纖維小體在合成生物學(xué)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

馮銀剛，劉亞君，崔球

（1 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所，中國(guó)科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東省合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266101； 2 中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所，山東省單細(xì)胞油脂工程實(shí)驗(yàn)室，青島市單細(xì)胞油脂工程實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266101； 3 中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京100049）

合成生物學(xué)的一個(gè)基本思想是通過(guò)功能元件及操作步驟的模塊化和標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)現(xiàn)功能的高效組合和通量化。自然界中，許多分子機(jī)器都在不同程度上符合合成生物學(xué)模塊化和標(biāo)準(zhǔn)化的要求，因而在合成生物學(xué)中具有巨大的應(yīng)用價(jià)值和潛力，其中纖維小體（cellulosome）可能是自然界中最符合合成生物學(xué)策略的分子機(jī)器之一。纖維小體是一類由降解纖維素的微生物分泌的多酶復(fù)合體，目前已知的產(chǎn)纖維小體微生物主要是梭菌綱的一些厭氧細(xì)菌。纖維小體的種類復(fù)雜多樣，不同物種產(chǎn)生的纖維小體其大小、架構(gòu)、酶的種類千差萬(wàn)別，反映了不同微生物適應(yīng)復(fù)雜生長(zhǎng)環(huán)境的進(jìn)化多樣性。由于具有模塊化、多樣化、自組裝、協(xié)同高效以及底物自適應(yīng)等特點(diǎn)，纖維小體自被發(fā)現(xiàn)以來(lái)在生物技術(shù)中得到了廣泛的應(yīng)用，被稱為“生物技術(shù)的寶庫(kù)”［1-3］。纖維小體的模塊化自組裝特性尤其符合合成生物學(xué)對(duì)元件模塊化、標(biāo)準(zhǔn)化的要求，隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，纖維小體在合成生物技術(shù)中也受到越來(lái)越多的關(guān)注。

纖維小體的發(fā)現(xiàn)至今已有近40 年的歷史。20 世紀(jì)80 年代初，科學(xué)家在研究一種可高效降解纖維素的細(xì)菌--熱纖梭菌時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一些可結(jié)合于纖維素上的蛋白質(zhì)［4-5］。這些蛋白質(zhì)最初被命名為纖維素結(jié)合因子，后來(lái)發(fā)現(xiàn)它們是一種蛋白質(zhì)復(fù)合體的組分，于是將這個(gè)蛋白質(zhì)復(fù)合體命名為纖維小體［6-7］。經(jīng)過(guò)20 世紀(jì)80 年代到90 年代初10 年左右的研究，人們已經(jīng)明確纖維小體是由具有不同催化活性的多種酶亞基組裝在無(wú)催化活性的腳架蛋白（scaffoldin）亞基上所形成的復(fù)合體［8］。隨著分子克隆技術(shù)的成熟，許多纖維小體組分的基因序列被測(cè)定，到90 年代末，人們借助于結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究的進(jìn)展，對(duì)纖維小體的架構(gòu)已經(jīng)有了比較清晰的認(rèn)識(shí)［9］。在2000-2010 年間，通過(guò)對(duì)熱纖梭菌和多種產(chǎn)纖維小體細(xì)菌的基因組測(cè)序和序列分析，發(fā)現(xiàn)了數(shù)目巨大的纖維小體組分，使人們對(duì)纖維小體的高度復(fù)雜性及多樣性有了進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)［10-11］。同時(shí)，不同來(lái)源的纖維小體的組裝模塊復(fù)合體結(jié)構(gòu)被逐步解析，對(duì)纖維小體結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)程度提升到了原子水平［12］。在最近的10年間，隨著復(fù)雜纖維小體調(diào)控因子σI/anti-σI和簡(jiǎn)單纖維小體轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，人們對(duì)纖維小體合成的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制的研究也逐步深入到分子層面［13-15］。伴隨著理論與機(jī)制研究的逐步深入，纖維小體的應(yīng)用價(jià)值被逐步發(fā)掘和拓展，滲透延伸到包括合成生物技術(shù)在內(nèi)的各種生物技術(shù)應(yīng)用中。

早在90 年代初，基于纖維小體架構(gòu)帶來(lái)的啟示，研究者就提出了人工纖維小體（designer cellulosome）的概念，這一概念在隨后的合成生物學(xué)研究中得到了大量應(yīng)用。人工纖維小體也逐步擴(kuò)展和演化出仿纖維小體（artificial cellulosome）、電子小體（electrosome）等概念，并應(yīng)用于木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化、生物燃料生產(chǎn)、合成代謝通路、表面展示、酶固定化、生物傳感器開(kāi)發(fā)以及生物燃料電池構(gòu)建等諸多領(lǐng)域。本文將在簡(jiǎn)單介紹纖維小體的架構(gòu)和功能機(jī)制的基礎(chǔ)上，總結(jié)近年來(lái)纖維小體在合成生物學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)展，并對(duì)未來(lái)纖維小體的研究及其在合成生物學(xué)中的應(yīng)用進(jìn)行展望。

1 纖維小體的架構(gòu)與功能機(jī)制

纖維小體包含由多種類型的酶類（主要是糖苷水解酶）組成的催化亞基，以及主要起組裝作用的非催化亞基。非催化亞基起到了類似于建筑中腳手架的作用， 因此被稱為腳架蛋白（scaffoldin，也譯為腳手架蛋白或支架蛋白）。這些纖維小體亞基由多種模塊（即結(jié)構(gòu)域）構(gòu)成，可以大致分為催化模塊、組裝模塊、底物結(jié)合模塊以及細(xì)胞結(jié)合模塊4類。通常情況下，腳架蛋白由多個(gè)被稱為粘連模塊（cohesin）的組裝模塊串聯(lián)而成，催化亞基則是由催化模塊和一個(gè)被稱為對(duì)接模塊（dockerin）的組裝模塊串聯(lián)而成。粘連模塊和對(duì)接模塊之間通過(guò)非常強(qiáng)的非共價(jià)相互作用將多個(gè)酶亞基組裝到腳架蛋白上，其相互作用的KA可以達(dá)到109～1012L/mol，是自然界中最強(qiáng)的蛋白-蛋白相互作用之一［16-17］。底物結(jié)合模塊通常為碳水化合物結(jié)合模塊（carbohydrate-binding module，CBM），能夠幫助纖維小體緊密結(jié)合在木質(zhì)纖維素底物上。CBM 可以位于腳架蛋白上與粘連模塊串聯(lián)，也可以位于一些催化亞基上與催化模塊串聯(lián)。細(xì)胞結(jié)合模塊是可以結(jié)合在細(xì)胞壁上的結(jié)構(gòu)域，通常為S 層同源物模塊（S-layer homology，SLH），位于部分二級(jí)腳架蛋白上，這些腳架蛋白也被稱為錨定腳架蛋白 （anchoring scaffoldin）。細(xì)胞通過(guò)在腳架蛋白上組裝不同的催化亞基，形成適應(yīng)外界木質(zhì)纖維素底物多樣性的高度復(fù)雜多變的纖維小體。同一個(gè)物種中，不同纖維小體催化亞基的對(duì)接模塊是高度同源的，腳架蛋白上的粘連模塊也高度同源，因此，各種催化亞基與腳架蛋白的組裝是通過(guò)同樣的方式實(shí)現(xiàn)的。由于這種標(biāo)準(zhǔn)的組裝接口，纖維小體的大小和架構(gòu)的多樣性主要由腳架蛋白的復(fù)雜程度所決定。目前發(fā)現(xiàn)的最簡(jiǎn)單的纖維小體是來(lái)自于Clostridium saccharoperbutylacetonicum的纖維小體，僅包含1 種帶有2 個(gè)粘連模塊的腳架蛋白以及8 種帶有對(duì)接模塊的催化亞基［18］，而最復(fù)雜的纖維小體來(lái)自溶纖維假擬桿菌（Pseudobacteroides cellulosolvens），包含有31 種腳架蛋白和超過(guò)200 種的催化亞基［19］。

