黃精多糖對急性抑郁小鼠模型的改善作用及機制

韋 震，宋洪波，安鳳平，孫 晶，李淑英，姜 寧，劉新民，王鳳忠, ，盧 聰,

（1.福建農(nóng)林大學食品科學學院，福建福州 350000；2.中國農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，北京 100193；3.中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所，北京 100193）

抑郁癥是一類以長期心情消沉為主的慢性情緒障礙疾病，表現(xiàn)為情緒低落、入睡困難、飲食減少等，更有甚者悲觀厭世、有自殺念頭，對患者日常生活、工作和學習產(chǎn)生嚴重影響[1-2]。據(jù)世界衛(wèi)生組織最近的報告，全球已有3.5億人患此病，占所有疾病人數(shù)的7.5%[3]。目前抑郁癥的治療以口服藥物為主，如三環(huán)類抗抑郁藥（tricyclic antidepressant，TCAs）、單胺氧化酶抑制劑（Monoamine Oxidase Inhibitor，MAOI）和選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（Selective Serotonin Reuptake Inhibitor，SSIR）等，但其副作用大、治療昂貴、易產(chǎn)生藥物依賴性、易復發(fā)等，因此抑郁癥的有效預防和治療是現(xiàn)實難題，也引起科學界的關注[4-5]。近年來有研究陸續(xù)報道食療食補可為抑郁癥的防治提供新的思路，如猴頭菇[6]、山藥[7]、枸杞[8]、苦瓜[9-10]等食材中的多糖成分可有效改善神經(jīng)功能障礙，具備抗抑郁作用。

隨著“健康中國2030”、“國民營養(yǎng)健康計劃”等國家戰(zhàn)略的開展，結(jié)合目前抑郁癥防治的重大需求，藥食兩用資源的抗抑郁功效挖掘和開發(fā)利用意義重大。黃精（Polygonati rhizoma）作為一種傳統(tǒng)中藥，首記載于陶弘景的《名醫(yī)別錄》[11]，并于2002年被我國衛(wèi)生部收錄在既是食品又是中藥材物質(zhì)目錄中。黃精多糖（Polysaccharide ofPolygonati rhizoma,PSP）作為其主要的活性成分，具有抗疲勞[12]、增強免疫[13]、抗炎[14]等生物活性，可通過激活多巴胺（dopamine，DA）合成通路[15]、減輕皮層和海馬的病變、改善大腦超微結(jié)構[16]、調(diào)節(jié)海馬和皮層氧化應激水平[17]起到改善學習記憶和睡眠等神經(jīng)功效，但有關黃精多糖抗抑郁的作用及機制探究鮮見相關報道。因此本研究對小鼠預防干預黃精多糖3周后，采用經(jīng)典的急性誘導行為絕望小鼠抑郁模型評價黃精多糖的抗抑郁活性，檢測腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平、炎癥因子含量以及色氨酸代謝相關代謝產(chǎn)物表達水平，以研究黃精多糖抗抑郁的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF 級 ICR 小鼠 60 只（雄性，8～9 周，18～20 g），由北京維通利華實驗動物公司提供，實驗小鼠生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0006。本實驗遵守動物福利3R原則、符合國際實驗動物倫理學要求，并獲中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所實驗動物管理與動物福利委員會（IACUC）的審查批準。小鼠自由飲用食水，實驗期間室內(nèi)溫度保持在22～24 ℃，相對濕度保持在55%±10%，保持12 h黑暗/12 h照明的晝夜節(jié)律（8:00～20:00亮燈）；黃精多糖（純度 70%，批號S27804）、帕羅西?。ㄅ?10429-35-1） 上海源葉生物科技有限公司；5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、多巴胺（dopamine，DA）、去甲腎上腺素（NE）、血清中腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）、白介素-10（interleukin-10，IL-10）、5-羥吲哚乙酸（5- hydroxyindolacetic acid，5-HIAA）酶聯(lián)免疫吸附分析（enzyme linked immunosorbent assay，Elisa）試劑盒 南京建成生物工程研究所；3-羥基犬尿氨酸（3-hydroxycaninuric acid，3-HK）、色氨酸（Tryptophan，TRP）Elisa試劑盒 江萊生物有限公司。

