基于靜電層層自組裝技術(shù)的苦瓜籽油多層乳液的制備及其表征

王惠玲，張 瑞，吳慕慈，楊 寧，葉樹芯，帥曉艷，江思佳，李玉保，何靜仁,

（1.武漢輕工大學(xué)硒科學(xué)與現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)學(xué)院，湖北武漢 430023；2.大宗糧油精深加工教育部重點實驗室，湖北武漢 430023；3.運鴻集團股份有限公司，湖北武穴 435406）

苦瓜（Momordica charantiaL.），葫蘆科（Cucurbitaceae）苦瓜屬植物，為一年生或多年生藤本植物，不僅有良好的食用價值，而且有很高的藥用價值?？喙献丫哂锌狗逝諿1]、抗癌[2]、抗炎[3]、抗病毒[4]等多種藥理作用?？喙献延妥鳛榭喙献训母碑a(chǎn)物，是自然界中為數(shù)不多富含α-桐酸的可食用來源之一[5]。研究發(fā)現(xiàn)α-桐酸具有降血脂[6]和抗癌[7]等多種生理活性，因此苦瓜籽油具有潛在的藥用和保健價值。然而由于苦瓜籽油具有強烈的不良風(fēng)味和口感，且其極易被氧化、在光和微量金屬的催化下極易發(fā)生異構(gòu)化，這些特性限制了苦瓜籽油的應(yīng)用[8]。因此，基于苦瓜籽油的上述缺點，可選擇水包油乳液作為苦瓜籽油的遞送體系并對其進行研究。

靜電層層自組裝技術(shù)（Electrostatic Layer by Layer Self-assembly Technique）是指利用表面帶有相反電荷的不同電解質(zhì)間的吸附作用，在經(jīng)過活化帶電荷的基材表面逐層沉積，從而形成特定厚度的多層復(fù)合膜[9]，具有制備簡單、成膜物質(zhì)豐富、厚度可控、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。利用該技術(shù)制備得的多層乳液由于具有較厚及較致密的界面層，較高的界面電荷密度及良好的界面特性，因而具有較高的乳液穩(wěn)定性，較長的貨架期[10-11]。通過靜電層層自組裝技術(shù)在油滴周圍形成更厚的界面層，可作為保護脂溶性功能因子的策略，防止其降解，提高其生物可及性[12]。目前已成功研究了包封ω-3脂肪酸[13]、β-胡蘿卜素[14]和維生素E[15]等的多層乳液。

在多層乳液的制備中，常用的帶電荷的生物聚合物是大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、多糖等[11]。乳清分離蛋白是奶酪工業(yè)的副產(chǎn)物，具有人體所需的全部必需氨基酸，營養(yǎng)價值極高。因此，乳清分離蛋白被廣泛應(yīng)用于食品與藥品中，在食品中主要是用作表面活性劑[15]。果膠是一種帶負電的聚合電解質(zhì)，可以同殼聚糖等帶正電的聚合電解質(zhì)相互作用，在油滴表面形成多層界面膜，可以更好的保護油滴[16]。殼寡糖屬于陽離子多糖，是一種理想的高分子生物材料，具有較好的生物相容性、可降解性和生物活性[17]。利用靜電層層自組裝技術(shù)將苦瓜籽油進行包埋，既可以掩蓋苦瓜籽油不良風(fēng)味和口感，避免多不飽和脂肪酸被氧化，還具有乳液粒徑和天然高分子聚合電解質(zhì)性質(zhì)可控制的特點[18]。

本文以乳清分離蛋白（whey protein isolate，WPI）作為乳化劑制備單層乳液，結(jié)合蘋果果膠（apple pectin，AP）、殼寡糖（chitosan oligosaccharide，CTS），采用靜電層層自組裝技術(shù)制備雙層和三層乳液，通過粒徑、多分散指數(shù)（polydispersity index，PdI）和ζ-電位表征方法，確定乳化劑的用量以及各層乳液制備最佳pH；并對在最優(yōu)條件下制備的三種乳液進行理化性質(zhì)表征，以期為苦瓜籽油的開發(fā)利用提供新的思路和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