根據(jù)腳架蛋白數(shù)目的多少，可以將纖維小體分為簡(jiǎn)單纖維小體和復(fù)雜纖維小體［20］。簡(jiǎn)單纖維小體只有一個(gè)腳架蛋白，而復(fù)雜纖維小體具有多個(gè)腳架蛋白，且多為分級(jí)組裝：酶組裝在一級(jí)腳架蛋白之上，一級(jí)腳架蛋白進(jìn)一步組裝在二級(jí)腳架蛋白之上，有的細(xì)菌中還有將二級(jí)腳架蛋白進(jìn)一步組裝的三級(jí)腳架蛋白［21］。根據(jù)序列比對(duì)分析，已知的纖維小體的粘連模塊和對(duì)接模塊可大致分為3 種類型，其中Ⅰ型對(duì)接模塊直接與酶串聯(lián)，對(duì)應(yīng)的Ⅰ型粘連模塊串聯(lián)形成一級(jí)腳架蛋白；Ⅱ型對(duì)接模塊通常位于一級(jí)腳架蛋白上，對(duì)應(yīng)的Ⅱ型粘連模塊串聯(lián)形成二級(jí)腳架蛋白；Ⅲ型對(duì)接模塊和粘連模塊主要發(fā)現(xiàn)于瘤胃球菌（Ruminococcus）中，和Ⅰ型和Ⅱ型模塊有顯著差異［22］。通過(guò)一級(jí)腳架蛋白和二級(jí)腳架蛋白的級(jí)聯(lián)放大，組裝得到的纖維小體可以包含上百個(gè)酶亞基。不同物種含有的纖維小體腳架蛋白的數(shù)目、腳架蛋白上模塊的數(shù)目和種類等都存在差異，組裝形成的纖維小體具有巨大的多樣性。圖1 展示了熱纖梭菌的纖維小體組裝模式，是一種典型的具有兩級(jí)組裝的復(fù)雜纖維小體。

圖1 熱纖梭菌纖維小體的架構(gòu)及其帶來(lái)的協(xié)同效應(yīng)Fig.1 Schematic diagram of cellulosomes from C.thermocellum and their synergistic effects

纖維小體的復(fù)雜度及多樣性是細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境中復(fù)雜的木質(zhì)纖維素底物的進(jìn)化產(chǎn)物。這種適應(yīng)性主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面：一是纖維小體體系包含了多重協(xié)同作用，能夠高效降解復(fù)雜底物；二是纖維小體的結(jié)構(gòu)具有高度的靈活性，能夠適應(yīng)木質(zhì)纖維素的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。

纖維小體體系的協(xié)同作用可以分為多個(gè)層次，包括酶與酶之間的協(xié)同作用、酶與底物的協(xié)同作用以及酶與細(xì)胞的協(xié)同作用（圖1）。纖維小體的酶組分具有多樣性與互補(bǔ)性。即使是在已發(fā)現(xiàn)的最簡(jiǎn)單的纖維小體中，酶組分也同時(shí)包含了多種功能不同且互補(bǔ)的酶類，包括纖維素內(nèi)切酶、纖維素外切酶、木聚糖酶、木葡聚糖酶、地衣聚糖酶等［18］。對(duì)于復(fù)雜纖維小體，其酶組分可以達(dá)到上百種，分屬于不同的糖苷水解酶家族。除了酶與酶之間所具有的功能互補(bǔ)協(xié)同性，纖維小體還將不同種類的酶組裝到腳架蛋白上，從而形成空間鄰近效應(yīng)，大大提升酶之間的協(xié)同作用。纖維小體的腳架蛋白和部分酶亞基上的碳水化合物結(jié)合模塊將纖維小體緊密結(jié)合于底物上，有效縮短了酶對(duì)底物的搜尋時(shí)間，從而形成酶與底物的協(xié)同作用。一些腳架蛋白上具有的SLH 模塊把纖維小體固定在細(xì)胞表面，由此產(chǎn)生兩個(gè)益處：一是纖維小體降解產(chǎn)生的糖類在細(xì)胞附近，可以更高效地被細(xì)胞吸收，避免被周圍的競(jìng)爭(zhēng)者所利用，同時(shí)降低產(chǎn)物抑制，形成酶-細(xì)胞的協(xié)同作用；二是纖維小體作為合成出來(lái)的復(fù)雜大分子機(jī)器，固定在細(xì)胞表面減少了酶擴(kuò)散到遠(yuǎn)處造成的損失，從而減輕了新蛋白質(zhì)合成的負(fù)擔(dān)。一些產(chǎn)纖維小體細(xì)菌中同時(shí)會(huì)產(chǎn)生一些并不固定在細(xì)胞表面的游離纖維小體［23］。游離纖維小體雖然不具備前述兩種益處，但它可以擴(kuò)散到離細(xì)胞稍遠(yuǎn)的地方，有利于降解較遠(yuǎn)處的底物，從而形成與細(xì)胞表面固定化的纖維小體之間的互補(bǔ)與協(xié)同。這些多層次的互補(bǔ)協(xié)同作用，是纖維小體降解木質(zhì)纖維素高效性的基礎(chǔ)。本研究組洪偉等［24］通過(guò)將熱纖梭菌中不同腳架蛋白分別敲除來(lái)解除纖維小體的部分協(xié)同作用，從而定量分析了各類協(xié)同作用對(duì)纖維小體活性的貢獻(xiàn)。

