高產(chǎn)四甲基吡嗪芽孢桿菌的篩選及在清香型原酒生產(chǎn)中的應(yīng)用研究

馬美榮，周林艷，王德斌，劉小改，王小偉，艾金忠，張 坤

（北京紅星股份有限公司，北京101400）

四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TTMP），又名川芎嗪，天然存在于大豆食品、咖啡、乳制品中，具有一種特別的香味，在食品工業(yè)中廣泛用作調(diào)味劑、香味劑?，F(xiàn)代科學(xué)證明其具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)及抑制血小板集聚等作用，在臨床上對于治療缺血性心腦血管疾病及慢性心衰、腎衰等具有良好的療效[1-2]。

白酒中四甲基吡嗪在制曲、堆積發(fā)酵等過程均會在不同程度上有所產(chǎn)生，并通過蒸餾工序進(jìn)入白酒中，在中國主要白酒種類中有很高的含量，是一種對人體健康有益的風(fēng)味物質(zhì)[2]。當(dāng)前學(xué)術(shù)界認(rèn)為四甲基吡嗪的產(chǎn)生方式有兩種：第一種是通過糖和氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)[3]；第二種則是通過微生物合成，主要分為兩步：①芽孢桿菌利用底物合成四甲基吡嗪的前體3-羥基丁酮；②3-羥基丁酮與氨反應(yīng)生成四甲基吡嗪[4]。近年來，我國許多名優(yōu)企業(yè)為提高白酒中四甲基吡嗪含量，開展了利用微生物產(chǎn)生四甲基吡嗪的研究[5-8]。

我國醬香型、芝麻香型白酒中四甲基吡嗪含量較高，而清香型白酒中的含量較低，紅星二鍋頭白酒作為清香型白酒的重要代表，也是京味文化的典型代表之一，為了提升紅星二鍋頭酒產(chǎn)品的品質(zhì)，增加紅星白酒健康因子含量，我們選育高產(chǎn)四甲基吡嗪功能微生物，為進(jìn)一步生產(chǎn)應(yīng)用奠定良好的菌種基礎(chǔ)。篩選的菌種應(yīng)用于二鍋頭白酒發(fā)酵，極大提升了原酒中四甲基吡嗪的含量，改善了原酒口感。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

大曲：北京紅星股份有限公司和某廠提供。

試劑：四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)樣，迪馬公司；脫脂奶粉，市售；葡萄糖、牛肉膏、硫酸銨等化學(xué)試劑，購自化學(xué)試劑公司。

細(xì)菌平板培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.3%，氯化鈉0.5%，瓊脂2%，121℃滅菌20 min。

脫脂奶粉平板培養(yǎng)基：脫脂奶粉8%，葡萄糖0.1%，磷酸二氫鉀0.05%，氯化鈉0.05%，瓊脂粉2%，121℃滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖2.5%，蛋白胨1.5%，酵母膏0.5%，硫酸銨1%，磷酸二氫鉀0.02%，121℃滅菌20 min。

儀器設(shè)備：氣相色譜儀(HP6890)，配有NPD檢測器，安捷倫公司；顯微鏡(BX51)，奧林巴斯公司；電子天平(LA230S)，賽多利斯公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 大曲中芽孢桿菌的分離純化

取大曲2 g，加入裝有50 mL無菌水的小三角瓶中，富集1 d后，用水浴加熱方法加熱至80～90 ℃或煮沸保持20 min，冷卻，稀釋至10-3、10-4、10-5不同的濃度后，涂布平板，同時做平行樣，35～37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨時觀察其生長情況，將形態(tài)不同的單菌落挑出，重新劃線接至固體平板上，35～37℃下培養(yǎng)2 d，多次重復(fù)，直至分離純化得到單菌落，再進(jìn)行鏡檢，確認(rèn)得到的微生物為不同的菌種且都為純種。采用將得到的純種菌株分別轉(zhuǎn)接于裝有10 mL無菌水的試管中，按照其分離時采用的加熱溫度及加熱時間加熱，后逐級稀釋，選擇 10-3、10-4、10-5稀釋濃度涂布平板；同時做平行樣，于35～37℃下恒溫培養(yǎng)2 d。觀察加熱過的菌種是否能重新長出，如能順利長出，則說明其為分離得到的芽孢類細(xì)菌；相反其未能長出，說明其是非預(yù)期的雜菌，棄掉。將分離到的目的菌種編號冷藏。

1.2.2 菌種初篩

將菌種點(diǎn)接在制作好的脫脂奶粉平板上，每皿可點(diǎn)接3～4個菌株，35～37℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落周圍培養(yǎng)基是否已被分解而呈透明。比較每個菌種在平皿中形成的透明圈的大小及菌落大小，以判斷其蛋白酶酶解能力的大小。

1.2.3 菌種復(fù)篩

將純化的菌種接至蛋白胨牛肉膏液體培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)24 h，然后以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)120 h；取100 mL發(fā)酵液加入50 mL 95%vol的食用酒精，蒸餾得到100 mL蒸餾液，然后用氣相色譜儀測定蒸餾液中四甲基吡嗪的含量。