超臨界提取苦瓜籽油 江蘇高科制藥設(shè)備有限公司；乳清分離蛋白WPI9410 食品級，蛋白含量89%（濕基）脂肪含量1%（濕基），美國Hilmar公司；蘋果果膠APA185 酯化度60.9%，半乳糖醛酸含量＞65%，煙臺安得利果膠股份有限公司；殼寡糖（分子量≤2000 Da）、14%三氟化硼-甲醇 阿拉丁試劑公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

Ultra-turrax T18型高速分散器 德國IKA公司；ZEN3600納米激光粒度及電位分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；IX83全電動倒置顯微鏡 日本奧林巴斯株式會社；Turbiscan Lab穩(wěn)定分析儀 法國Formulaction公司；STARTER 3100 pH計 奧豪斯儀器（上海）有限公司；AH-2010型高壓均質(zhì)機ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司；PF-101T集熱式恒溫磁力攪拌器 鞏義市英峪予華儀器廠；Discovery DHR-2流變儀 美國TA儀器公司；R3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Buchi公司；7890A+5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀美國Agilent公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 苦瓜籽油基本指標測定 相對密度：參照GB/T 5518-2008進行測定；折光指數(shù)：參照GB/T 5527-2010進行測定；酸值：參照GB/T 5510-2011進行測定；碘值：參照GB/T 5532-2008進行測定；過氧化值：參照GB 5009.227-2016進行測定；皂化值：參照GB/T 5534-2008進行測定。

1.2.2 水相的制備 參考Ali等[19]的方法略有修改，制備濃度為 1%（w/v）的 WPI磷酸鹽緩沖液（pH7.0），制備不同濃度的AP磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液（pH4.0）（1.5%～4.5%，w/v），制備不同濃度的CTS溶液（1%～6%，w/v），制備的溶液均在室溫下經(jīng)磁力攪拌4 h，4 ℃冰箱過夜放置待用。

1.2.3 苦瓜籽油單層乳液制備 參考Javier等[20]的方法并稍作修改，制備苦瓜籽油含量為5%（w/w）的苦瓜籽油乳液，將苦瓜籽油加入WPI溶液，用3 mol/L HCl和3 mol/L NaOH調(diào)節(jié)乳液pH，10000 r/min高速剪切5 min，在一定均質(zhì)壓力下均質(zhì)一定次數(shù)制備得苦瓜籽油單層乳液。以乳液平均粒徑、PDI與ζ-電位值為考察指標，通過單因素實驗分析均質(zhì)壓力（500、600、700 bar）、均質(zhì)次數(shù)（3、5、7、9 次）與pH（3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.6、5.0、5.6、6.2、7.0）對乳液質(zhì)量的影響。

1.2.4 苦瓜籽油雙層乳液制備 參考Javier等[20]的方法并稍作修改，在磁力攪拌器上，以3 mL/min的滴速將10 mL不同濃度的AP溶液（1.5%～4.5%，w/v）滴入90 mL苦瓜籽油單層乳中，用3 mol/L HCl和3 mol/L NaOH調(diào)節(jié)乳液pH，再經(jīng)過8000 r/min，1 min高速剪切制備得苦瓜籽油雙層乳液。所得的乳液含有 4.5%（w/w）苦瓜籽油，0.15% （w/v）到 0.45%（w/v）AP。以乳液平均粒徑、PDI與ζ-電位為考察指標，通過單因素實驗分析 AP濃度（1.5%、2.5%、3.5%、4.5%，w/v）與 pH（3.0、3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2、4.4）對乳液質(zhì)量的影響。

1.2.5 苦瓜籽油三層乳液制備 參考Javier等[20]的方法并稍作修改，在磁力攪拌器上，以3 mL/min的滴速將12 mL不同濃度的CTS溶液（1%～6%，w/v）滴入 96 mL雙層乳中，用3 mol/L HCl和 3 mol/L NaOH調(diào)節(jié)乳液pH，再經(jīng)過8000 r/min，1 min高速剪切制備得苦瓜籽油三層乳液。所得的乳液含有4.0% （w/w）苦瓜籽油，0.11%（w/v）到 0.67%（w/v）CTS。以乳液平均粒徑、PDI與ζ-電位為考察指標，通過單因素實驗分析CTS濃度（1%、2%、3%、4%、5%、6%，w/v）與 pH（2、2.2、2.6、3.2）對乳液質(zhì)量的影響。