除了多層次的協(xié)同作用，纖維小體構(gòu)象的靈活性也是其能夠適應(yīng)底物結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的重要原因。不同于許多分子機(jī)器（如核糖體等）較為剛性的整體結(jié)構(gòu)，纖維小體結(jié)構(gòu)是高度動(dòng)態(tài)的［25］。纖維小體的高度動(dòng)態(tài)性使其在結(jié)構(gòu)復(fù)雜的木質(zhì)纖維素表面，可以通過(guò)自身的形變實(shí)現(xiàn)對(duì)底物的高效降解。近期，奧地利格拉茨理工大學(xué)Eibinger 等［26］通過(guò)原子力顯微鏡觀察了纖維小體在木質(zhì)纖維素表面的作用過(guò)程，發(fā)現(xiàn)纖維小體在木質(zhì)纖維素的降解過(guò)程中持續(xù)發(fā)生巨大的形變，認(rèn)為這種構(gòu)象上的靈活性和可變性是纖維小體高效降解木質(zhì)纖維素的重要原因之一。目前纖維小體這種靈活動(dòng)態(tài)形變的分子機(jī)制還不是特別清楚，除了纖維小體模塊間具有一定柔性的連接區(qū)域可能對(duì)這種可變性有貢獻(xiàn)之外，是否還有其他因素參與需要進(jìn)一步研究。產(chǎn)纖維小體細(xì)菌除了利用纖維小體自身的自適應(yīng)特性之外，還發(fā)展出一整套底物偶聯(lián)的調(diào)控機(jī)制，來(lái)進(jìn)一步增強(qiáng)纖維小體的底物適應(yīng)性。產(chǎn)纖維小體細(xì)菌能夠根據(jù)底物成分的不同，表達(dá)不同的纖維小體酶組分，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)不同底物的高效降解［27-32］。這種底物偶聯(lián)的纖維小體調(diào)控機(jī)制的分子基礎(chǔ)直到最近十年才得到一定程度的揭示。目前發(fā)現(xiàn)的參與纖維小體底物偶聯(lián)調(diào)控的新型調(diào)控元件包括新型的σI/anti-σI因子［14，33］，新型的5′-UTR 元件［34］，以及新的轉(zhuǎn)錄后加工調(diào)控等［35］，這些新型的調(diào)控機(jī)制是目前纖維小體研究中的前沿課題。

2 纖維小體在合成生物學(xué)中的應(yīng)用：人工纖維小體

纖維小體自發(fā)現(xiàn)以來(lái)，其模塊化特征啟示人們可以將其應(yīng)用于各種生物技術(shù)中。早在1994年，以色列維茨曼科學(xué)研究所Bayer等［1］就根據(jù)當(dāng)時(shí)已知的纖維小體架構(gòu)，提出了利用纖維小體模塊來(lái)組裝特定功能的蛋白質(zhì)復(fù)合體，稱為人工纖維小體（designer cellulosome），但受到當(dāng)時(shí)技術(shù)水平的限制（如分子生物學(xué)操作尚不成熟），難以實(shí)現(xiàn)。直到2001 年，法國(guó)國(guó)家科學(xué)研究中心Fierobe等［36］才報(bào)道了第1個(gè)雙功能人工纖維小體。這時(shí)，人工纖維小體組裝方式與最初提出的人工纖維小體已略有差別。這是由于20 世紀(jì)90 年代對(duì)熱纖梭菌和解纖維梭菌的纖維小體粘連模塊和對(duì)接模塊相互作用的研究發(fā)現(xiàn)，雖然兩種細(xì)菌的組裝模塊之間具有顯著的同源性，但彼此之間不能交叉相互作用，形成了種間特異性［37］。利用這種種間特異性可以構(gòu)建出特定酶組分在特定位置組裝的纖維小體，即現(xiàn)在所說(shuō)的人工纖維小體［圖2（a）和（b）］。對(duì)不同來(lái)源的粘連模塊和對(duì)接模塊的系統(tǒng)分析表明，雖然存在一些例外，種間特異性（即正交性）是廣泛存在的［38］。不同物種纖維小體組裝的正交性的形成原因還不是很清楚，推測(cè)這種正交性可能有助于物種間的競(jìng)爭(zhēng)。多個(gè)研究組構(gòu)建了逐漸復(fù)雜的人工纖維小體，從最初的2個(gè)酶組分到2016 年的8 個(gè)酶組分，人工纖維小體最高的活性已達(dá)到熱纖梭菌天然纖維小體活性的70%［39-47］。法國(guó)國(guó)家科學(xué)研究中心Mingardon 等［42］組裝了一些特殊的、與天然纖維小體的串聯(lián)組裝方式不同的人工纖維小體，如環(huán)狀的、對(duì)稱的、分支的等，發(fā)現(xiàn)活性最高的組裝方式仍然是類似于天然纖維小體的簡(jiǎn)單串聯(lián)組裝。此外，研究表明模塊連接區(qū)（linker）的長(zhǎng)度對(duì)人工纖維小體的組裝也十分重要［48-49］。以色列維茨曼科學(xué)研究所Bayer 研究組Vazana 等［50］使用合成生物學(xué)方式構(gòu)建了各種排列組合和不同連接區(qū)長(zhǎng)度的腳架蛋白庫(kù)，為人工纖維小體的高效構(gòu)建和篩選奠定了基礎(chǔ)。在人工纖維小體的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，人工構(gòu)建的腳架蛋白隨著粘連模塊數(shù)目的增加其表達(dá)純化的難度逐漸增加，并且更易于降解，導(dǎo)致隨著酶組分的增多，使用單一腳架蛋白構(gòu)建人工纖維小體的難度也不斷增大。因此，在2016 年的八酶組分人工纖維小體中使用了類似于天然的兩級(jí)腳架組裝纖維小體的方式［45］。這些人工纖維小體的研究工作，由于具有確定的纖維小體組分和簡(jiǎn)化的纖維小體大小，不但在機(jī)理研究方面可以深入揭示纖維小體的作用機(jī)制，而且在應(yīng)用研究方面也為合成生物學(xué)和其他生物技術(shù)應(yīng)用提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。因此，人工纖維小體架構(gòu)在生物技術(shù)和合成生物學(xué)中被廣泛用于構(gòu)建不同功能的多酶復(fù)合體（見(jiàn)下面第3和4部分）。

圖2 天然纖維小體、人工纖維小體與底物通道效應(yīng)（a）天然纖維小體的粘連模塊之間和對(duì)接模塊之間都是高度同源的，不同酶組裝在腳架蛋白上的位置是隨機(jī)的；（b）人工纖維小體使用不同物種來(lái)源（以不同色彩表示）的粘連模塊和對(duì)接模塊，它們之間具有種間特異性，從而將特定的酶組裝到人工腳架蛋白的特定位置上；（c）通過(guò)人工纖維小體將級(jí)聯(lián)催化的酶組裝起來(lái)，底物如同經(jīng)過(guò)一個(gè)通道完成多步反應(yīng)生成最終產(chǎn)物，大大提升反應(yīng)的效率，形成底物通道效應(yīng)Fig.2 Natural cellulosomes,designer cellulosomes,and substrate-channeling effects(a)naturally occurring cellulosomes contain highly homologous assembly modules,i.e.cohesins and dockerins,resulting in the random assembly of enzymes on the scaffoldin;(b)designer cellulosomes use assembly modules from different bacteria(shown in different colors),which have speciesspecific interactions for the enzymes to be assembled at specific positions according to the design;(c)cascading catalytic reactions are enhanced by assembling the enzyme cascade into a designer cellulosome,and the substrate is converted to the final product once it has passed through the channel,which is termed as the substrate-channeling effect

