多指標(biāo)優(yōu)選丹參提取工藝研究

閃媛媛，王 玉，徐 浪，張繼斌，孫代華，陳志元

（勁牌持正堂藥業(yè)有限公司 中藥保健食品質(zhì)量與安全湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 黃石 435100）

0 引言

丹參為唇形科植物丹參（Salvia miltiorrhiza Bge.）的干燥根及根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為上品，具有活血絡(luò)祛瘀、通經(jīng)止痛、涼血消癰、清心除煩等功效，是常用的中藥組方藥材[1]。2020 年版《中華人民共和國(guó)藥典》 （一部） 要求以丹酚酸B 和丹參酮類包括丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ和隱丹參酮作為質(zhì)量控制指標(biāo)，說明丹酚酸B 和丹參酮類在丹參的藥效中發(fā)揮重要作用[2]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明丹參在治療心血管疾病、肝硬化、潰瘍、新生兒缺氧性腦病等方面具有顯著療效[3-4]。丹酚酸B 是丹參酚酸類化合物中含量較高的代表性成分，對(duì)心腦血管疾病和肝臟疾病等具有較好的臨床效用[5-8]。丹參酮類主要包括隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ，其中隱丹參酮是主要的抗癌活性成分，丹參酮ⅡA 具有明顯的抗炎、抗氧化、抗腫瘤活性，丹參酮Ⅰ是丹參抑菌有效成分之一，且可以治療痤瘡和心絞痛，具有改善肺部炎癥、保護(hù)神經(jīng)等作用[9-13]。韓麗等人[14]使用動(dòng)態(tài)減壓法提取丹參中丹酚酸B。高揚(yáng)等人[15]以熱回流法提取丹參中的丹酚酸B 和丹參酮ⅡA 的。然而，關(guān)于丹酚酸B 和隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ等3 種丹參酮類同時(shí)提取的文獻(xiàn)報(bào)道較少。試驗(yàn)以丹酚酸B 和丹參酮類（隱丹參酮、丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ三者之和） 提取率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定最佳的提取工藝，以期為丹參藥材的充分利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

丹參，臨沂九州天潤(rùn)中藥飲片產(chǎn)業(yè)有限公司提供；丹酚酸B 對(duì)照品、丹參酮IIA 對(duì)照品，中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；乙腈、磷酸等試劑為色譜純、甲醇、乙醇等試劑均為分析純、純凈水（公司生產(chǎn)）；95%食用酒精。

1.2 儀器

6890 型氣相色譜儀，安捷倫科技公司產(chǎn)品；AB135-S 型電子天平，梅特勒- 托利多公司產(chǎn)品；FA2004 型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；SK8200LHC 型超聲提取器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司產(chǎn)品；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州國(guó)華電器有限公司產(chǎn)品。

1.3 丹酚酸B 含量的檢測(cè)

1.3.1 供試品溶液制備

精密量取丹參提取液樣品1 mL 至10 mL 容量瓶中，加50%乙醇稀釋并定容，0.22 μm 有機(jī)相針式過濾器過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液備用。

1.3.2 對(duì)照品溶液制備

精密稱取丹酚酸B 標(biāo)準(zhǔn)品適量至25 mL 容量瓶中，80%甲醇超聲溶解并定容，混勻，配制成丹酚酸B 含量300 mg/L 左右的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Waters T3 型色譜柱，流動(dòng)相為乙腈∶0.1%磷酸= 25∶75，流速為1.2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為286 nm，柱溫為20 ℃。

1.3.4 丹酚酸B 含量測(cè)定

對(duì)照品溶液與供試品溶液進(jìn)樣體積均為10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定。以丹酚酸B 對(duì)照品保留時(shí)間定性，以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度和色譜峰面積建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中相應(yīng)的色譜峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線得到供試品溶液中丹酚酸B 的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即可得到丹參提取液中丹酚酸B 的含量，計(jì)算結(jié)果保留到小數(shù)點(diǎn)后2 位數(shù)字。

1.4 丹酚酮類含量的檢測(cè)

1.4.1 供試品溶液制備

精密量取丹參提取液樣品1mL 至10mL 容量瓶中，加50%乙醇稀釋并定容，0.22 μm 有機(jī)相針式過濾器過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液備用。

1.4.2 對(duì)照品溶液制備

取丹參酮ⅡA 對(duì)照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加甲醇制成每1 mL 含20 mg 的溶液，備用。

1.4.3 色譜條件

色譜柱：Agilent SB-Aq 型C18色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A ，以0.02% 磷酸溶液為流動(dòng)相B ，梯度洗脫程序如下：0～6 min 61% （A）、6～20 min 61%→90%（A）、20～20.5 min 90%→61%（A）、20.5～25 min 61%（A），流速為1 mL/min，柱溫為20 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。

1.4.4 丹參酮類測(cè)定

測(cè)定法分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀測(cè)定。以丹參酮ⅡA 對(duì)照品為參照，以其相應(yīng)的峰為S 峰，計(jì)算隱丹參酮、丹參酮I 的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%范圍之內(nèi)。