1.2.6 乳液平均粒徑、PDI及ζ-電位的測定 參考Shi等[21]的方法并略作修改，乳狀液粒度通過ZEN3600納米激光粒度及電位分析儀測定，分散相的折射率和吸收率分別設(shè)定為1.475和0.001，連續(xù)相的折射率為1.33，測試溫度25 ℃。乳狀液以1:10的比例用去離子水稀釋，測量其電位值。乳狀液以1:600的比例用去離子水稀釋，測量其平均粒徑和PDI。

1.2.7 乳液的微觀形態(tài) 使用奧林巴斯全電動倒置顯微鏡IX83，以100放大倍率對乳液進行觀察。

1.2.8 乳液靜態(tài)流變性能測定 參考Niu等[22]的方法并略作修改，采用Discovery DHR-2流變儀對多層乳液靜態(tài)流變性質(zhì)進行測定。采用直徑為60 mm的平行板，間距設(shè)置為1 mm，剪切速率1～100 s-1，應(yīng)變?yōu)?.1%，溫度25 ℃。

1.2.9 脂肪酸含量測定

1.2.9.1 乳液破乳 參考武西岳[23]的方法并稍作修改，取乳液10 mL，加入1.0 g無水硫酸鈉，適當?shù)恼袷幓靹颍?0 ℃的水浴中超聲20 min，6000 r/min離心20 min，分液，可分離得到水相和油相。破乳后，參照1.2.9.1的方法進行甲酯化。

1.2.9.2 脂肪酸甲酯化 參考GB5009.168-2016《食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》采用14%三氟化硼-甲醇溶液催化油脂甲酯化。

1.2.9.3 GC-MS條件 參考帥曉艷等[24]的方法，氣相色譜分析條件：色譜柱為HP-88，100 m× 0.25 mm×0.20 μm；載氣為99.999%高純氮氣，恒流模式，柱流速：1 mL/min；進樣量 1 μL，不分流；進樣口溫度為250 ℃；程序升溫：150 ℃ 保持 0 min，再以 4 ℃/min升溫至 190 ℃，保持 5 min，再以 2 ℃/min升溫至230 ℃，保持 10 min。

質(zhì)譜條件：離子化方式EI+，發(fā)射電流200 VA；電子能量70 eV；接口溫度250 ℃；離子源溫度200 ℃；檢測電壓350 V。

質(zhì)譜庫：NIST11.L。

1.2.10 乳液物理穩(wěn)定性測定 用Turbiscan Lab穩(wěn)定分析儀，分析新鮮制備的乳液在1 h內(nèi)的穩(wěn)定性情況。量取大約20 mL乳液置于Turbiscan專用樣品瓶中，在25 ℃條件下先每1 min掃描一次，持續(xù)10 min后，每5 min掃描一次，持續(xù)掃描50 min，觀察在此期間乳液的背散射光（ΔBS）變化。用 Turbiscan Lab穩(wěn)定分析儀，分析各層乳液在14 d內(nèi)穩(wěn)定性指數(shù)（TSI）的變化，將制備好的乳液取大約20 mL置于Turbiscan專用樣品瓶中，與25 ℃溫度下存放，每天測量一次TSI值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實驗重復(fù)三次測定，結(jié)果以平均值±標準偏差（means±SD）表示。采用SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行顯著性分析，用LSD和Duncan極差分析結(jié)果差異顯著性水平（P＜0.05）和（P＜0.01）；用 OriginPro 9.0軟件進行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜籽油理化指標及脂肪酸組成

按照國標相關(guān)方法對超臨界提取的苦瓜籽油理化指標進行測定，得到結(jié)果如表1所示。碘值用于判斷食用油的不飽和程度，油脂的碘值越大，說明其不飽和程度越高，脂肪酸的不飽和鍵也越多，油脂的氧化穩(wěn)定性就越差，越容易被氧化，而導(dǎo)致油脂腐敗變質(zhì)[25]。由表1所示，苦瓜籽油的碘值為137.646±0.626 g/100 g，表明利用超臨界CO2萃取制備的苦瓜籽油中脂肪不飽和度較高?？喙献训倪^氧化值較高為1.317±0.006 mmol/kg，這可能是因為不飽和脂肪酸極易發(fā)生氧化反應(yīng)而導(dǎo)致的。所得結(jié)果與張飛等[5]的測量結(jié)果不一致，可能與苦瓜種類、提取方法和放置時間有關(guān)[26]。