5810R高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；M1000 多功能酶標儀 瑞士Tecan公司；KQ-600DV數(shù)控超聲波清洗器 昆山舒美公司；空場儀（KSYYOP-V4.0）、懸尾實驗儀（KSYY-TS-V3.0）、強迫游泳檢測儀器（KSYY-FS-V3.0） 均由中國醫(yī)學科學院藥用植物研究所、中國航天員中心和北京康森益友科技有限公司聯(lián)合研發(fā)。

1.2 實驗方法

1.2.1 分組及給藥 小鼠適應環(huán)境5 d后，根據(jù)體重隨機分成以下5組，空白對照組（灌胃等體積蒸餾水）、帕羅西汀對照組（灌胃帕羅西汀10 mg/kg），黃精多糖低劑量組（100 mg/kg）、黃精多糖中劑量組（200 mg/kg）和黃精多糖高劑量組（400 mg/kg），每組12只。每天上午9:00灌胃1次，灌胃體積0.1 mL/10 g，每日灌胃直至行為學檢測結(jié)束。給藥3周后依次進行空場實驗、懸尾實驗和強迫游泳實驗。

1.2.2 空場實驗 給藥第21 d給藥1 h后立即開始空場實驗，根據(jù)本實驗室前期建立的方法，對小鼠的自主活動表現(xiàn)及運動情況進行檢測[18]。將小鼠面壁邊緣放入測試箱內(nèi)（每次實驗從同一位置同一方向放入），適應3 min后進行檢測，觀察統(tǒng)計小鼠在5 min測試期間內(nèi)的自主運動情況。每次檢測結(jié)束后，對小鼠糞便和尿液進行清理，用75%酒精去除氣味。

1.2.3 懸尾實驗 給藥第22 d給藥1 h后，參照Zhang等[19]報道的方法，在小鼠尾巴距尾尖部約1～1.5 cm處纏上提前剪好的膠布（膠布約寬5 mm，長6～8 cm），掛在“S”型小鐵鉤上，使其倒懸體位，其頭部距離懸尾箱底面約5～10 cm，小鼠掙扎時使得鐵鉤上的張力變化，該信號由懸尾箱支架上的傳感器接收，系統(tǒng)自動記錄小鼠不動時間。小鼠倒掛2 min適應后進行檢測，系統(tǒng)對4 min檢測期內(nèi)累計靜止時間進行統(tǒng)計（小鼠停止掙扎或靜止為不動狀態(tài)）。每次小鼠試驗后，清除糞便尿液并使用75%酒精清除氣味。

1.2.4 強迫游泳實驗 第23 d給藥1 h后，參照Wang等[20]報道的方法并進行改進，使用強迫游泳實驗的計算機圖像實時檢測分析處理系統(tǒng)，設置實驗參數(shù)、幾何形狀和照度定標后，將小鼠放入XSC-恒溫游泳儀（高20 cm，直徑 14 cm，水深15 cm，水溫23±1 ℃）中適應2 min，適應后，系統(tǒng)立即記錄并統(tǒng)計小鼠在4 min內(nèi)的累計不動時間（以小鼠停止掙扎或呈漂浮狀態(tài)、四肢有輕微動作以保持頭部在水面為不動狀態(tài)）。每次動物試驗后更換水。

1.2.5 體重檢測 每3 d稱重一次，監(jiān)測各組小鼠體重變化。

1.2.6 樣本采集 實驗結(jié)束后，小鼠摘眼球采血并處死，在冰上迅速分離皮層、海馬等腦組織后存于-80 ℃冰箱備用；血樣在室溫下靜置30 min后，3500 r/min離心15 min取上清液，分裝移至EP管，置于-80 ℃保存，留待檢測。

