曬青茶滅菌方法研究

安江珊，王利妍，劉琨毅,2，呂偉，李崇萍，李紅葉，趙明

1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 茶學(xué)院，云南 昆明 650201；2.宜賓職業(yè)技術(shù)學(xué)院 五糧液技術(shù)與食品工程學(xué)院，四川 宜賓 644003

0 引言

曬青茶指鮮葉經(jīng)殺青、揉捻后，采用日曬干燥制備的綠茶，一般用作云南普洱茶的原料[1]，其中，日曬干燥是曬青茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵[2-3]。由于日曬干燥過程環(huán)境開放、條件溫和，曬青茶易被微生物污染[4]，因此有必要開展曬青茶滅菌方法研究。

目前，食品工業(yè)中普遍應(yīng)用的滅菌技術(shù)包括輻照滅菌、紫外滅菌、微波滅菌、高壓蒸汽滅菌、巴氏消毒、臭氧滅菌等[5-9]。其中，輻照滅菌是利用γ射線、能量低于5 MeV的X射線或10 MeV以下電子束殺滅微生物的過程，主要應(yīng)用于醫(yī)療器械、食品、日用品、藥品等領(lǐng)域[10-11]。紫外滅菌是利用波長為240～280 nm的紫外線，破壞細(xì)菌病毒中的DNA(脫氧核糖核酸)或RNA(核糖核酸)的分子結(jié)構(gòu)，造成生長性細(xì)胞死亡和(或)再生性細(xì)胞死亡，達(dá)到殺菌消毒的目的。紫外滅菌具有無污染、高效率、廣譜性、低成本、長壽命等特點[12]。微波滅菌是指利用波長為0.1～1.0 m、頻率為300 MHz～300 GHz的電磁波進(jìn)行滅菌處理，廣泛應(yīng)用于肉制品、水產(chǎn)品、果蔬、罐頭、奶制品、農(nóng)作物、布丁、面包等產(chǎn)品[13]。高壓蒸汽滅菌指利用高溫使蛋白質(zhì)變性從而達(dá)到殺死微生物的目的，具有溫度高、穿透力強、滅菌速度快、效果可靠等優(yōu)點，是微生物實驗室首選的消毒滅菌方法[14]，廣泛應(yīng)用于藥品微生物實驗室培養(yǎng)基、實驗器具、陽性廢棄物的日常滅菌。巴氏消毒殺死的主要是食品中的病原菌，廣泛應(yīng)用于牛奶、飲料、啤酒等的滅菌，其滅菌溫度低，對滅菌物質(zhì)的品質(zhì)影響較小且成本較低[15]。因臭氧是一種特殊的消毒劑和強氧化劑，臭氧滅菌目前已被列入標(biāo)準(zhǔn)冷殺菌技術(shù)[16-17]，廣泛應(yīng)用于食品、水處理、醫(yī)療、化工、餐飲、貯藏等領(lǐng)域[18]。寧井銘等[19]分別采用紫外滅菌、熱風(fēng)滅菌、蒸汽滅菌和微波滅菌4種方法對普洱散茶進(jìn)行滅菌處理研究，結(jié)果表明，厚度為0.5 cm的散茶經(jīng)紫外滅菌50 s后，湯色、香氣、滋味等俱佳，且黑曲霉(Aspergillusniger)、青霉(Penicillumsp.)、根霉(Rhizopussp.)等霉菌仍能生存，這有利于普洱茶在存放過程中的進(jìn)一步陳化。王盛良等[20]對30份市售商品茶葉的霉菌污染現(xiàn)狀進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，微波輻照對霉菌具有明顯的殺滅效果，輻照滅菌8 min，霉菌的平均殺滅率達(dá)90%以上，是茶葉加工及防霉保鮮的一種方便有效的手段。目前，雖然部分學(xué)者針對茶葉中的微生物已開展了滅菌研究，但關(guān)于曬青茶滅菌方法的研究尚未見報道。

基于此，本文參考已有研究并結(jié)合實驗室條件，擬采用輻照滅菌、紫外滅菌、微波滅菌、高壓蒸汽滅菌、巴氏消毒及臭氧滅菌6種食品工業(yè)普遍應(yīng)用的滅菌方法處理曬青茶，然后進(jìn)行菌落總數(shù)計數(shù)，檢測徹底滅菌樣品的化學(xué)成分并進(jìn)行感官審評，以期尋找一種能夠殺滅曬青茶中微生物，并對茶葉成分和感官品質(zhì)影響較小的滅菌方法，為曬青茶中的微生物控制提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