除了前述使用天然纖維小體元件進(jìn)行人工纖維小體的構(gòu)建，還有很多研究在人工纖維小體構(gòu)建中設(shè)計(jì)或引入新元件，以超越天然纖維小體的活力或性能。人工纖維小體的設(shè)計(jì)得益于不同物種的粘連模塊和對(duì)接模塊相互作用的正交性，但已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)纖維小體的物種數(shù)目有限，因此人工設(shè)計(jì)具有正交作用的粘連模塊-對(duì)接模塊對(duì)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。美國(guó)內(nèi)布拉斯加大學(xué)林肯分校Lawire 等［51］設(shè)計(jì)了利用定向進(jìn)化高通量篩選正交性粘連模塊-對(duì)接模塊對(duì)的方法，并獲得了一對(duì)新的正交相互作用模塊。以色列維茨曼科學(xué)研究所Bayer 研究組Gefen 等［52］首次在體外將β-葡萄糖苷酶（BGL）引入纖維小體，從而解除了纖維素降解產(chǎn)物纖維二糖導(dǎo)致的反饋抑制，提升纖維小體降解纖維素的效率。在此基礎(chǔ)上，本研究組［53-55］將外源BGL 整合到熱纖梭菌基因組中，構(gòu)建了基于熱纖梭菌纖維小體的全菌催化劑，開(kāi)發(fā)了新的木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化技術(shù)--整合生物糖化技術(shù)。通過(guò)整合嗜熱菌來(lái)源的纖維素酶，Bayer研究組Kahn等構(gòu)建的超嗜熱纖維小體在75 ℃展現(xiàn)出非常好的活性［56］，隨后又證明糖基化修飾可以進(jìn)一步提升該纖維小體的熱穩(wěn)定性［57］。裂解型多糖單加氧酶（LPMO）是一類需要氧氣參加的纖維素氧化降解酶，而已知的纖維小體都是厭氧微生物產(chǎn)生的，因此天然的纖維小體中都不存在LPMO。Bayer 研究組Arfi 等［58］將細(xì)菌的LPMO 整合到人工纖維小體中，提升了纖維小體降解纖維素的能力。Bayer研究組Davidi 等［59］則把漆酶引入到人工纖維小體中，使纖維小體具備一定的脫木質(zhì)素能力，從而大大增強(qiáng)了其降解小麥秸稈的能力。這些研究工作表明，纖維小體的活性雖然很高，但在具體的應(yīng)用中仍然可以根據(jù)需求進(jìn)一步提升和改進(jìn)，拓展其應(yīng)用空間。

由于纖維小體組分多樣，且多模塊腳架蛋白的構(gòu)建較為困難，一些研究組探索了使用其他方式組裝或制備人工纖維小體。美國(guó)夏威夷大學(xué)Han和Su［60］設(shè)計(jì)了利用拆分內(nèi)含肽（split intein）介導(dǎo)的自連接來(lái)合成具有多模塊的腳架蛋白，并對(duì)比了具有6 個(gè)不同位置的粘連模塊的腳架蛋白的差異。除了利用大腸桿菌制備人工纖維小體，其他異源體系也可用來(lái)產(chǎn)生人工纖維小體，如谷氨酸棒桿菌［61］和枯草芽孢桿菌［62-63］等。由于在一個(gè)細(xì)菌中分泌多個(gè)纖維小體組分可能會(huì)對(duì)菌株造成較大負(fù)擔(dān)，另一個(gè)特殊的人工纖維小體制備方案是通過(guò)多個(gè)重組菌株（即菌群）分泌不同的纖維小體組分來(lái)生產(chǎn)纖維小體［64-65］。通過(guò)大腸桿菌或枯草芽孢桿菌等體系制備人工纖維小體的一個(gè)常見(jiàn)問(wèn)題是產(chǎn)生的大分子量腳架蛋白容易降解，而通過(guò)無(wú)細(xì)胞體系合成則可以避免這個(gè)問(wèn)題。日本大學(xué)Hirano 等［66-69］利用無(wú)細(xì)胞體系重構(gòu)和定制了復(fù)雜的多組分纖維小體，分析了酶組分、比例以及外源BGL 等對(duì)纖維小體活性的影響。這些研究和探索為人工纖維小體的制備方案提供了多種可能性，有助于在不同場(chǎng)景需求下的應(yīng)用和開(kāi)發(fā)。

3 纖維小體架構(gòu)在合成生物學(xué)中的應(yīng)用：合成代謝通路

隨著對(duì)纖維小體架構(gòu)和高效作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)逐漸深入，人們認(rèn)識(shí)到這一架構(gòu)完全可以用于其他酶類的組裝，而不僅僅局限于木質(zhì)纖維素降解。同時(shí)，人工纖維小體構(gòu)建的成功，也為將這一架構(gòu)移植到其他酶類提供了具體的實(shí)現(xiàn)方案，從而可以構(gòu)建具備鄰近效應(yīng)與底物通道效應(yīng)等多重協(xié)同效應(yīng)的高性能多酶復(fù)合體［圖2（c）］。2013 年美國(guó)弗吉尼亞理工學(xué)院游淳和張以恒［70］使用人工纖維小體架構(gòu)將糖酵解途徑中的3 個(gè)連續(xù)的酶TIM、ALD 和FBP 串聯(lián)起來(lái)，構(gòu)建了合成代謝通路，首次驗(yàn)證了這種組裝的可行性和底物通道效應(yīng)。美國(guó)特拉華大學(xué)Liu 等［71］使用人工纖維小體架構(gòu)在酵母表面展示3個(gè)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的酶，將甲醇氧化為二氧化碳，產(chǎn)生NADH 的速率提升了5 倍。2014 年，日本名城大學(xué)Jindou 等［72］在藍(lán)細(xì)菌中使用人工纖維小體構(gòu)建了SAM 到乙烯的合成途徑，使乙烯的產(chǎn)量比游離酶多了3.7 倍，展示出顯著的底物通道效應(yīng)。韓國(guó)首爾國(guó)立大學(xué)Kim 和Hahn［73］在酵母中構(gòu)建了使用人工纖維小體架構(gòu)將兩個(gè)酶形成底物通道產(chǎn)2，3-丁二醇的工程菌株，并通過(guò)改變腳架蛋白中粘連模塊的數(shù)目?jī)?yōu)化了兩種酶在組裝中的配比，實(shí)現(xiàn)了產(chǎn)量的顯著提升。美國(guó)加州大學(xué)河濱分校Lin 等［74］使用人工纖維小體架構(gòu)將多個(gè)酶定位到酵母的脂滴表面，產(chǎn)生乙酸乙酯的速率比未使用纖維小體架構(gòu)的酶提升了兩倍。華中科技大學(xué)閻金勇研究組Yang等［75］使用人工纖維小體架構(gòu)在解脂耶氏酵母表面展示3個(gè)酶（脂肪酶、羧酸還原酶、乙醛脫羧酶），將甘油三酯直接一鍋法轉(zhuǎn)化為脂肪烴，初始反應(yīng)速率提升了17 倍，轉(zhuǎn)化率則由游離酶的7%～32%提升到71%～84%。該研究組Li 等［76］進(jìn)一步使用人工纖維小體架構(gòu)將脂肪酶和P450 脂肪酸脫羧酶固定化在纖維素上，同樣實(shí)現(xiàn)了甘油三酯到脂肪烴的高效轉(zhuǎn)化，并且固定化的催化劑可以回收和多次重復(fù)使用。