1.2.7 生化指標檢測 皮層和海馬在4 ℃生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，稱重后加入組織重量9倍的4 ℃生理鹽水制成10%組織勻漿，2500 r/min離心10 min后取上清液進行測定[17-18]。按照 Elisa試劑盒說明書要求檢測血清中TNF-α、IL-6和IL-10含量，皮層中5-HT、DA和NE含量，海馬中TRP、5-HIAA和3-HK含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實驗結(jié)果采用SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，結(jié)果表示為均值±標準差（Mean±SD）。進行單因素方差分析（one-way ANOVA），使用最小顯著差數(shù)法（LSD）多重比較方法比較組間差異，當P＜0.05則認為差異具有統(tǒng)計學意義。使用GraphPad Prism 8.0.2軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重變化

體重是機體生長發(fā)育的一個重要指標，反映小鼠的生長情況[21]。如表1所示，在實驗分組時，各組小鼠的平均體質(zhì)量基本相同（P＞0.05）。與空白組相比，給藥7 d后帕羅西汀組出現(xiàn)體重升高趨勢，給藥14 d后黃精多糖處理組（100、200和400 mg/kg）體重呈上升趨勢，但均未呈顯著性差異（P＞0.05）。實驗期間各組小鼠的體質(zhì)量亦無顯著性差異（P＞0.05），表明100、200和400 mg/kg的黃精多糖對小鼠的生長發(fā)育無不良影響，各組小鼠生長狀況良好、活動表現(xiàn)和毛色正常。

表1 各組小鼠體重變化 （Mean±SD，n=12）Table 1 Body weight of mice in each group(Mean±SD, n=12)

2.2 黃精多糖對小鼠自主活動的影響

空場實驗是檢測小鼠在陌生環(huán)境內(nèi)的行為表現(xiàn)及探索行為，反映其自發(fā)行為、運動情況及情緒狀態(tài)，其活動強度用于評價小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的興奮或抑制狀態(tài)[22]。如表2所示，在給藥黃精多糖3周后進行的空場實驗中，與空白組相比，帕羅西汀對照組和各劑量黃精多糖處理組（100、200和400 mg/kg）的總路程、運動路程、運動時間和運動速度無顯著性差異（P＞0.05），表明黃精多糖并未對小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生興奮作用，排除黃精多糖抗抑郁作用的假陽性結(jié)果。結(jié)合體重變化的結(jié)果來看，給藥3周黃精多糖并未對小鼠的自主活動產(chǎn)生影響，黃精多糖低毒性、適宜長期食用[23-24]、多靶點作用[25]的特點在本實驗中得到體現(xiàn)。

表2 黃精多糖對小鼠空場自主活動度的影響（Mean±SD，n=12）Table 2 Effects of PSP on open field test of locomotor activity in mice (Mean±SD, n=12)

2.3 黃精多糖對小鼠懸尾實驗不動時間的影響

小鼠在強迫懸掛或游泳的應激條件下，經(jīng)過反復掙扎后的絕望表現(xiàn)即不動狀態(tài)，不動狀態(tài)持續(xù)的時間是衡量“抑郁樣”行為的指標[26]。如圖1所示，在給藥3周后進行的小鼠懸尾實驗中，與空白組比較，帕羅西汀組和黃精多糖處理組（100、200、400 mg/kg）的不動時間分別降低了98.89%、91.19%、93.25%、91.83%，均呈極顯著差異（P＜0.05），其余組間無差異，表明帕羅西汀和黃精多糖對懸尾所致小鼠急性行為絕望行為具有改善作用。陽性藥帕羅西汀是一種選擇性五羥色胺再攝取劑（SSRI），能夠阻滯5-HT再吸收，提升機體神經(jīng)突觸間隙內(nèi)濃度，具有高效、強力的抗抑郁作用, 可顯著縮短實驗中動物的不動時間[27]。

圖1 黃精多糖對小鼠懸尾絕望狀態(tài)下不動時間的影響（Mean±SD, n=12）Fig.1 Effects of PSP on immobility time of mice in tail suspension test （Mean±SD，n=12）

2.4 黃精多糖對小鼠強迫游泳實驗不動時間的影響

強迫游泳實驗原理與懸尾實驗類似，通過檢測小鼠在強迫應激條件下的不動時間來反映小鼠是否抑郁的行為學實驗。如圖2所示，與空白組相比，帕羅西汀對照組和黃精多糖處理組（100、200和400 mg/kg）小鼠的不動時間均顯著降低（P＜0.05），不動時間分別降低了49.42%、39.86%、40.28%、29.96%，說明黃精多糖可改善小鼠在強迫游泳環(huán)境中的急性抑郁樣行為。