曬青茶，生產(chǎn)于2017年，購買自云南省普洱茶樹良種場，采摘品種為云抗10#，加工標(biāo)準(zhǔn)為一芽二三葉。

酒石酸鉀鈉、FeSO4、Na2HPO3、KH2PO3、SnCl2、水合茚三酮、乙醇、谷氨酸、濃H2SO4等，均為分析純，天津大茂化學(xué)試劑廠產(chǎn)；甲醇、乙腈，均為色譜純，美國TEDIA試劑公司產(chǎn)；標(biāo)準(zhǔn)品兒茶素(C)、咖啡堿(CA)、表兒茶素(EC)、表沒食子兒茶素(EGC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、沒食子兒茶素(GC)、沒食子兒茶素沒食子酸(GCG)、兒茶素沒食子酸酯(CG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、沒食子酸(GA)、1，4，6-O-沒食子?；?β-D-葡萄糖(GG)、茶葉堿、花旗松素、蘆丁、鞣花酸、楊梅素、槲皮素、木犀草素、山奈酚，成都曼思特生物科技有限公司產(chǎn)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

756CRT型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司產(chǎn)；101A-2型電熱鼓風(fēng)恒溫干燥箱，上海市崇明實驗儀器廠產(chǎn)；HH-S28 S型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市大地自動化儀器廠產(chǎn)；1200型高速液相色譜系統(tǒng)，美國Agilent 公司產(chǎn)；SW-CJ-1FD型超凈工作臺，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)；HWS型智能恒溫恒濕箱，寧波東南儀器有限公司產(chǎn)；SK3200LH型超聲儀，上?？茖?dǎo)超聲儀儀器有限公司產(chǎn)；ZD-85A型氣浴恒溫振蕩器，金壇科析儀器有限公司產(chǎn)；A13204-N型電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司產(chǎn)；Smart-Q30型實驗室純水系統(tǒng)，上海和泰儀器有限公司產(chǎn)；DHG-9140型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海中友儀器設(shè)備有限公司產(chǎn)；LRHS-250-II型生化培養(yǎng)箱，上海躍進(jìn)器械有限公司產(chǎn)；HZ-GZJ型實驗型無菌灌裝機，上海輝展實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)；LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)；G70F23N1P-M3(S0)型微波爐，格蘭仕微波爐電器制造有限公司產(chǎn)。

1.3 實驗方法

1.3.1 曬青茶滅菌本研究分別采用輻照滅菌、紫外滅菌、微波滅菌、高壓蒸汽滅菌、巴氏消毒及臭氧滅菌6種滅菌方法處理曬青茶，具體方法如下。

1)輻照滅菌。將曬青茶裝入潔凈干燥的器具中，密封，送往云南華源核輻射技術(shù)有限公司處理，設(shè)置輻照劑量分別為5 kGy、7.5 kGy，滅菌處理后，茶樣放入無菌袋中備用，分別標(biāo)記為IR1、IR2。

2)紫外滅菌。對潔凈工作臺進(jìn)行消毒，放入潔凈白紙，將曬青茶放置在白紙上進(jìn)行紫外照射，設(shè)置時間分別為1 min、2 min和3 min，滅菌處理后，茶樣放入無菌袋中備用，分別標(biāo)記為UR1、UR2、UR3。

3)微波滅菌。先對微波爐消毒5 min，再將曬青茶放入微波爐中，設(shè)置時間梯度分別為1 min、2 min和3 min，滅菌處理后，茶樣放入無菌袋中備用，分別標(biāo)記為MR1、MR2、MR3。

4)高壓蒸汽滅菌。將曬青茶進(jìn)行121 ℃高壓蒸汽滅菌分別處理20 min和15 min，115 ℃高壓蒸汽滅菌處理20 min，滅菌處理后，茶樣放入無菌袋中備用，分別標(biāo)記為ST1、ST2、ST3。

5)巴氏消毒。將曬青茶放入干燥箱中，設(shè)置溫度梯度分別為60 ℃、65 ℃和70 ℃，時間為50 min，滅菌處理后，茶樣放入無菌袋中備用，分別標(biāo)記為PA1、PA2、PA3。

6)臭氧消毒。將曬青茶放入臭氧發(fā)生器(即無菌灌裝機)中分別處理10 min、20 min、30 min后，茶樣裝入無菌袋中備用，分別標(biāo)記為OR1、OR2、OR3。

對以上茶樣進(jìn)行微生物檢驗，以不滅菌的茶樣為對照(CK),篩選出檢驗合格的滅菌方法進(jìn)行成分測定和感官審評，從而確定最佳滅菌方法。

1.3.2 微生物培養(yǎng)及菌落總數(shù)測定根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數(shù)測定》(GB 4789.2—2016)[21]測定茶樣菌落總數(shù)。