表1 苦瓜籽油的理化性質(zhì)Table 1 Physicochemical properties of BGSO

2.2 苦瓜籽油單層乳液制備的單因素實驗結(jié)果

2.2.1 均質(zhì)條件對苦瓜籽油單層乳液的影響 由圖1可知，在均質(zhì)次數(shù)相同時，相較于500 bar，均質(zhì)壓力為600和700 bar時苦瓜籽油單層乳液的平均粒徑極顯著減小（P＜0.01）。當均質(zhì)壓力為600 bar時，均質(zhì)次數(shù)≥5次時，苦瓜籽油單層乳液的粒徑無明顯變化。這可能是由于高壓均質(zhì)壓力和次數(shù)的增加帶來強烈的剪切流場，使得乳液獲得更有效的乳化[27]。同時，由圖1可知，當均質(zhì)壓力為600 bar時，在相同的均質(zhì)壓力下，隨著均質(zhì)次數(shù)增加，乳液PDI值呈先減小再增大的趨勢，可能是由于均質(zhì)次數(shù)的增加帶給乳液的能量過大，從而使乳液產(chǎn)生絮凝聚結(jié)等現(xiàn)象[28]。Kuhn等[29]比較了高壓均質(zhì)壓力（20和80 MPa）和均質(zhì)次數(shù)（1～7次）對亞麻籽油-乳清分離蛋白乳液穩(wěn)定性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)增加均質(zhì)壓力和均質(zhì)次數(shù)可以降低液滴大小，然而，在高壓（80 MPa）下，均質(zhì)次數(shù)的增加會促進乳液液滴的聚結(jié)。

圖1 均質(zhì)條件對苦瓜籽油單層乳液的平均粒徑和PDI的影響Fig.1 Effects of homogeneous conditions on mean diameter and polydispersity index of BGSO primary emulsion

不同均質(zhì)條件下制備的苦瓜籽油單層乳液的ζ-電位變化如圖2所示，600 bar均質(zhì)壓力時，均質(zhì)7次獲得乳液的ζ-電位絕對值最大（-23.4±0.7 mV），與均質(zhì)5次獲得乳液的ζ-電位值（-22.3±0.8 mV）無顯著差異。ζ-電位的絕對值越小，意味著油滴之間形成的靜電排斥力小，可能不足以克服液滴和能壘之間的分子吸引力（即范德華力和疏水吸引力），從而引起乳液發(fā)生絮凝、液滴傾向聚集，使乳液分層率增加[30]。因此從節(jié)約能源的角度出發(fā)，并綜合考慮苦瓜籽油單層乳液平均粒徑、PDI和ζ-電位，選取均質(zhì)壓力600 bar，均質(zhì)5次，所制備的乳液粒徑為460±3 nm，PDI為0.073±0.004，ζ-電位為-22.3±0.8 mV。

圖2 均質(zhì)條件對苦瓜籽油單層乳液ζ-電位的影響Fig.2 Effect of homogeneous conditions on ζ-potential of BGSO primary emulsion

2.2.2 pH對苦瓜籽油單層乳液的影響 由圖3與圖4可知，苦瓜籽油單層乳液的粒徑、PDI和ζ-電位受pH的影響較大，當pH為4.6左右時，乳液ζ-電位為（-1.0±0.2 mV）趨向于 0 mV，粒徑增大，PDI增大，表明當乳液pH接近WPI等電點時，乳液間靜電排斥作用減小，乳滴易發(fā)生聚集，穩(wěn)定性降低[31]。當pH小于3.2時，PDI增大，乳液穩(wěn)定性降低，這可能是因為蛋白質(zhì)在酸性條件下易變性造成的。綜合考慮，在制備苦瓜籽油單層乳時，不調(diào)整pH，此時pH為7.0，乳液粒徑較小，粒徑分布較為均一，ζ-電位絕對值較大，乳液較為穩(wěn)定。這與林傳舟等[9]在用乳清蛋白制備亞麻籽油單層乳液時，選擇pH條件為7.0結(jié)果相似，pH遠離蛋白質(zhì)等電點，所得乳液較為穩(wěn)定。