從這些研究結(jié)果可以看出，人工纖維小體可以用于構(gòu)建各類不同的代謝通路，適用于多種宿主，通常可以實(shí)現(xiàn)反應(yīng)速率或產(chǎn)量數(shù)倍的提升，具有非常好的實(shí)際應(yīng)用效果。人工纖維小體通過(guò)酶的空間鄰近效應(yīng)，在級(jí)聯(lián)酶之間形成底物通道，可以減少中間產(chǎn)物毒性、中間產(chǎn)物擴(kuò)散導(dǎo)致下游酶的有效底物濃度低下等問(wèn)題。對(duì)于代謝通路中存在活性較低的瓶頸酶的情況下，使用人工纖維小體的效果會(huì)尤其明顯。可以預(yù)期，在未來(lái)合成生物學(xué)的代謝通路構(gòu)建中，基于人工纖維小體的方案將會(huì)得到更加廣泛的應(yīng)用。

4 纖維小體架構(gòu)在合成生物學(xué)中的應(yīng)用：細(xì)胞表面展示與酶固定化

天然纖維小體可以通過(guò)SLH 模塊固定于細(xì)胞表面，也可以通過(guò)CBM 模塊固定在底物表面，這兩個(gè)酶固定化的特性在合成生物技術(shù)中均得到了大量應(yīng)用。這些應(yīng)用主要包括：通過(guò)在不能降解纖維素的微生物細(xì)胞表面展示纖維小體，賦予其降解纖維素的能力；通過(guò)在細(xì)胞表面、纖維素表面或其他固體材料（如納米顆粒）表面展示其他酶類，實(shí)現(xiàn)上節(jié)所述的底物通道效應(yīng)。雖然天然纖維小體通常使用SLH 模塊固定于細(xì)胞表面，但這一模塊具有一定的物種特異性，因此在異源細(xì)胞表面展示纖維小體時(shí)，通常使用其他的適用于特定微生物的細(xì)胞壁結(jié)合蛋白。目前報(bào)道的成功將人工纖維小體展示于細(xì)胞表面的微生物包括酵母、枯草芽孢桿菌［77-78］、大腸桿菌［79-80］、乳酸乳球菌［81］、植物乳桿菌［82］和惡臭假單胞菌［83］等。其中，以酵母表面展示研究得最多，應(yīng)用的方式也最為廣泛，下面稍作詳細(xì)介紹。

酵母具有發(fā)酵產(chǎn)乙醇的能力，但不能直接降解木質(zhì)纖維素，因此，將人工纖維小體展示于酵母菌的表面，使其成為直接降解纖維素產(chǎn)乙醇的工程菌株，是實(shí)現(xiàn)整合生物加工的一種理想方案。整合生物加工是美國(guó)達(dá)特茅斯學(xué)院Lynd 研究組［84］提出的概念，是指將從木質(zhì)纖維素降解到生物乙醇生產(chǎn)都整合到一個(gè)微生物中，從而大大降低生物燃料生產(chǎn)過(guò)程成本的工藝方案。2009 年南非和美國(guó)的兩個(gè)研究組分別獨(dú)立構(gòu)建了在釀酒酵母表面展示兩功能和三功能人工纖維小體的工程菌株，實(shí)現(xiàn)了通過(guò)酵母直接降解纖維素來(lái)產(chǎn)生乙醇［85-86］。2012 年北京化工大學(xué)譚天偉研究組范立海等［87］在釀酒酵母中構(gòu)建了通過(guò)二級(jí)腳架放大的人工纖維小體的表面展示，并優(yōu)化了二級(jí)腳架的長(zhǎng)度，使得最終的乙醇滴度得到了顯著提升［圖3（a）］。同時(shí)美國(guó)特拉華大學(xué)Tsai等［88］也發(fā)表了類似的工作。山東大學(xué)侯進(jìn)與鮑曉明研究組Tang等［89］采用二硫鍵連接酵母細(xì)胞壁蛋白的方式構(gòu)建級(jí)聯(lián)腳架，表明其組裝效率高于普通的二級(jí)腳架。美國(guó)加州大學(xué)爾灣分校Srikrishnan 等［90］在酵母表面展示了三功能的木聚糖小體，大大增強(qiáng)了釀酒酵母對(duì)半纖維素的糖化能力。除了釀酒酵母，解脂耶氏酵母和畢氏酵母也可用來(lái)在表面展示人工纖維小體［75，91-92］。美國(guó)密西根大學(xué)Smith 等［93］定量分析了酵母表面組裝多腳架人工纖維小體時(shí)的結(jié)構(gòu)性能關(guān)系，揭示了酵母表面展示人工纖維小體的最優(yōu)條件。2020年，臺(tái)灣中央研究院Anandharaj等［94］在馬克斯克魯維酵母表面展示了具有63 個(gè)酶組分的纖維小體，并將表達(dá)的基因整合到基因組上。這是目前已報(bào)道的在酵母表面展示的最大的纖維小體，該菌株從纖維素生產(chǎn)乙醇的產(chǎn)量顯著高于以前報(bào)道的其他菌株。

除了利用酵母展示纖維小體來(lái)實(shí)現(xiàn)生物燃料的生產(chǎn)，酵母表面展示人工纖維小體還可以用來(lái)提升生物燃料電池的性能［圖3（b）］。以色列本古里安大學(xué)Szczupak 等［95］通過(guò)酵母表面展示人工纖維小體架構(gòu)的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)驅(qū)動(dòng)生物燃料電池的陰極和陽(yáng)極反應(yīng)，并將這種構(gòu)建生物燃料電池的人工纖維小體稱為電子小體，證明了該概念的可行性。青島大學(xué)劉愛(ài)驊研究組Fan 等［96］將酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)組裝于酵母表面驅(qū)動(dòng)生物燃料電池陰極反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)人工纖維小體在電極表面組裝的順序和比例都會(huì)對(duì)燃料電池效能產(chǎn)生很大影響，通過(guò)優(yōu)化之后獲得了36.1 μW/cm2的最大功率密度，遠(yuǎn)高于其他基于淀粉/氧氣的生物燃料電池。

