雞傳染性喉氣管炎實(shí)驗(yàn)室診斷與序列分析

王文彬，伏春燕，閻佩佩，石天虹，李霞，魏祥法，劉瑞亭，董以雷，劉雪蘭

摘 要：從山東省東營(yíng)市某養(yǎng)雞企業(yè)采集具有呼吸道癥狀及產(chǎn)蛋障礙的蛋雞組織共8份，經(jīng)病史與免疫程序調(diào)查、病雞的臨床癥狀與組織病理變化，初步懷疑是傳染性喉氣管炎、傳染性支氣管炎或低致病性禽流感病毒感染。通過病毒血凝試驗(yàn)排除了低致病性禽流感病毒;通過PCR方法確定為傳染性喉氣管炎病毒感染;最終對(duì)擴(kuò)增的病毒gD基因與TK基因進(jìn)行測(cè)序并與BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)該病毒與疫苗毒株同源性高達(dá)99%。以上結(jié)果表明，傳染性支氣管炎疾病的免疫接種仍然重要。

關(guān)鍵詞：傳染性喉氣管炎;實(shí)驗(yàn)室診斷;PCR;序列分析

中圖分類號(hào)：S816.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B文章編號(hào)：1673-1085（2022）01-0006-06

傳染性喉氣管炎（infectious laryngotracheitis， ILT）是由傳染性喉氣管炎類病毒（infectious laryngotracheitis virus， ILTV）引起的雞的一種急性、高度接觸性呼吸道傳染病。該病主要侵害雞喉頭和氣管的上皮細(xì)胞，同時(shí)也對(duì)鼻竇、氣囊和肺等組織產(chǎn)生影響，其特征為呼吸困難、咳嗽，喉和氣管黏膜腫脹、出血并形成糜爛[1]。我國(guó)于20世紀(jì)50年代末期首次發(fā)生該病，90年代后該病在我國(guó)一些地區(qū)呈地方性流行，常引起病雞死亡和產(chǎn)蛋下降，導(dǎo)致嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，給我國(guó)養(yǎng)雞業(yè)造成巨大危害[2]。2021年5月，山東東營(yíng)某養(yǎng)雞場(chǎng)海蘭褐蛋雞在15～20日齡時(shí)出現(xiàn)過一過性的呼吸道癥狀，剖檢發(fā)現(xiàn)腎臟腫大，但未引起重視;在80日齡開始發(fā)現(xiàn)雞群5%左右出現(xiàn)龍骨彎曲;直至影響雞群的產(chǎn)蛋率。本研究采集具有典型病理變化的病雞組織進(jìn)行ILT、傳染性支氣管炎（IB）及低致病性禽流感H9N2的PCR鑒別檢測(cè)、測(cè)序分析，最終確定感染病原為ILTV。

1 材料與方法

1.1 病料與試驗(yàn)動(dòng)物

病料來(lái)自于山東東營(yíng)某養(yǎng)雞場(chǎng)病雞的喉頭、氣管、輸卵管和肺組織;9～11日齡SPF雞胚購(gòu)自山東昊泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司。

1.2 主要試劑和引物

Simple P病毒DNA/RNA共提取試劑盒，購(gòu)自杭州博日科技股份有限公司;質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，購(gòu)自O(shè)MEGA公司;2×Taq預(yù)混 PCR反應(yīng)體系（含染料）、StarScript II cDNA第一鏈合成試劑盒-II、Direct-load StarMarker D2000 Plus，購(gòu)自康潤(rùn)生物;T4 DNA Ligase與19T simple

vector，購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。根據(jù)參考文獻(xiàn)，由青島擎科生物有限公司合成擴(kuò)增ILTV gD[3]、ILTV TK[4]、IBV M[5]、IBV N[5]、H9N2 NP基因的引物，詳細(xì)引物序列見表1。

1.3 病料處理

在無(wú)菌條件下，剖檢觀察各組織病理變化，采集病雞的喉頭、氣管、輸卵管和肺組織，共8份，稱取適量以上組織與無(wú)菌PBS按照M/V=1：1混勻，用組織研磨儀進(jìn)行勻漿，反復(fù)凍融3次，6000 rpm/min離心10 min，取上清，置-80 ℃冰箱備用。