相對(duì)保留時(shí)間和校正因子見表1。

表1 相對(duì)保留時(shí)間和校正因子

以丹參酮ⅡA 的峰面積為對(duì)照，分別乘以校正因子，計(jì)算隱丹參酮、丹參酮I、丹參酮ⅡA 的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 因素水平表

影響丹參藥材提取的因素主要有提取溫度、提取時(shí)間、溶劑倍數(shù)、提取溶劑等。

單因素試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 單因素試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2.1.2 提取溫度對(duì)丹參中丹酚酸B 和丹參酮類提取效果的影響

稱取丹參藥材5 份，每份50 g，分別加入50%乙醇300 mL，在50，60，70，80，90 ℃等不同溫度條件下，提取2 次，每次提取1.0 h，收集提取液，按規(guī)定的方法分別測(cè)定丹參提取液中丹酚酸B 和丹參酮類的含量，計(jì)算丹酚酸B 和丹參酮類的提取率。

不同溫度下丹酚酸B 和丹參酮類的提取率見表3。

表3 不同溫度下丹酚酸B 和丹參酮類的提取率

由表3 可知，隨著提取溫度的增加丹酚酸B 的提取率呈增加趨勢(shì)，分析原因?yàn)楦邷貤l件下更有利于丹酚酸B 的溶出，且在提取的短時(shí)間內(nèi)丹酚酸B未發(fā)生分解。但溫度對(duì)丹參酮類提取率幾乎無影響。

2.1.3 提取溶劑對(duì)丹參中丹酚酸B 和丹參酮類提取效果的影響

稱取丹參藥材5 份，每份50 g，分別加入300 mL 20%，35%，50%，60%，70%等不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在60 ℃條件下，提取1.0 h，提取2 次，收集提取液。按規(guī)定的方法分別測(cè)定丹參提取液中丹酚酸B 和丹參酮類的含量，計(jì)算丹酚酸B 和丹參酮類的提取率。

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下丹酚酸B 和丹參酮類的提取率見表4。

表4 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)下丹酚酸B 和丹參酮類的提取率

由表4 可知，不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)丹酚酸B 和丹參酮類的提取率影響不同。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，丹酚酸B 的提取率先增加后降低，變化的幅度不大，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，提取率最高。丹參酮類提取率隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加顯著增加，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取率最高。

2.1.4 提取時(shí)間對(duì)丹參中丹酚酸B 和丹參酮類提取效果的影響

稱取丹參藥材5 份，每份50 g，加入50%乙醇300 mL，提取2 次，提取溫度為60 ℃，提取時(shí)間分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，收集提取液。按規(guī)定的方法分別測(cè)定丹參提取液中丹酚酸B 和丹參酮類的含量，計(jì)算丹酚酸B 和丹參酮類的提取率。

不同提取時(shí)間下丹酚酸B 和丹參酮類的提取率見表5。

表5 不同提取時(shí)間下丹酚酸B 和丹參酮類的提取率

由表5 可知，隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，丹酚酸B 和丹參酮類的提取率均是先增加后降低，提取時(shí)間為1.5～2.0 h 時(shí)，提取率較高。

2.1.5 溶劑倍數(shù)對(duì)丹參中丹酚酸B 和丹參酮類提取效果的影響

稱取丹參藥材5 份，每份50 g，分別加入50%乙醇200 mL（4 BV），300 mL（6 BV），400 mL（8 BV），500 mL（10 BV），600 mL（12 BV），在60 ℃條件下，熱提取1.0 h，提取2 次，收集提取液。按規(guī)定的方法分別測(cè)定丹參提取液中丹酚酸B 和丹參酮類的含量，計(jì)算丹酚酸B 和丹參酮類的提取率。

不同溶劑倍數(shù)條件下丹酚酸B 和丹參酮類的提取率見表6。

由表6 可知，隨著溶劑倍數(shù)的增加，丹酚酸B和丹參酮類的提取率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，在溶劑倍數(shù)增加至6 BV 后，再增加溶劑倍數(shù)，丹酚酸B 和丹參酮類提取率提升的幅度有限。

表6 不同溶劑倍數(shù)條件下丹酚酸B 和丹參酮類的提取率

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)以提取溫度、溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、溶劑倍數(shù)為考查因素，設(shè)計(jì)四因素三水平正交試驗(yàn)。稱取50 g 丹參藥材，按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表進(jìn)行提取試驗(yàn)，提取2 次，提取結(jié)束后合并提取液，量取各提取液體積，按規(guī)定的檢測(cè)方法測(cè)定丹酚酸B 和丹參酮類含量。

因素與水平設(shè)計(jì)見表7，直觀分析見表8。

表7 因素與水平設(shè)計(jì)