圖3 pH對苦瓜籽油單層乳液的ζ-電位的影響Fig.3 Effect of pH on ζ-potential of BGSO primary emulsion

圖4 pH對苦瓜籽油單層乳液的平均粒徑和PDI的影響Fig.4 Effects of pH on mean diameter and polydispersity index of BGSO primary emulsion

2.3 苦瓜籽油雙層乳液的單因素實驗結(jié)果

2.3.1 AP濃度對苦瓜籽油雙層乳液的影響 制備多層乳液時，通常多糖的濃度必須經(jīng)過優(yōu)化，使油滴既能產(chǎn)生足夠強的空間排斥力和靜電排斥力，同時又不促進橋連或耗損絮凝[32]。在制備苦瓜籽油雙層乳液時，調(diào)整單層乳液pH為4.0，此時苦瓜籽油單層乳液帶正電。由圖5和圖6可知當AP濃度為3.5%（w/v）時，乳液粒徑最?。?40±47 nm），PDI最小（0.322±0.140），ζ-電位絕對值最大（-12.9±0.7 mV），表明乳滴間的靜電排斥力較強，乳液液滴不易相互聚集，此時乳液穩(wěn)定性最好。當AP濃度大于3.5%（w/v）時，由于陰離子高分子聚電解質(zhì)過剩，乳液中存在大量未吸附的果膠使得乳液發(fā)生損耗絮凝[33]，當AP濃度小于3.5%（w/v）時，由于陰離子高分子聚電解質(zhì)不足，導(dǎo)致兩個或多個帶正電的液滴共享陰離子果膠分子而引起橋連絮凝[20]。林傳舟等[9]在制備亞麻籽油雙層乳液時，乳液穩(wěn)定性隨著果膠濃度的逐漸增大，出現(xiàn)聚結(jié)-穩(wěn)定-絮凝現(xiàn)象，說明在制備雙層乳液時，果膠濃度過低，乳液易產(chǎn)生橋連絮凝，果膠濃度過高時，易產(chǎn)生損耗絮凝。所以，選擇果膠濃度為3.5%（w/v）進行下一步實驗。

圖5 AP濃度對苦瓜籽油雙層乳液的平均粒徑和PDI的影響Fig.5 Effects of AP concentration on mean diameter and polydispersity index of BGSO secondary emulsion

圖6 AP濃度對苦瓜籽油雙層乳液ζ-電位的影響Fig.6 Effect of AP concentration on ζ-potential of BGSO secondary emulsion

2.3.2 pH對苦瓜籽油雙層乳液的影響 采用靜電層層自組裝法制備乳液，油滴周圍通常會形成多層生物聚合物，多層生物聚合物主要是依賴聚電解質(zhì)相互之間的靜電吸引而形成的，因此pH會影響多層界面的形成、分解和穩(wěn)定乳液的能力[34]。由圖3可知，當pH＞5時，單層乳液液滴表面的WPI帶負電荷，AP溶液也帶負電荷，在這種情況下，兩種生物聚合物往往相互競爭油水界面，且彼此之間沒有很強的相互作用[35]。調(diào)節(jié)pH可通過改變生物聚合物的帶電荷性質(zhì)，從而改變兩種生物聚合物的競爭或者合作程度，從而可能導(dǎo)致均相（生物聚合物混合）或者非均相（生物聚合物分離）界面的形成[36]。由圖3可推測當pH為4.4時，單層乳液帶正電荷，由圖7和圖8可知，當pH為4.4時，苦瓜籽油雙層乳液粒徑較小，PDI較小，ζ-電位絕對值較大，推測這是由于pH變化，增加了帶正電的單層乳液與帶負電荷的果膠之間的靜電作用力。這可能是由于當pH遠離蛋白質(zhì)等電點時，蛋白質(zhì)的凈電荷和水溶性通常會增加，這可以增加帶電荷的多糖的靜電吸引或排斥[37]。但當pH小于4.4時，單層乳液ζ-電位增大，表明液滴表面所帶正電荷電荷密度增加，此時，AP不足以覆蓋單層乳液液滴，兩個或多個帶正電的液滴共享一個AP分子，此時乳液ζ-電位絕對值減小，易發(fā)生靜電中和效應(yīng)，形成橋連結(jié)構(gòu)從而產(chǎn)生聚集。因此，選擇pH為4.4為制備的苦瓜籽油雙層乳液pH條件，制得的雙層乳液粒徑為 670±9 nm，PDI為 0.258±0.020，ζ-電位為-19.6±0.9 mV。