1.4 病毒血凝試驗(yàn)

將1.3處理的病料上清進(jìn)行10倍稀釋，原液與稀釋液經(jīng)雞胚尿囊膜途徑接種9～11日齡SPF雞胚各5枚，100 μL/胚，設(shè)立PBS對(duì)照，置于37 ℃孵育5 d，每天觀察雞胚死亡情況，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，5 d后在無(wú)菌條件下取出尿囊液，按照常規(guī)血凝試驗(yàn)（HA）操作方法測(cè)定雞紅細(xì)胞的凝集價(jià)。以新城疫病毒疫苗株La Sota作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS為陰性對(duì)照。

1.5 病料基因組提取與PCR鑒定

按照試劑盒說明書提取病料上清中的DNA/RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)表1中引物進(jìn)行PCR鑒定。PCR反應(yīng)體系為2×Taq 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，模板（DNA或cDNA）2 μL，ddH2O至終體積20 μL。PCR擴(kuò)增條件為94 ℃ 2 min;94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 80 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 5 min。每組引物設(shè)ddH2O為陰性對(duì)照。1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

1.6 PCR產(chǎn)物回收與序列分析

按照膠回收試劑盒說明書回收陽(yáng)性PCR產(chǎn)物，然后送往青島擎科生物有限公司進(jìn)行測(cè)序。利用BLAST軟件分析得到序列與已有毒株序列的同源性及突變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病情況與臨床癥狀

海蘭褐蛋雞在80日齡開始出現(xiàn)龍骨彎曲，占5%左右。165日齡時(shí)產(chǎn)蛋率下降，軟殼蛋和砂殼蛋多，偶見畸形蛋;糞便不成型，腹瀉;吐水，嘔吐物沒有異味，嗉囊解剖沒發(fā)現(xiàn)霉菌癥狀;羽毛尤其是主翼羽有分叉，毛囊沒有變化。免疫程序中缺乏ILT的免疫。其他飼養(yǎng)條件均正常。

2.2 剖檢觀察

瀕臨死亡的病雞鼻腔內(nèi)有大量的黏液（圖1A），堵塞呼吸通道。病雞存在腹瀉癥狀，可觀察到肛門處有糞便粘連（圖1B）。對(duì)病雞進(jìn)行剖檢，發(fā)現(xiàn)龍骨明顯彎曲（圖1C）;喉頭與氣管出血明顯（圖1D），同時(shí)伴有大量黏液滲出;輸卵管的蛋殼腺部（子宮部）內(nèi)出現(xiàn)大量白色沉積物（圖1E）。其他組織沒有明顯病理變化。結(jié)合臨床癥狀，我們推測(cè)病雞可能感染了ILTV、IBV或低致病性禽流感病毒。

2.3 病毒血凝試驗(yàn)

病料原液及10倍稀釋液接種雞胚后，雞胚均沒有死亡;胚體發(fā)育良好，雞胚尿囊液對(duì)雞紅細(xì)胞均無(wú)血凝性（圖2）。此結(jié)果表明病雞可能沒有感染新城疫病毒、禽流感病毒。

2.4 分子鑒定

分別擴(kuò)增疑似病毒ILTV、IBV、H9N2的相關(guān)基因，電泳結(jié)果顯示，只有ILT擴(kuò)增成功，其中g(shù)D基因長(zhǎng)度為1 134 bp，TK基因長(zhǎng)度為400 bp（圖3）。利用NCBI的BLAST軟件對(duì)測(cè)序后的gD、TK的核苷酸與氨基酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)，結(jié)果顯示兩個(gè)基因核苷酸與氨基酸序列與已有的基因序列同源性高達(dá)99%以上（圖4）。結(jié)合臨床癥狀與病理變化結(jié)果，可以確定導(dǎo)致該養(yǎng)殖場(chǎng)雞死亡的病原為ILTV。