圖3 人工纖維小體用于細(xì)胞表面展示（a）通過(guò)在酵母表面展示人工纖維小體，可以賦予酵母降解纖維素的能力；（b）利用酵母表面展示的級(jí)聯(lián)酶固定到生物燃料電池的陰極或陽(yáng)極，可以顯著提升生物燃料電池的性能Fig.3 Cell-display using designer cellulosomes(a)designer cellulosomes displayed on yeast cell surfaces allow the yeast to degrade cellulose;(b)using yeasts displaying designer cellulosomes containing enzyme cascades to serve as a bioanode and biocathode,the performance of the biofuel cells can be significantly enhanced

除了展示于細(xì)胞表面，使用類似的思路還可以將多酶體系固定化于纖維素表面，實(shí)現(xiàn)對(duì)纖維素表面的功能化、提升酶的穩(wěn)定性以及增強(qiáng)回收再利用能力等。2013 年美國(guó)弗吉尼亞理工學(xué)院張以恒研究組游淳等［97］構(gòu)建了將纖維素轉(zhuǎn)化為淀粉的多酶體系，包含纖維素酶、纖維二糖磷酸化酶、和α-糖苷磷酸化酶，其中纖維二糖磷酸化酶和α-糖苷磷酸化酶通過(guò)人工纖維小體上的CBM 固定化于包含纖維素的磁性納米顆粒上，從而便于回收再利用。2016 年北京化工大學(xué)范立海研究組Li等［98］利用人工纖維小體架構(gòu)，通過(guò)增加腳架蛋白的模塊數(shù)目，實(shí)現(xiàn)了使用CBM 進(jìn)行高酶載量的固定化。

以上研究表明，利用人工纖維小體進(jìn)行細(xì)胞表面展示或酶固定化是一種非常有效的策略，可應(yīng)用于各種不同的宿主細(xì)胞或材料，在未來(lái)的合成生物學(xué)產(chǎn)業(yè)應(yīng)用中將發(fā)揮重要的作用。

5 纖維小體概念在合成生物學(xué)中的應(yīng)用：仿纖維小體

纖維小體架構(gòu)的核心啟示在于超分子體系的自組裝和多酶體系的協(xié)同作用?；谶@一啟示，人們開(kāi)發(fā)了利用其他生物分子相互作用形成的超分子復(fù)合體來(lái)模仿纖維小體架構(gòu)，稱為仿纖維小體（artificial cellulosome）（圖4）。如同人工纖維小體可以用來(lái)構(gòu)建非纖維素酶的復(fù)合體，仿纖維小體的酶系可以是纖維素酶，也可以是其他各類不同的酶系，因此形成的復(fù)合體可能具備完全不同的功能特征。

一類仿纖維小體是利用自然界中已有的多亞基復(fù)合體或蛋白質(zhì)交聯(lián)來(lái)實(shí)現(xiàn)組裝。來(lái)自楊樹(shù)的SP1蛋白可以自發(fā)形成環(huán)狀的十二聚體。人們利用這一特性，通過(guò)融合粘連模塊，將多個(gè)纖維素酶組裝形成類似于納米顆粒的復(fù)合體，復(fù)合體的活性比游離酶有顯著提升［99-100］［圖4（a）］。另一個(gè)類似的例子是利用來(lái)自極端嗜熱古菌的一種十八聚體的二類分子伴侶（rosettasome）作為腳架蛋白，通過(guò)融合粘連模塊構(gòu)建多酶復(fù)合體，這一復(fù)合體被稱為rosettazyme［101］。人們利用這一體系組裝不同的酶類形成仿人工纖維小體，用于木質(zhì)纖維素的糖化以及將葡糖醛酸木聚糖轉(zhuǎn)化為平臺(tái)化合物D-木糖酸［102-103］。美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校McConnell 等［104］利用一個(gè)24 亞基的自組裝蛋白籠作為腳架蛋白，并使用轉(zhuǎn)肽酶將帶有特定多肽標(biāo)簽的纖維素酶共價(jià)結(jié)合到蛋白籠表面，由此得到的仿纖維小體降解纖維素的活力顯著高于游離酶系。日本九州大學(xué)Budinova等［105］利用酪蛋白可以通過(guò)轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶進(jìn)行交聯(lián)形成共聚物的特點(diǎn)，在纖維素酶上引入可以和酪蛋白交聯(lián)的多肽，進(jìn)而通過(guò)酶促交聯(lián)形成仿纖維小體共聚物。這種酪蛋白共聚物的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以通過(guò)加入鈣離子來(lái)沉淀，從而易于回收。美國(guó)夏威夷大學(xué)Han 等［106］利用酵母朊蛋白形成的淀粉樣纖維作為腳手架，將纖維素酶展示在淀粉樣纖維的表面，并固定于酵母細(xì)胞壁上，該方法展示的酶的數(shù)目遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了常規(guī)的人工纖維小體所能展示的酶的數(shù)目。韓國(guó)高麗大學(xué)Kim 等［107］將粘連模塊與煙草花葉病毒包被蛋白融合，利用煙草花葉病毒包被蛋白自組裝的桿狀納米結(jié)構(gòu)作為腳手架，在其表面展示了高密度的酶分子。香港中文大學(xué)夏江研究組與武漢大學(xué)劉天罡研究組［108］等合作，開(kāi)發(fā)了利用AKAP信號(hào)復(fù)合體中的一對(duì)相互作用的多肽實(shí)現(xiàn)多酶復(fù)合體的仿纖維小體組裝，并將其應(yīng)用于類胡蘿卜素和番茄紅素合成中關(guān)鍵酶的底物通道建立，大大提升了產(chǎn)量。香港中文大學(xué)夏江研究組Liu 等［109］利用可形成共價(jià)復(fù)合體的SpyCatcher 和SpyTag 蛋白對(duì)，構(gòu)建了可自組裝的納米腳手架，將維生素K合成途徑中的酶組裝成仿纖維小體，使其催化性能得到了顯著提升。丹麥哥本哈根大學(xué)Behrendorff等［110］利用結(jié)合于細(xì)胞膜的類囊體蛋白CURT1A 作為腳手架，將多個(gè)酶組裝到膜結(jié)構(gòu)上，從而實(shí)現(xiàn)了在真核生物胞內(nèi)細(xì)胞器表面展示的仿纖維小體［圖4（c）］。

圖4 已報(bào)道的多種仿纖維小體構(gòu)建方式（a）利用蛋白質(zhì)多聚體作為腳手架構(gòu)建仿纖維小體；（b）利用納米顆粒作為腳手架，可以獲得高酶載量的仿纖維小體；（c）利用膜蛋白作為腳手架，可以在細(xì)胞器表面構(gòu)建仿纖維小體；（d）以DNA作為腳手架，利用dCas9和引導(dǎo)RNA的特異性構(gòu)建仿纖維小體Fig.4 Various schemes for developing artificial cellulosomes(a)Artificial cellulosomes are constructed using an oligomeric protein as scaffold;(b)using nanoparticles as scaffold for the construction of artificial cellulosomes,loading of enzymes can be significantly increased;(c)artificial cellulosomes can be constructed on surface of organelles using a membrane protein as scaffold;(d)Artificial cellulosomes can be constructed using DNA as the scaffold with the specificity of dCas9 and guide RNA.