圖7 pH對苦瓜籽油雙層乳液的平均粒徑和PDI的影響Fig.7 Effects of pH on mean diameter and polydispersity index of BGSO secondary emulsion

圖8 pH對苦瓜籽油雙層乳液ζ-電位的影響Fig.8 Effect of pH on ζ-potential of BGSO secondary emulsion

2.4 苦瓜籽油三層乳液制備的單因素實驗結(jié)果

2.4.1 CTS濃度對苦瓜籽油三層乳液的影響 殼寡糖是自然界唯一帶正電荷、陽離子堿性氨基低聚糖[38]，由圖9和圖10可知，當CTS濃度為1%（w/v）時，形成的苦瓜籽油三層乳液ζ-電位仍然為負值（-16.6±0.4 mV），推測此時CTS不足吸附在帶負電荷的二層乳液液滴上，維持乳液穩(wěn)定的靜電作用力較小，易產(chǎn)生橋連結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生聚集。隨著CTS濃度的增大，乳液粒徑和PDI呈上升趨勢，而ζ-電位值在CTS濃度為 4%（w/v）時為-1.8±0.5 mV，趨近 0 mV，表明此時乳液中靜電排斥力較弱。當CTS濃度大于4%（w/v）時，乳液ζ-電位仍然為負值，且乳液多分散系數(shù)趨近1，說明乳液粒徑分布不均，此時由于CTS濃度過大，CTS的加入增加了乳液體系的黏度，乳液液滴易產(chǎn)生聚集，使得乳液液滴分布不均。綜合平均粒徑、PDI和ζ-電位結(jié)果，選擇 CTS 濃度為 2%（w/v），進行下一步研究。

圖9 CTS濃度對苦瓜籽油三層乳液的平均粒徑和PDI的影響Fig.9 Effect of CTS concentration on mean diameter and polydispersity index of BGSO tertiary emulsion

圖10 CTS濃度對苦瓜籽油三層乳液的ζ-電位的影響Fig.10 Effect of CTS concentration on ζ-potential of BGSO tertiary emulsion

2.4.2 pH對苦瓜籽油三層乳液的影響 由圖11和圖12可知，苦瓜籽油三層乳液的ζ-電位隨pH的增大先增大再減小，在pH為3.8附近時，乳液的ζ-電位接近于0 mV，當pH小于3.8時，乳液的ζ-電位為正值，表明此時殼寡糖能吸附在果膠聚電解質(zhì)層上，當pH大于3.8時，乳液的ζ-電位為負值，這可能是由于pH增大，雙層乳液的聚電解質(zhì)層所帶電荷密度增加，使得CTS不能夠完全吸附在雙層乳液液滴上。當pH為2.2時制備的三層乳液平均粒徑比在pH為3.2條件下制備的三層乳液粒徑極顯著減?。≒＜0.01），ζ-電位極顯著增大（P＜0.01）。通過改變pH，直到CTS所帶的負電荷占主導(dǎo)地位，當pH為2.2時，乳液ζ-電位為16.3±0.3 mV，粒徑為1623±10 nm，PDI為0.480±0.034，說明此時CTS既能為乳液穩(wěn)定提供靜電排斥力，又能提供空間作用力使乳液體系更加穩(wěn)定[27]。所以選擇制備苦瓜籽油三層乳液的pH為2.2。

圖11 pH對苦瓜籽油三層乳液ζ-電位的影響Fig.11 Effect of pH on ζ-potential of BGSO tertiary emulsion

圖12 pH對苦瓜籽油三層乳液的平均粒徑和PDI的影響Fig.12 Effects of pH on mean diameter and polydispersity index of BGSO tertiary emulsion