3 討論與結(jié)論

在我國(guó)，ILT屬于二類動(dòng)物傳染性疫病，是對(duì)養(yǎng)雞業(yè)危害較大的傳染病之一[6]。目前，ILT的發(fā)生主要以散發(fā)為主，且該病除表現(xiàn)出典型的呼吸道癥狀外，蛋雞還伴隨有產(chǎn)蛋率迅速下降、蛋品質(zhì)降低等癥狀，這給臨床鑒別診斷帶來(lái)難度。臨床生產(chǎn)中，該病與IB極其相似。兩者均具有傳染性，病雞均表現(xiàn)出咳嗽、鼻腔分泌物增多、呼吸困難，且蛋雞感染后均會(huì)出現(xiàn)產(chǎn)蛋率下降等產(chǎn)蛋障礙。兩者的區(qū)別在于ILT剖檢病變主要集中在喉、氣管黏膜充血和出血，而IB除有氣管支氣管水腫外，肝臟呈土黃色，輕度腫大，腎小管和輸尿管沉積大量的尿酸鹽，形成“花斑腎”[2]。因ILT與IB的病原不同，因此可以直接通過PCR技術(shù)進(jìn)行快速實(shí)驗(yàn)室診斷。近期大量臨床報(bào)告發(fā)現(xiàn)，蛋雞感染低致病性禽流感H9N2也會(huì)表現(xiàn)出產(chǎn)蛋率下降等生殖系統(tǒng)障礙[1]，因此，本研究也將其作為檢測(cè)病原之一。

本養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生疫病后，立即對(duì)病雞進(jìn)行無(wú)害化處理。經(jīng)過本實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)后確定是ILTV感染，其gD基因與TK基因序列與疫苗毒株同源性高達(dá)99%以上，懷疑是免疫接種不及時(shí)所致。立即指導(dǎo)養(yǎng)殖人員對(duì)健康雞群進(jìn)行相應(yīng)滅活疫苗的接種。經(jīng)跟蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，疫苗接種后一周，發(fā)病雞數(shù)量明顯減少;2周后產(chǎn)蛋率逐漸恢復(fù)。

防控ILT應(yīng)當(dāng)采取綜合防治措施：首先，要強(qiáng)化防疫衛(wèi)生工作，人員設(shè)施嚴(yán)格消毒，保持飼養(yǎng)環(huán)境清潔;其次，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，減小飼養(yǎng)密度，重視保溫、通風(fēng);最重要的是要重視免疫預(yù)防，控制ILT的最有效方法是疫苗免疫[7]。而本研究中的養(yǎng)殖場(chǎng)因之前從未發(fā)生過ILT，從育雛到成年雞就沒有免疫過ILT疫苗，最終造成該病毒有機(jī)可乘;四是一旦發(fā)生疫病，應(yīng)當(dāng)做好隔離、撲殺及無(wú)害化處理工作[8]。

該案例提醒養(yǎng)殖人員不能掉以輕心，也不能漏掉對(duì)任何疫病的免疫接種與防護(hù)。

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Laboratory Diagnosis and Sequence Analysis of Infectious Laryngotracheitis Virus

WANG Wenbin，F(xiàn)U Chunyan，YAN Peipei，SHI Tianhong，LI Xia，WEIXiangfa，

LIU Ruiting，DONG Yilei，LIU Xuelan

（Poultry Institute， Shandong Academy of Agricultural Science， Jinan? 250100，China）

Abstract： A total of 8 samples of layers with respiratory symptoms and egg production disorders were collected from a chicken enterprise in Dongying city， Shandong Province. We suspected that the chickens were infected with infectious laryngotracheitis virus， infectious bronchitis virus or low pathogenic avian influenza virus via the clinical symptoms and histopathological changes. Low pathogenic avian influenza virus was excluded by virus hemagglutination test. It was identified as infectious bronchitis virus infection by PCR test. Sequencing and BLAST analysis showed that gD and TK genes had 99% homology with the vaccine strain. These results indicate that immunization against infectious bronchitis is still important.

Keywords： Infectious Laryngotracheitis; laboratory diagnosis; PCR; sequence analysis