圖2 黃精多糖對小鼠強迫游泳絕望狀態(tài)下的不動時間的影響（Mean±SD，n=12）Fig.2 Effects of PSP on immobility time of mice in forced swimming test （Mean±SD, n=12）

2.5 黃精多糖對急性抑郁小鼠皮層中5-HT、DA、NE的影響

單胺類神經(jīng)遞質(zhì)假說中，神經(jīng)細胞突觸間隙的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、DA和NE濃度的降低是誘導抑郁癥發(fā)生的主要原因之一[28]。如圖3所示，與空白對照組相比，黃精多糖處理組（100、200和400 mg/kg）均顯著升高小鼠皮層中5-HT、DA及NE的質(zhì)量濃度（P＜0.05），帕羅西汀組顯著提高5-HT和DA質(zhì)量濃度（P＜0.05）。本研究表明黃精多糖組（200和400 mg/kg）可顯著提高小鼠皮層的 5-HT、NE 和 DA水平，表明黃精多糖干預抑郁癥狀可能通過上調(diào)皮層中的單胺類遞質(zhì)的水平有關。此外，帕羅西汀等SSIR可增加單胺神經(jīng)遞質(zhì)5-HT的濃度，但對NE受體無影響[29]，該研究與本實驗中神經(jīng)遞質(zhì)水平的結(jié)果一致，即帕羅西汀未引起NE濃度的顯著上升。

圖3 黃精多糖對小鼠皮層中神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響（Mean±SD，n=12）Fig.3 Effect of PSP on monoamine neurotransmitters contents in cortex of mice （Mean±SD，n=12）

2.6 黃精多糖對急性抑郁小鼠血清中細胞因子TNF-α、IL-10的影響

細胞因子的水平也是評價抑郁癥的重要指標，向腦室內(nèi)注射細胞因子可降低大鼠額葉皮質(zhì)、中腦和紋狀體內(nèi)5-HT含量[30]，甚至有些研究認為細胞因子水平與抑郁程度呈正相關[31]。抑郁癥引發(fā)外周血和中樞神經(jīng)系統(tǒng)中炎癥反應，大量分泌的細胞因子加重抑郁癥狀，對相關神經(jīng)回路和神經(jīng)遞質(zhì)功能造成直接或間接的影響，從而加重不同亞型抑郁癥的發(fā)展[32-33]。在抑郁癥治療過程中，抗抑郁藥物的服用可有效逆轉(zhuǎn)患者外周血清中白介素、腫瘤壞死因子水平的升高[34]。由圖4A可知，與空白組相比，帕羅西汀對照組和黃精多糖處理組（100、200和400 mg/kg）小鼠血清中TNF-α濃度顯著降低（P＜0.05）。如圖4B所示，與空白組相比，黃精多糖中劑量組（200 mg/kg）的IL-10含量呈顯著性下降（P＜0.05），其余組僅呈下降趨勢。細胞因子TNF-α與抑郁中快感缺失有直接聯(lián)系，TNF-α可直接對紋狀體多巴胺能活性選擇性破壞，以致無快感化；升高的TNF-α持續(xù)激活下游細胞因子，進而影響DA、谷氨酸等神經(jīng)遞質(zhì)、破壞神經(jīng)元結(jié)構，進而起到對抑郁癥的影響[33]。陳娟等[35]用黃精多糖灌胃6-羥基多巴胺誘導的帕金森模型大鼠8周后，過氧化物酶體增殖物激活受體-γ（PPAR-γ） 表達上調(diào)、炎癥反應被抑制，進而促進多巴胺神經(jīng)元的再生。這與本研究結(jié)果有一致之處，因此推測黃精多糖通過下調(diào)小鼠血清中TNF-α和IL-10的水平、參與調(diào)節(jié)小鼠的炎癥反應，對神經(jīng)遞質(zhì)水平和功能起到保護作用，進而預防抑郁。