另一類仿纖維小體則完全拋棄了使用蛋白質(zhì)作為腳手架，而改用其他非蛋白類的分子作為腳手架來(lái)構(gòu)建多酶復(fù)合體，如納米顆粒和DNA 等。納米顆粒作為腳手架具有穩(wěn)定性高、易大量制備和回收等優(yōu)勢(shì)，文獻(xiàn)中已報(bào)道了多種用于構(gòu)建仿纖維小體的納米顆粒，包括硒化鎘納米顆粒［111］、金納米顆粒和金摻雜的磁性硅膠納米顆粒［112］、四氧化三鐵磁性納米顆粒［113］以及Ni-NTA 功能化膠束［114］等［圖4（b）］。DNA 分子具有非常容易合成和定制的優(yōu)勢(shì)，也可以作為腳手架構(gòu)建仿纖維小體。2013 年日本九州大學(xué)Mori等［115］利用DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)的方式，首次將纖維素酶交聯(lián)到DNA 骨架上構(gòu)建了仿纖維小體。這種方式構(gòu)建的仿纖維小體由于交聯(lián)的位置缺乏特異性，無(wú)法實(shí)現(xiàn)人工纖維小體那樣的組分和位置定制。為克服這個(gè)問(wèn)題，美國(guó)特拉華大學(xué)Chen 研究組連續(xù)開(kāi)發(fā)了多種使用DNA 作為腳手架構(gòu)建仿纖維小體的方法，以實(shí)現(xiàn)位置特異性并體現(xiàn)出DNA 可定制合成的優(yōu)勢(shì)［116-119］。Chen 研究組［116］在2014 年報(bào)道了利用鋅指蛋白和DNA 的特異性相互作用，實(shí)現(xiàn)基于DNA腳手架的仿纖維小體的定制組裝。2016 年，Chen研究組［117］利用一種可共價(jià)結(jié)合于氯己烷的HaloTag，通過(guò)合成特定序列的帶有氯己烷標(biāo)記的DNA，利用雙鏈DNA的互補(bǔ)實(shí)現(xiàn)在特定模板DNA位點(diǎn)鏈接特定纖維素酶，從而形成具有位點(diǎn)特異性的基于DNA 腳手架的仿纖維小體。使用這一方案，他們組裝了具有4種酶組分的纖維素降解系統(tǒng)，以及進(jìn)一步增加葡萄糖氧化酶，從而直接將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖酸和雙氧水的系統(tǒng)［118］。2019年，Chen研究組［119-120］將dCas9 蛋白與纖維素酶融合或利用SpyCatcher-SpyTag連接，利用正交的dCas9蛋白對(duì)DNA 的位點(diǎn)識(shí)別的特異性，組裝了以DNA 為腳手架的兩組分仿纖維小體。最近，美國(guó)加州大學(xué)伯克利分校的Lim 等［121］使用SpyCatcher 和SpyTag將同一種dCas9與不同的纖維素酶連接，并利用不同的引導(dǎo)RNA 產(chǎn)生對(duì)特定DNA 位點(diǎn)的序列特異性結(jié)合，實(shí)現(xiàn)多酶在DNA 特定位點(diǎn)的組裝，并構(gòu)建了具有紫色桿菌素生物合成途徑的5個(gè)酶的仿纖維小體［圖4（d）］。

可以看到，仿纖維小體構(gòu)建研究在近10 年來(lái)得到了巨大的發(fā)展，作為腳手架使用的材料和體系復(fù)雜多樣，但其核心都是通過(guò)構(gòu)建腳手架使多種酶分子在空間上形成鄰近效應(yīng)，從而獲得高效的納米分子機(jī)器或生物功能材料?？梢灶A(yù)期，基于纖維小體架構(gòu)和協(xié)同性帶來(lái)的啟示，仿纖維小體在未來(lái)會(huì)有更多的構(gòu)建方法和應(yīng)用領(lǐng)域。

6 展望

纖維小體以其模塊化特征和模塊的多樣性，成為自然界中最符合合成生物學(xué)策略的分子機(jī)器之一，因而無(wú)論是纖維小體模塊本身還是纖維小體的組裝策略，都在合成生物技術(shù)開(kāi)發(fā)中得到了廣泛的應(yīng)用。纖維小體研究過(guò)程中所發(fā)現(xiàn)的模塊化、標(biāo)準(zhǔn)接口自組裝、多層次協(xié)同以及自適應(yīng)調(diào)控等策略，與合成生物學(xué)中的許多工程化策略不謀而合，可以說(shuō)是大自然進(jìn)化出的內(nèi)源的“合成生物學(xué)”策略的一個(gè)范例。對(duì)這一范例的研究，為合成生物技術(shù)開(kāi)發(fā)帶來(lái)了許多有益的啟示，而其中一些尚未深入揭示的分子機(jī)制，有望在將來(lái)為合成生物學(xué)提供更多的工具和方法。