2.5 苦瓜籽油多層乳液的表征

2.5.1 苦瓜籽油多層乳液的平均粒徑、PDI和ζ-電位 由圖13可知，苦瓜籽油和WPI溶液在pH為7條件下制備的單層乳液粒徑較小，在460 nm左右。將濃度為3.5%（w/v）的AP溶液加入到制備的單層乳液中，將pH調(diào)至4.4，此時，單層乳液液滴表面帶正電荷，帶負電荷的AP吸附到液滴表面，粒徑增大至680 nm左右，ζ-電位為負值。通過將濃度為2%（w/v）的CTS溶液加入到制備的雙層乳液中，pH調(diào)至2.2，制得三層乳液，由于CTS分子所帶的電荷為正，雙層乳液表面帶負電荷，通過靜電相互作用，CTS吸附到雙層乳液液滴表面，乳液粒徑進一步增大，ζ-電位由負值（-19.6±0.9 mV）轉(zhuǎn)變?yōu)檎担?0.3±0.5 mV），表明聚合電解質(zhì)已經(jīng)被吸附到液滴表面。

圖13 苦瓜籽油多層乳液的平均粒徑、PDI和ζ-電位Fig.13 Mean diameter, polydispersity index and ζ-potential of BGSO multilayer emulsion

2.5.2 苦瓜籽油多層乳液的微觀形態(tài) 采用靜電層層自組裝技術(shù)制備多層乳液時，需通過仔細控制聚電解質(zhì)的濃度和環(huán)境pH，改變不同界面層的結(jié)構(gòu)和性能，以確保其能夠快速和足夠吸附在油水界面，以確保幾乎沒有游離的聚電解質(zhì)在水相（這可能促進損耗絮凝），得到穩(wěn)定的多層穩(wěn)定劑[37]，從而使得乳液體系更加穩(wěn)定。在最優(yōu)條件下制備的苦瓜籽油多層乳液微觀形態(tài)結(jié)果如圖14所示，乳液粒徑較小，液滴較為分散，且無明顯聚集現(xiàn)象。

圖14 苦瓜籽油多層乳液的微觀形態(tài)（100×）Fig.14 Microscopic morphology of BGSO multilayer emulsion(100×）

2.5.3 苦瓜籽油多層乳液的流變性 由圖15可知，各層乳液的黏度和剪切速率成非線性關(guān)系，表明乳液為假塑性非牛頓流體[39]，隨著剪切速率的增加，乳液黏度明顯降低。水包油乳劑的流變性質(zhì)取決于如乳化劑和油相的種類、連續(xù)相與分散相的比例、粒徑及分布等諸多因素[40]。結(jié)果表明苦瓜籽油三層乳液黏度明顯高于單層、雙層乳液，這可能是由于CTS溶液的黏性使得乳液的黏度增大。雙層乳液和單層乳液的黏度隨剪切速率的變化趨勢基本相似，說明制備雙層乳液時，AP和WPI之間產(chǎn)生的正負電荷靜電吸引力起主導(dǎo)作用，從而提高界面層的機械強度，使液滴能避免液滴聚結(jié)[41]。

圖15 苦瓜籽油多層乳液的流變性Fig.15 Rheological property of BGSO multilayer emulsion

2.5.4 苦瓜籽油多層乳液的脂肪酸組成分析 由表2可知，苦瓜籽油中，硬脂酸和α-桐酸含量較高，其相對含量分別高達到33.574%和32.026%，與之前的研究結(jié)果具有一定差異[26,42]，可能是由于苦瓜品種和油脂提取方法不同所導(dǎo)致?？喙献延蛦螌尤橐号c苦瓜籽油相比，α-桐酸相對含量極顯著降低 （P＜0.01），這可能是由于高壓均質(zhì)過程中產(chǎn)熱使得α-桐酸氧化導(dǎo)致其含量降低。苦瓜籽油雙層乳液和三層乳液中的α-桐酸含量極顯著升高（P＜0.01），這可能是由于制備條件的不同導(dǎo)致苦瓜籽油中其他成分的損失，造成α-桐酸的相對含量升高?？喙献延透鲗尤橐旱膩営退?、CLN-B、CLN-C相對含量，與苦瓜籽油相比都極顯著降低（P＜0.01），這與廖一等[43]的研究結(jié)論相似，可能是由于在乳液制備過程中使用的儀器和制備方式使油脂受到剪切力和摩擦作用，使油脂發(fā)生氧化反應(yīng)。說明苦瓜籽油多層乳液的氧化穩(wěn)定性需進一步研究。