1.2.4 四甲基吡嗪含量的測定

檢測器為NPD檢測器。

色譜柱條件：DM-FFAP（30 m×0.32 mm×1 μm）；分流比：10:1；進(jìn)樣器：230 ℃；檢測器：310 ℃；程序升溫：初始70℃，以10℃/min升溫至230℃，保持10 min。

1.2.5 菌株的分子鑒定

利用16S rDNA法對目的菌株進(jìn)行分子鑒定。通過測定DNA序列得出同源性，當(dāng)16S rDNA序列同源性高于97%時，可以認(rèn)為是屬內(nèi)的同種。

1.2.6 菌株的生產(chǎn)應(yīng)用

目標(biāo)試驗菌株的生產(chǎn)應(yīng)用按圖1流程進(jìn)行。

在攤晾后加曲的同時，加入培養(yǎng)好的功能菌麩曲，并加入5%～8%高溫大曲，拌勻后進(jìn)行堆積發(fā)酵，收堆溫度30℃，使酒醅溫度達(dá)到48℃以上，低于55℃時，堆積24～48 h后入缸發(fā)酵，入缸溫度控制在30℃，功能菌麩曲加入量為4.0%。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的分離純化

根據(jù)芽孢桿菌耐熱耐高溫的特點(diǎn)，大曲富集培養(yǎng)后對培養(yǎng)液高溫加熱，從中分離篩選芽孢桿菌，結(jié)果見表1。因為不同的菌種耐熱能力不同，采用不同的加熱溫度分離芽孢桿菌。從表1可以看出，80～90℃分離得到的芽孢桿菌多；不同廠家大曲的芽孢桿菌種類差別也較大。

圖1 試驗生產(chǎn)流程圖

表1 芽孢桿菌分離結(jié)果

2.2 菌種初篩

將分離到的芽孢桿菌點(diǎn)接到脫脂奶粉平板上，觀察各菌的透明圈大小及菌落大小，測量透明圈的直徑與菌落直徑，并記錄各自的R值，詳見表2。

表2 分離菌的R值

菌株B-2、B-6、B-7、B-9透明圈菌落直徑比R比較大，說明這些菌株分泌蛋白酶并分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生氨基酸的能力較強(qiáng)，可選為復(fù)篩的菌株。

2.3 菌種復(fù)篩

利用氣相色譜法對發(fā)酵液中的四甲基吡嗪含量進(jìn)行測定，標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖及樣品的色譜圖分別見圖2和圖3，從圖3可以看出，在選定的色譜條件下，四甲基吡嗪與其他物質(zhì)分離良好，該方法可用于檢測發(fā)酵液中的四甲基吡嗪。

圖2 四甲基吡嗪標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

圖3 樣品色譜圖

將初篩得到的較優(yōu)菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，發(fā)酵液四甲基吡嗪含量的結(jié)果見圖4。從圖4可知，所篩選的4株菌具有較高的四甲基吡嗪產(chǎn)量，其中B-2的產(chǎn)量最高，可達(dá)21.39 mg/L。結(jié)果表明，通過考察菌株蛋白酶活性對菌株進(jìn)行初篩是可行的。

2.4 菌種分子鑒定

將4株高產(chǎn)TTMP的芽孢桿菌進(jìn)行16S rDNA序列測定，進(jìn)行序列同源性分析，確定B-2、B-9為枯草芽孢桿菌屬（Bacillus subtilis），B-6、B-7為地衣芽孢桿菌屬（Bacillus licheniformis）。

2.5 生產(chǎn)應(yīng)用

選擇B-2和B-7菌分別制作麩曲，用于大曲酒堆積發(fā)酵，從結(jié)果來看，在基酒風(fēng)格基本不變的基礎(chǔ)上，酒體中四甲基吡嗪含量有極大的提高。從感官品嘗來看，試驗酒樣除具有大曲酒清香純正、入口綿甜、香味協(xié)調(diào)的特點(diǎn)外，增加了原酒的綿柔度，提升了原酒的成熟度。大曲樣品酒色譜分析結(jié)果見表3。

表3 大曲樣品酒色譜分析結(jié)果 (mg/L)

圖4 不同菌株四甲基吡嗪產(chǎn)量

3 結(jié)論

從大曲中分離篩選到具有高產(chǎn)四甲基吡嗪活性的芽孢桿菌，高產(chǎn)菌株應(yīng)用于公司原酒生產(chǎn)，極大提高了原酒中四甲基吡嗪的含量。四甲基吡嗪含量高的調(diào)味酒應(yīng)用于紅星二鍋頭新產(chǎn)品的研發(fā)中，完善了紅星二鍋頭酒產(chǎn)品的風(fēng)格特點(diǎn)，使之清香純正、馥郁幽雅，酒體豐滿綿柔，圓潤爽凈，回味綿長，提升了紅星二鍋頭白酒的品質(zhì)。該研究提升了紅星公司的核心競爭力。

功能菌的添加比例、菌種組合及組合比例等對酒體中四甲基吡嗪含量影響、對酒體的影響研究還不夠深入，今后要加大研究力度，確定更合適的應(yīng)用方案。