圖4 黃精多糖對小鼠血清中細胞因子水平的影響（Mean±SD，n=12）Fig.4 Effect of PSP on inflammation in serum of mice（Mean±SD，n=12）

2.7 黃精多糖對急性抑郁小鼠海馬中TRP、5-HIAA和3-HK含量的影響

TRP代謝途徑在抑郁焦慮等情緒活動中具有重要的作用，具有特定神經(jīng)活性特性的代謝產(chǎn)物過量或者比例的變化是誘發(fā)多種神經(jīng)精神疾病的原因。如圖5A和圖5C所示，與空白組相比，帕羅西汀對照組和黃精多糖對照組的TRP及其代謝產(chǎn)物3-HK水平均呈顯著性下降（P＜0.05）。但在5-HIAA指標中，帕羅西汀對照組和黃精多糖中劑量組僅呈上升趨勢，未出現(xiàn)顯著性變化（圖5B）（P＞0.05）。TRP 主要有兩條代謝途徑，首先可在色氨酸氫化酶（TPH1）的作用下代謝成 5-HT，繼而在MAO酶的作用下代謝為5-HIAA[36]。TRP第二條代謝途徑為在吲哚胺-2,3-雙加氧酶（IDO）或色氨酸-2,3-雙加氧酶（TDO）的作用下生成犬尿氨酸（KYN），進而在犬尿氨酸-3-單氧化酶（KMO）的作用下生成3-羥基犬尿氨酸（3-HK），3-HK可引起氧化應激和產(chǎn)生神經(jīng)毒性[37]。Li等[38]的研究表明大鼠經(jīng)不可預測溫和刺激（CUMS）5周后出現(xiàn)快感缺失、絕望時間變長等抑郁樣行為，并伴隨以5-HT和KYN通路紊亂為主的TRP代謝異常。本實驗表明，黃精多糖下調(diào)小鼠海馬中TRP和3-HK水平，結(jié)合5-HT水平升高結(jié)果，推測黃精多糖可能通過增強TPH1酶活、抑制IDO1酶的活性，進而增加TRP/5-HT通路的代謝。此外，黃精多糖下調(diào)了具有神經(jīng)毒性的3-HK水平，表明TRP/KYN/3-HK通路被抑制。綜上，推測黃精多糖可能通過激活TPH1、抑制TDO酶活等途徑調(diào)節(jié)TRP代謝通路，提高腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平、抑制神經(jīng)毒性物質(zhì)的產(chǎn)生起到預防抑郁的作用。此外，帕羅西汀可通過上調(diào)中樞系統(tǒng)中5-HT的濃度誘導TRP代謝通路被激活，具有神經(jīng)毒性的3-HK代謝產(chǎn)物的下降表明，TRP/KYN/3-HK代謝通路可能被抑制，這與本實驗中黃精多糖的分析結(jié)果類似，但具體的作用位點需對犬尿氨酸代謝通路進行進一步研究。

圖5 黃精多糖對小鼠海馬中色氨酸代謝的影響（Mean±SD，n=12）Fig.5 Effect of PSP on the TRP mechanism in hippocampus（Mean±SD，n=12）

3 結(jié)論

本研究首次使用急性抑郁模型評價黃精多糖的抗抑郁功效，發(fā)現(xiàn)黃精多糖灌胃3周可有效縮短小鼠在懸尾和強迫游泳應激條件下的不動時間，具有干預小鼠抑郁樣行為的作用。此外，黃精多糖明顯升高小鼠腦組織神經(jīng)遞質(zhì)5-HT、NE和DA含量，降低細胞因子TNF-α和IL-10水平，促進TRP向代謝5-HT代謝并抑制具有神經(jīng)毒性的TRP/3-HK代謝通路。由此推測，黃精多糖的抗抑郁作用可通過上調(diào)神經(jīng)遞質(zhì)水平和降低炎癥來實現(xiàn)，并對TRP代謝具有調(diào)節(jié)作用。本研究從細胞因子和TRP代謝的角度初步探索了黃精多糖的抗抑郁作用機制，為黃精多糖神經(jīng)功效挖掘提供新方向。但有關黃精多糖抗抑郁活性和作用機制有待進一步闡明。