表2 苦瓜籽油多層乳液的脂肪酸組成Table 2 Fatty acid composition of BGSO multilayer emulsion

2.5.5 苦瓜籽油多層乳液的物理穩(wěn)定性分析 利用Turbiscan Lab穩(wěn)定分析儀對樣品進行穩(wěn)定性分析，可通過ΔBS的強度隨時間變化曲線，可快速、準確地反映出乳化體系的上浮、沉淀、聚集等動態(tài)變化，以及乳化體系的穩(wěn)定性情況[44]。利用Turbiscan Lab分析儀對新鮮制備的乳液進行掃描1 h，結(jié)果見圖16，左側(cè)背散射光強度減少，說明底部樣品濃度降低出現(xiàn)澄清層；右側(cè)背散射光強度增加，說明樣品頂部濃度增加，出現(xiàn)上浮層[44]，反映出苦瓜籽油單層乳液、雙層乳液和三層乳液的失穩(wěn)過程都主要是上浮。

圖16 苦瓜籽油多層乳液的背散射光（ΔBS）Fig.16 ΔBS of BGSO multilayer emulsion

TSI是用于估計乳化體系物理穩(wěn)定性的重要參數(shù)，可用于比較不同樣品的穩(wěn)定性差異[44]。由圖17可看出，在14 d內(nèi)苦瓜籽油雙層乳液和三層乳液的TSI值比苦瓜籽油單層乳液的TSI值小且上升速度慢。說明雙層乳液和三層乳液比單層乳液更加穩(wěn)定，這可能是由于大多數(shù)兩親性蛋白質(zhì)都是小分子，它們形成相對較薄的界面層（幾納米），因此它們只產(chǎn)生非常短的空間排斥力[45]，而多糖能夠增加油滴間的空間排斥力和靜電排斥力，所以在蛋白質(zhì)包裹的油滴中添加電荷相反的多糖能夠增強其對環(huán)境應(yīng)力的抵抗能力[46]。利用靜電層層自組裝技術(shù)，使AP和CTS通過靜電相互作用一層一層沉積在液滴表面，使乳滴產(chǎn)生較厚的聚合物層，為乳液提供更大的穩(wěn)定性[47]。所以苦瓜籽油雙層乳液和三層乳液物理穩(wěn)定性優(yōu)于單層乳液。

圖17 苦瓜籽油多層乳液的穩(wěn)定性指數(shù)（TSI）Fig.17 Turbiscan stability index （TSI） of BGSO multilayer emulsion

3 結(jié)論

本研究基于靜電層層自組裝技術(shù)，以苦瓜籽油為油相，用WPI、AP和CTS制備苦瓜籽油多層乳液，用粒徑電位對三種乳液進行表征，考察高壓均質(zhì)條件、聚電解質(zhì)濃度和環(huán)境pH對乳液性質(zhì)的影響，得到制備的苦瓜籽油多層乳液最佳參數(shù)如下：將苦瓜籽油和 WPI溶液（1% w/v）混合，pH7.0，經(jīng)10000 r/min剪切5 min后高壓均質(zhì)600 bar均質(zhì)5次即得苦瓜籽油單層乳液，單層乳液組成為5%（w/w）苦瓜籽油，0.95% （w/v）WPI；雙層乳液在單層乳的基礎(chǔ)上添加3.5%（w/v）AP溶液，使得雙層乳組成為4.5%（w/w）苦瓜籽油，0.86% （w/v） WPI，0.35% （w/v） AP，調(diào)節(jié)溶液pH至4.4，8000 r/min剪切1 min即得；三層乳液在雙層乳液的基礎(chǔ)上添加CTS溶液，使得三層乳液組成為 4% （w/w）苦瓜籽油，0.76% （w/v）WPI，0.31% （w/v）AP，0.22% （w/v）CTS，調(diào)節(jié) pH 至 2.2，8000 r/min剪切1 min即得?？喙献延透鲗尤橐壕哂休^小的粒徑，較好的分散性。乳液物理穩(wěn)定性結(jié)果表明，苦瓜籽油雙層乳液和三層乳液比單層乳液物理穩(wěn)定性更好。本研究為進一步研究苦瓜籽油多層乳液提供理論基礎(chǔ)，對更好發(fā)揮苦瓜籽油的功效價值具有參考意義。