H, d,J= 6.8 Hz, H-2Me), 1.45 (3H, s, H-3Me), 1.50(3H, s, H-4'Me), 1.58 (3H, s, H-8'Me), 3.87 (3H, s, HOMe);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 93.1 (C-2), 46.7(C-3), 106.1 (C-3a), 160.7 (C-4), 157.0 (C-5a), 100.6 (C-6), 163.2 (C-7), 112.3 (C-8), 124.0 (C-9), 106.6 (C-9a),166.2 (C-9b), 34.8 (C-2'), 23.5 (C-2'), 123.7 (C-3'), 135.2(C-4'), 39.6 (C-5'), 26.6 (C-6'), 124.3 (C-7'), 131.3 (C-8'),25.7 (C-9'), 13.9 (C-2Me), 23.8 (C-3Me), 16.0 (C-4'Me),17.7 (C-8'Me), 55.7 (C-OMe). 以上數(shù)據與文獻報道基本一致[5]. 故鑒定化合物10為2,3-dihydro-7-methoxy-2S*,3S*-dimethyl-3-[4,8-dimethyl-3(E),7-nonadienyl]-furo[3,2-c]coumarin.

化合物11：黃色油狀物. HR-ESI-MSm/z: 397 [M+H]+，分子式為C25H32O4.1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ:4.88 (1H, q,J= 6.6, 13.3 Hz, H-2), 6.85 (1H, br s, H-6),6.83 (1H, dd,J= 2.3, 5.8 Hz, H- 8), 7.53 (1H, d,J= 7.5 Hz,H- 9), 1.72 (2H, m, H-1'), 1.92 (2H, m, H-2'), 5.11 (1H, t,J= 7.1 Hz, H- 3'), 1.94 (2H, m, H-5'), 2.04 (2H, m, H-6'),5.07 (1H, t,J= 7.5 Hz, H- 7'), 1.67 (3H, s, H-9'), 1.45(3H, d,J= 6.6 Hz, H-2Me), 1.29 (3H, s, H-3Me), 1.56(3H, s, H-4'Me), 1.59 (3H, s, H-8'Me), 3.87 (3H, s, HOMe);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 89.7 (C-2), 47.0 (C-3), 106.2 (C-3a), 160.6 (C-4), 156.9 (C-5a), 100.6 (C-6),163.1 (C-7), 112.2 (C-8), 123.7 (C-9), 106.3 (C-9a), 165.5(C-9b), 38.3 (C-1'), 23.4 (C-2'), 123.7 (C-3'), 135.6 (C-4'),39.7 (C-5'), 26.6 (C-6'), 124.3 (C-7'), 131.4 (C-8'), 25.7 (C-9'), 15.8 (C-2Me), 19.2 (C-3Me), 16.0 (C-4'Me), 17.7 (C-8'Me), 55.7 (C-OMe). 以上數(shù)據與文獻報道基本一致[15].故鑒定化合物11為2,3- dihydro- 7- methoxy- 2S*,3R*-dimethyl- 3- [4,8- dimethyl- 3(E),7- nonadienyl]- furo[3,2-c]coumarin.

化合物12：黃色油狀物. HR-ESI-MSm/z: 383 [M+H]+，分子式為C25H32O4.1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:4.89 (1H, q,J= 6.4, 13.0 Hz, H-2), 7.07 (1H, s, H-6), 6.83(1H, d,J= 8.1 Hz, H-8), 7.53 (1H, d,J= 8.5 Hz, H-9),1.72 (2H, m, H-1'), 1.98 (2H, m, H-2'), 5.10 (1H, t,J=6.6 Hz, H-6'), 1.93 (2H, m, H-5'), 2.02 (2H, m, H-6'), 5.06(1H, t,J= 8.5 Hz, H-7'), 1.66 (3H, s, H-9'), 1.45 (3H, d,J= 6.6 Hz, H-2Me), 1.29 (3H, s, H-3Me), 1.55 (3H, s, H-4'Me), 1.58 (3H, s, H-8'Me).13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 89.9 (C-2), 46.9 (C-3), 105.9 (C-3a), 161.5 (C-4), 156.7(C-5a), 103.2 (C-6), 160.5 (C-7), 113.2 (C-8), 124.3 (C-9),106.0 (C-9a), 166.2 (C-9b), 38.3 (C-1'), 23.4 (C-2'), 123.6(C-3'), 135.6 (C-4'), 39.6 (C-5'), 26.6 (C-6'), 124.1 (C-7'),131.4 (C-8'), 25.7 (C-9'), 15.8 (C-2Me), 19.2 (C-3Me),16.0 (C-4'Me), 17.7 (C-8'Me). 以上數(shù)據與文獻報道基本一致[15]. 故鑒定化合物12為2,3- dihydro7-hydroxy -2S*,3R*-dimethyl-3-[4,8-dimethyl-3(E),7- nonadienyl]-furo[3,2-c]coumarin.