由表8 可知，影響丹酚酸B 提取率大小的因素依次是提取溫度（A） >溶劑體積分?jǐn)?shù)（B） >提取時(shí)間（C） > 溶劑倍數(shù)（D），最佳提取條件為A3B1C3D1。丹參酮類提取因素影響大小依次為溶劑體積分?jǐn)?shù)（B） >提取時(shí)間（C） >提取溫度（A） >溶劑倍數(shù)（D），最佳提取條件為A1B2C3D3。綜合丹酚酸B 和丹參酮類的提取率，并以各自提取率的1/2加和之后的提取率作為最終的選擇依據(jù)，得出最佳提取條件為提取溶劑70%乙醇，提取溫度80 ℃，每次提取2 h，溶劑倍數(shù)為6 BV。

表8 直觀分析

2.3 正交試驗(yàn)驗(yàn)證和提取次數(shù)的優(yōu)化

按正交試驗(yàn)得到的工藝條件，對(duì)提取次數(shù)進(jìn)行優(yōu)化和正交工藝驗(yàn)證。分別稱取丹參飲片藥材50 g的樣品3 份，前2 次提取液和第3 次提取液分開收集，分別檢測(cè)丹酚酸B 和丹參酮類的含量，計(jì)算丹酚酸B 和丹參酮類的提取率。

提取次數(shù)優(yōu)化和正交驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見表9。

由表9 可知，第3 次提取丹酚酸B 和丹參酮類提取率的提取率平均值分別為11.5%和5.99%，需進(jìn)行第3 次提取。3 組驗(yàn)證試驗(yàn)丹酚酸B 和丹參酮類的提取率平均值分別為82.40%和92.67%，已基本提取完全。

表9 提取次數(shù)優(yōu)化和正交驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

2.4 溫度對(duì)丹參提取液中丹酚酸B 和丹參酮類的穩(wěn)定性影響

考慮丹酚酸B 和丹參酮類化合物對(duì)溫度和加熱時(shí)間的敏感性，開展丹參提取液在不同溫度和不同加熱時(shí)長(zhǎng)下的穩(wěn)定性考查，進(jìn)一步驗(yàn)證提取工藝的合理性。準(zhǔn)確吸取丹參中試第一批提取液5 mL 于試管中，共7 份，取一支做空白對(duì)照，其余6 支均分后分別置于65 ℃和80 ℃水浴中保溫，連續(xù)加熱8 h，分別在2，4，8 h 取出一支試管，自來水迅速冷卻，轉(zhuǎn)移到10 mL 容量瓶中定容，檢測(cè)丹酚酸B和丹參酮類質(zhì)量濃度，計(jì)算其降解率。

溫度對(duì)丹酚酸B 和丹參酮類的影響數(shù)據(jù)見表10。

表10 溫度對(duì)丹酚酸B 和丹參酮類的影響數(shù)據(jù)

由表10 可知，丹參提取液分別在65 ℃和80 ℃下恒溫加熱8 h，相同加熱時(shí)間下，低溫65 ℃條件下丹酚酸B 和丹參酮類的降解率略小于高溫80℃，但2 種溫度條件下丹酚酸B 和丹參酮類的質(zhì)量濃度變化很小，由此可以說明短時(shí)間內(nèi)，65 ℃和80 ℃恒溫加熱對(duì)丹參提取液中丹酚酸B 和丹參酮類的穩(wěn)定性沒有影響，此提取工藝中的提取溫度和提取時(shí)間參數(shù)合理。

2.5 丹參提取工藝中試驗(yàn)證

丹參提取工藝確定：提取時(shí)溶劑為70%乙醇，溶劑倍數(shù)為藥材量的6 BV，提取溫度為80 ℃，提取3 次，每次2 h。為驗(yàn)證工藝條件進(jìn)行3 批中試，每批次藥材量為5 kg。收集提取液，檢測(cè)丹酚酸B和丹參酮類質(zhì)量濃度，計(jì)算丹酚酸B 和丹參酮類的提取率。

中試試驗(yàn)驗(yàn)證見表11。

表11 中試試驗(yàn)驗(yàn)證

由表10 可知，3 批中試的丹酚酸B 和丹參酮類的提取率平均分別為82.62%和94.49%。通過3 批次小試驗(yàn)證和3 批次中試驗(yàn)證研究結(jié)果，表明該提取工藝穩(wěn)定、可行，重現(xiàn)性良好。

3 結(jié)論

試驗(yàn)以丹酚酸B 和丹參酮類（丹參酮ⅡA、丹參酮Ⅰ和隱丹參酮之和） 提取率為考查指標(biāo)，以提取溫度、提取時(shí)間、溶劑倍數(shù)和溶劑為考查因素，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)進(jìn)行全面考查，確定最佳提取工藝為提取溶劑70%乙醇，溶劑倍數(shù)6 BV，提取溫度80 ℃，提取3 次，每次提取2 h。

溫度對(duì)丹酚酸B 和丹參酮類穩(wěn)定性的影響研究結(jié)果表明，提取工藝中的提取溫度和提取時(shí)間參數(shù)合理。驗(yàn)證試驗(yàn)中丹酚酸B 和丹參酮類提取率均較高，表明采用此提取工藝可以同時(shí)將水溶性和脂溶性成分基本提取完全，且工藝簡(jiǎn)單穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，適用于工業(yè)化大生產(chǎn)。