目前已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)纖維小體細(xì)菌大約有數(shù)十種，其中產(chǎn)復(fù)雜纖維小體的細(xì)菌有10 種左右，它們之間的纖維小體架構(gòu)差異巨大。因此，自然界中可能仍存在大量的產(chǎn)纖維小體細(xì)菌未被發(fā)現(xiàn)。篩選新的產(chǎn)纖維小體細(xì)菌可能進(jìn)一步豐富纖維小體的元件庫(kù)。即使在已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)復(fù)雜纖維小體細(xì)菌中，由于每種細(xì)菌中的纖維小體亞基數(shù)目可達(dá)上百個(gè)，其中存在很多功能特性并未得到清晰研究的新型元件，對(duì)它們的研究有望為纖維小體應(yīng)用與合成生物技術(shù)開(kāi)發(fā)提供新的素材。本研究組最近在研究丙酮丁醇梭菌中的纖維小體組裝元件時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一對(duì)非常特殊的pH 依賴的粘連模塊和對(duì)接模塊，在不同的pH 下其結(jié)合力可以發(fā)生巨大的變化，而且粘連模塊可以從僅結(jié)合對(duì)接模塊的一個(gè)位點(diǎn)變?yōu)閮H結(jié)合另一個(gè)位點(diǎn)。這種獨(dú)特的pH 依賴的位點(diǎn)切換現(xiàn)象是首次在蛋白質(zhì)相互作用中發(fā)現(xiàn)，為開(kāi)發(fā)新型的pH 依賴的蛋白質(zhì)相互作用元件提供了基礎(chǔ)［122］。我們最近還發(fā)現(xiàn)，在一些細(xì)菌的纖維小體中存在兩個(gè)或多個(gè)對(duì)接模塊串聯(lián)的蛋白質(zhì)，雖然它們?cè)诶w維小體中的作用還不是十分清楚，但這種串聯(lián)的對(duì)接模塊為構(gòu)建新型的纖維小體架構(gòu)提供了新的思路，結(jié)合腳架蛋白上的串聯(lián)的粘連模塊有可能形成新的特殊的人工纖維小體架構(gòu)［123］。除了組裝元件，對(duì)纖維小體中催化元件的研究還可為合成生物學(xué)提供新的酶元件。葡萄牙里斯本大學(xué)Brás等［124］對(duì)一個(gè)催化模塊被標(biāo)注為假想蛋白的纖維小體亞基進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)其是一類新型的糖苷水解酶，主要在纖維素的結(jié)晶區(qū)和無(wú)序區(qū)交界處進(jìn)行水解。我們和以色列維茨曼科學(xué)研究所Bayer 研究組的獨(dú)立研究發(fā)現(xiàn)，黃色梭菌中的纖維小體具有兩個(gè)膨脹因子類似蛋白，它們不能水解纖維素，但能夠在某種條件下增強(qiáng)其他纖維素酶的活性［125-126］。隨著許多已知的含有纖維小體的基因組測(cè)序完成，越來(lái)越多的功能未知的蛋白質(zhì)模塊被發(fā)現(xiàn)存在于纖維小體中。這些模塊既有與對(duì)接模塊串聯(lián)的，也有與粘連模塊串聯(lián)的，它們的功能機(jī)制有待進(jìn)一步深入挖掘，將來(lái)可以為木質(zhì)纖維素生物轉(zhuǎn)化、人工纖維小體設(shè)計(jì)與合成生物學(xué)應(yīng)用提供新元件。

除了纖維小體自身具有模塊化的特征，研究發(fā)現(xiàn)纖維小體的調(diào)控也具有非常有趣的模塊化特征。纖維小體作為細(xì)菌獲取外部碳源（也即主要能量來(lái)源）的分子機(jī)器，其調(diào)控過(guò)程和胞外底物類型及細(xì)胞代謝過(guò)程密切偶聯(lián)。近年來(lái)的研究表明，復(fù)雜纖維小體的轉(zhuǎn)錄受到一類新型σ/anti-σ 因子σI/anti-σI的調(diào)控，通過(guò)多對(duì)σI/anti-σI來(lái)識(shí)別不同類型的底物，并起始轉(zhuǎn)錄對(duì)應(yīng)于該底物成分的纖維小體酶組分。我們和以色列研究組的合作研究表明，σI/anti-σI是一類新型的類似于胞質(zhì)外功能（extra-cytoplasmic function，ECF）類型σ因子的調(diào)控元件，它們上面帶有多種新型的蛋白質(zhì)模塊參與調(diào)控，且多對(duì)σI/anti-σI的調(diào)控具有一定的正交性和部分交叉性［14-5］。在過(guò)去的研究中，ECF 類型的σ 因子被改造為合成生物學(xué)的正交調(diào)控因子［127-128］，因此如果能夠解析σI對(duì)啟動(dòng)子的正交識(shí)別和交叉識(shí)別機(jī)制，產(chǎn)復(fù)雜纖維小體菌中大量的σI/anti-σI因子將為合成生物學(xué)提供一個(gè)新的元件庫(kù)。

由于纖維小體是非常高效的木質(zhì)纖維素降解系統(tǒng)，其異源表達(dá)往往難以超過(guò)原始菌株中纖維小體的性能。因此，對(duì)產(chǎn)纖維小體細(xì)菌進(jìn)行合成生物學(xué)改造就成為木質(zhì)纖維素利用的一個(gè)優(yōu)選的方案。美國(guó)達(dá)特茅斯學(xué)院Lynd 研究組［129］基于整合生物加工策略，對(duì)熱纖梭菌進(jìn)行了系統(tǒng)的代謝工程改造，實(shí)現(xiàn)了29.9 g/L 的乙醇產(chǎn)量。我們研究組則采取了不同于Lynd 研究組的策略，在熱纖梭菌纖維小體中整合外源的高效BGL，解除寡糖對(duì)纖維小體的產(chǎn)物抑制，從而可以將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵糖，而不是直接生產(chǎn)生物燃料等最終產(chǎn)品。這種工藝策略我們稱為整合生物糖化工藝［53-54］?？砂l(fā)酵糖可以進(jìn)一步用于下游各種微生物發(fā)酵生產(chǎn)不同的產(chǎn)物，因此整合生物糖化工藝具有產(chǎn)物出口靈活的優(yōu)勢(shì)，同時(shí)又保留了整合生物加工中將各種步驟整合帶來(lái)的成本降低的好處，更具有產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的前景［55］。除了熱纖梭菌的纖維小體具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，熱纖梭菌的遺傳改造在各類嗜熱菌中屬于研究相對(duì)較多的一個(gè)，有較多的遺傳操作工具和方法，因此可以將其開(kāi)發(fā)為嗜熱菌的底盤(pán)細(xì)胞。我們研究組與德國(guó)格賴夫斯瓦爾德大學(xué)Bornscheuer 研究組合作，在熱纖梭菌中外泌表達(dá)了一個(gè)可以降解聚對(duì)苯二甲酸乙二醇酯（PET）塑料的嗜熱角質(zhì)酶，實(shí)現(xiàn)了目前最高效的全菌PET 降解策略，證明了熱纖梭菌在合成生物學(xué)應(yīng)用中的巨大潛力［130］。這些例子表明，產(chǎn)纖維小體細(xì)菌可以為合成生物學(xué)在生物燃料生產(chǎn)、微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建以及環(huán)境修復(fù)等領(lǐng)域提供新的底盤(pán)細(xì)胞，在未來(lái)的合成生物學(xué)應(yīng)用中具有巨大的潛力。

除了纖維小體元件和產(chǎn)纖維小體細(xì)菌在合成生物學(xué)中具有重要的應(yīng)用價(jià)值，纖維小體研究中提供的高效模塊化自組裝、酶的鄰近效應(yīng)與底物通道效應(yīng)、多層次協(xié)同作用和底物自適應(yīng)調(diào)控等方法策略具有通用性，可用于自組裝仿纖維小體開(kāi)發(fā)、人工代謝通路構(gòu)建、微生物細(xì)胞工廠構(gòu)建和生物材料開(kāi)發(fā)等諸多領(lǐng)域?；谀_架蛋白的復(fù)合體構(gòu)建、細(xì)胞內(nèi)酶級(jí)聯(lián)催化和限域構(gòu)建以及細(xì)胞表面工程等均已發(fā)展為重要的合成生物學(xué)和生物技術(shù)研究方向。這些通過(guò)纖維小體研究獲得的方法策略在未來(lái)的合成生物學(xué)研究和開(kāi)發(fā)中必將大放異彩。