化合物13：黃色油狀物. HR-ESI-MSm/z: 397 [M+H]+，分子式為C25H32O4.1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:3.29 (1H, q,J= 7.0, 14.0 Hz, H-3), 6.83 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-6), 6.83 (1H, dd,J=2.0, 8.5 Hz, H-8), 7.54 (1H, d,J= 9.3 Hz, H-9), 1.80 (2H, m, H-1'), 2.12 (2H, m, H-2'),5.10 (1H, t,J= 6.9 Hz, H- 3'), 1.95 (2H, m, H-5'), 2.03(2H, m, H-6'), 5.06 (1H, t,J= 6.7 Hz, H-7'), 1.67 (3H, s,H-9'), 1.45 (3H, s, H-2Me), 1.31 (3H, d,J= 7.0 Hz, H-3Me), 1.58 (3H, s, H-4'Me), 1.58 (3H, s, H-8'Me), 3.87(3H, s, H-OMe);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 96.8 (C-2), 42.0 (C-3), 103.6 (C-3a), 161.2 (C-4), 156.9 (C-5a),100.7 (C-6), 163.1 (C-7), 112.2 (C-8), 123.8 (C-9), 106.2(C-9a), 165.1 (C-9b), 41.7 (C-1'), 22.1 (C-2'), 123.1 (C-3'),135.9 (C-4'), 39.6 (C-5'), 26.6 (C-6'), 124.2 (C-7'), 131.4(C-8'), 25.7 (C-9'), 20.5 (C-2Me), 14.1 (C-3Me), 16.0 (C-4'Me), 17.7 (C-8'Me), 55.7 (C-OMe). 以上數(shù)據與文獻報道基本一致[10]. 故鑒定化合物13為2,3- dihydro- 7-methoxy- 2S*,3R*- dimethyl- 2- [4,8-dimethyl- 3(E),7-nonadienyl]- furo[3,2-c]coumarin.

化合物14：黃色油狀物. HR-ESI-MSm/z: 397 [M+H]+，分子式為C25H32O4.1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:3.19 (1H, q,J= 7.0, 14.0 Hz, H-3), 6.85 (1H, br s, H-6),6.84 (1H, dd,J= 2.9 Hz, H-8), 7.54 (1H, d,J= 9.2 Hz, H-9), 1.89 (2H, m, H-1'), 2.19 (2H, m, H-2'), 5.17 (1H, t,J=6.5Hz, H- 3'), 2.00 (2H, m, H-5'), 2.07 (2H, m, H-6'), 5.09(1H, t,J= 6.7 Hz, H-7'), 1.68 (3H, s, H-9'), 1.48 (3H, s, H-2Me), 1.29 (3H, d,J= 7.0 Hz. H-3Me), 1.64 (3H, s , H-4'Me), 1.60 (3H, s, H-8'Me), 3.87 (3H, s, H-OMe);13CNMR (100 MHz, CDCl3)δ: 96.3 (C-2), 44.3 (C-3), 104.0(C-3a), 161.3 (C-4), 156.9 (C-5a), 100.6 (C-6), 163.1 (C-7), 112.2 (C-8), 123.8 (C-9), 106.4 (C-9a), 165.0 (C-9b),35.2 (C-1'), 22.8 (C-2'), 123.5 (C-3'), 135.9 (C-4'), 39.7 (C-5'), 26.6 (C-6'), 124.2 (C-7'), 131.5 (C-8'), 25.7 (C-9'),25.4 (C-2Me), 13.6 (C-3Me), 16.0 (C-4'Me), 17.7 (C-8'Me), 55.7 (C-OMe). 以上數(shù)據與文獻報道基本一致[10].故鑒定化合物14為2,3- dihydro- 7- methoxy- 2R*,3R*-dimethyl- 2- [4,8- dimethyl- 3(E),7- nonadienyl]-furo[3,2-c]coumarin.