1.3.3 曬青茶生化成分測定及感官審評按照《茶 水分測定》(GB/T 8304—2013)[22]，采用(103±2)℃條件下的恒重法測定茶樣水分；按照《茶 水浸出物測定》(GB/T 8305—2013)[23]，采用水浴加熱直接測定法測定茶樣水浸出物；采用酒石酸亞鐵比色法[24]測定茶葉茶多酚含量；按照《茶 游離氨基酸總量測定》(GB/T 8314—2013)[25]，采用茚三酮顯色法[26]測定游離氨基酸含量；采用蒽酮比色法測定茶葉可溶性糖含量；按照本實驗室建立的方法[27]，采用高效液相色譜法測定茶葉樣品C、CA、EC、EGC、EGCG、GC、GCG、CG、ECG、GA、GG等24種茶葉化學(xué)成分含量；按照《茶葉感官審評方法》(GB/T 23776—2018)[28]，進(jìn)行感官審評。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌方法對曬青茶微生物的影響

不同滅菌方法處理的曬青茶中菌落總數(shù)見表1。由表1可知，與對照樣(CK)相比，紫外滅菌、微波滅菌、巴氏消毒、臭氧滅菌均能殺滅部分微生物，而輻照滅菌和高壓蒸汽滅菌能完全殺滅微生物。因此，選擇輻照滅菌和高壓蒸汽滅菌兩種滅菌方法進(jìn)行后續(xù)實驗。

表1 不同滅菌方法處理的曬青茶中菌落總數(shù)Table 1 The total number of colony forming units in sun-dried green tea sterilized by various methods

2.2 不同滅菌方法對曬青茶化學(xué)成分的影響

茶樣化學(xué)成分含量比較如圖1所示，不同肩標(biāo)小寫字母表示同一種化學(xué)成分檢測含量之間具有顯著性差異(P<0.05)。由圖1可知，與CK相比，輻照滅菌后的可溶性糖含量顯著升高(P<0.05)，C、花旗松素、蘆丁、木犀草素含量均顯著降低(P<0.05)；高壓蒸汽滅菌后的氨基酸、可溶性糖、C、EGC、蘆丁、槲皮素含量均顯著降低(P<0.05)，CA、GCG、GA、茶葉堿、鞣花酸、山奈酚含量均顯著升高(P<0.05)；另外，ST1的EC、ECG、GG、可可堿含量均顯著降低(P<0.05)，花旗松素、木犀草素均顯著升高(P<0.05)；ST2的EC、GC、CG、ECG、GG含量均顯著降低(P<0.05)；ST3的水浸出物、可可堿含量均顯著降低(P<0.05)，花旗松素顯著升高(P<0.05)。聚類分析發(fā)現(xiàn)，CK與IR2聚成一個分支，表明二者之間的化學(xué)成分最相似，即7.5 kGy輻照滅菌對茶葉化學(xué)成分影響最小。

圖1 茶樣化學(xué)成分含量比較Fig.1 Comparison of levels of chemical components in tea samples

2.3 不同滅菌方法對曬青茶感官品質(zhì)的影響

茶樣感官審評照片及結(jié)果分別如圖2和表2所示。由圖2和表2可知，輻照處理茶樣的外形、香氣和葉底與CK相比，變化較?。欢邏赫羝麥缇铇拥纳珴捎珊贮S轉(zhuǎn)向烏褐、黃片增加，湯色由黃濃轉(zhuǎn)向橙黃，滋味由濃烈變?yōu)槠胶?，且ST1、ST2帶有酸味，葉底色澤由黃綠轉(zhuǎn)向褐黃。經(jīng)感官審評發(fā)現(xiàn)，7.5 kGy輻照滅菌處理對茶樣IR2的感官品質(zhì)影響最小，這與生化成分測定結(jié)果相符。范偉橋等[29]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)輻照劑量在一定范圍內(nèi)(0～6 kGy)時，茶葉中主要成分含量隨輻照劑量的增加而增加，對香氣成分含量的影響不大。另外，本研究結(jié)果與彭玲等[30]通過適宜劑量輻照處理紅碎茶，既確保紅碎茶中霉菌數(shù)低于103CFU/g，又不影響紅碎茶商品品質(zhì)的結(jié)論是一致的。綜上所述，曬青茶的最佳滅菌方法為7.5 kGy輻照滅菌。

圖2 茶樣感官審評照片F(xiàn)ig.2 Photograph for sensory evaluation of tea samples

表2 茶樣感官審評結(jié)果Table 2 Results of sensory evaluation of tea samples

3 結(jié)論

本文分別采用輻照滅菌、紫外滅菌、微波滅菌、高壓蒸汽滅菌、巴氏消毒、臭氧滅菌6種滅菌方法處理曬青茶，發(fā)現(xiàn)輻照滅菌和高壓蒸汽滅菌均能將曬青茶中的微生物徹底殺滅；7.5 kGy輻照滅菌對茶葉生化成分影響最小，其中只有可溶性糖含量顯著升高(P<0.05)，C、花旗松素、蘆丁、木犀草素含量均顯著降低(P<0.05)；感官審評結(jié)果也證實，7.5 kGy輻照滅菌對曬青茶感官品質(zhì)影響最小。本研究結(jié)果可為控制曬青茶的微生物污染，降低安全風(fēng)險，以及提高后續(xù)發(fā)酵曬青茶原料的一致性提供參考。