化合物15：黃色油狀物. HR-ESI-MSm/z: 357 [M+H]+，分子式為C23H32O3.1H-NMR (400 MHz,CDCl3)δ:2.79, 2.96 (2H, m, H-2), 2.77 (1H, m, H-3), 5.16(1H, m, H-5), 2.66 (2H, t,J= 7.0Hz, H- 6), 5.04 (1H, m, H-7), 1.98(2H, m, H-9), 2.04 (2H, m, H-10), 5.10 (1H, m, H-11),1.60 (3H, s, H-13), 6.37 (1H, br s, H- 3'), 6.37 (1H, br s, H-5'), 7.64 (1H, d,J= 8.8 Hz, H- 6'), 1.07 (3H, d,J= 6.2 Hz,H-3Me), 1.64 (3H, s, H-4Me), 1.60 (3H, s, H-8Me), 1.68(3H, s, H-12Me);13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 204.6 (C-1), 43.8 (C-2), 39.7 (C-3), 137.8 (C-4), 123.5 (C-5), 26.7(C-6), 122.8 (C-7), 135.3 (C-8), 39.6 (C-9), 26.7 (C-10),124.3 (C-11), 131.4(C-12), 17.7 (C-13), 114.3 (C-1'),165.4 (C-2'), 103.6 (C-3'), 162.4 (C-4'), 107.5 (C-5'), 132.5(C-6'), 19.4 (C-3Me), 13.5 (C-4Me), 16.1 (C-8Me), 25.7(C-12Me). 以上數(shù)據與文獻報道基本一致[16]. 故鑒定化合物15為Ferulaeone C.

2.3 MCF-7細胞體外細胞毒活性篩選

以紫杉醇(IC50<0.008 μM)為陽性對照，用MTT法測定各單體化合物對MCF-7的體外抑制活性. 選用藥理實驗室培養(yǎng)的3～4代MCF-7細胞，用適量PBS清洗1～2遍，加入胰蛋白酶消化1 min，棄去胰蛋白酶，加入適量的完全培養(yǎng)基終止消化，將細胞吹打均勻后使細胞重懸，計數(shù)后，將MCF-7細胞以5×104個/mL的密度接種于96孔板內，每孔加入200 μL細胞懸液，孔板邊緣用200 μL/孔的PBS進行填充，然后置于培養(yǎng)箱中，待細胞貼壁后給藥. 向實驗組孔中加入0.5 μL，濃度為8 mmol/L的單體化合物溶液，同時DMSO陰性對照孔中加入0.5 μL的DMSO，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，在避光條件下，每孔加入20 μL MTT溶液(5 mg/mL)，然后放置于培養(yǎng)箱中反應4 h后，棄去上清，每孔加入150～200 μL DMSO，將96孔板置于搖床或微孔振蕩器上震蕩10 min左右，待甲瓚結晶充分溶解后，用酶聯(lián)免疫儀在490 nm波長下檢測吸光度(OD)值，并根據相應式(1)計算抑制率. 并且使用軟件GraphPad Prism 擬合4個化合物的IC50值.

結果表明，在各單體化合物工作濃度為20 μmol/L時(表2)，化合物3、4、5和15對MCF-7細胞具有較高的細胞抑制率，然后進一步測定4個單體化合物相應的半數(shù)抑制濃度(IC50)值分別為15.11，12.98，18.01和12.87 μmol/L，而其他單體化合物并沒有表現(xiàn)出潛在的MCF-7細胞抑制活性(表3).

表2 化合物2～15在20 μmol/L時對MCF-7的細胞抑制率Tab. 2 Cell inhibition (%) of compounds 2～15 on MCF-7 cells at 20 μmol/L

表3 化合物3、4、5和15對MCF-7的細胞抑制率Tab. 3 Inhibition effects of compounds 3、4、5 and 15 on MCF-7 cells

3 結 論

本文利用各種柱色譜分離技術和現(xiàn)代波譜學技術[17]，從多傘阿魏的乙酸乙酯層萃取物中分離鑒定出15個單體成分，根據Scifinder和Reaxy 數(shù)據庫檢索確定化合物1為新化合物，化合物9為首次從該植物中分離得到. 首次通過計算ECD的方法確定了化合物1的絕對構型. 活性篩選實驗結果表明化合物3、4、5和15在MCF-7細胞中表現(xiàn)出潛在的細胞毒活性，說明含酚羥基的倍半萜類化合物對人乳腺癌細胞有良好的抑制作用，對抗腫瘤藥物的進一步開發(fā)提供一定的幫助.