微生物中一碳代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建的進(jìn)展與挑戰(zhàn)

郭姝媛，吳良煥，劉香健，王博，于濤

（1 中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院，合成生物化學(xué)研究中心，廣東 深圳 518055； 2 中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院，中國(guó)科學(xué)院定量工程生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518055）

當(dāng)前，隨著工業(yè)制造技術(shù)的進(jìn)步，全球的精細(xì)化工產(chǎn)品已達(dá)7萬(wàn)多種［1］，不僅能夠滿(mǎn)足人們的日常所需，同時(shí)也推動(dòng)了經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展。但是，大規(guī)模的化工生產(chǎn)導(dǎo)致化石資源（如煤炭、石油等）短缺，環(huán)境污染（如溫室效應(yīng)、空氣污染等）加重，極大限制了未來(lái)經(jīng)濟(jì)的快速、綠色、可持續(xù)發(fā)展，打破了地球原有的生態(tài)平衡，威脅到人類(lèi)的正常生活。因此，迫切需要發(fā)展綠色制造手段，彌補(bǔ)化工生產(chǎn)的不足，輔助推動(dòng)傳統(tǒng)工業(yè)制造大變革［2］。20 世紀(jì)伊始，生物制造被廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥領(lǐng)域，已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)乙醇、丙酮等常見(jiàn)化工產(chǎn)品或抗生素等藥品的生物轉(zhuǎn)化。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和發(fā)酵工程領(lǐng)域的發(fā)展，利用常規(guī)生物系統(tǒng)，結(jié)合基因工程化改造和多樣化的發(fā)酵手段，高效利用一碳化合物（甲烷、甲酸、甲醇與二氧化碳等）生物合成高附加值化學(xué)品，逐漸成為生物制造領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

一碳底物（one-carbon，C1）是一類(lèi)具有單個(gè)碳原子的化合物，可分為：氣態(tài)C1化合物，包括甲 烷（methane， CH4）、 二 氧 化 碳（carbon dioxide， CO2）、 一 氧 化 碳（carbon monoxide，CO）；液態(tài)C1化合物，包括甲醇（methanol，CH3OH）、 甲 醛（formaldehyde，HCOH）、甲 酸（formate，HCOOH）［3］。上述一碳底物都具有來(lái)源廣泛、制備容易、價(jià)格低廉的特點(diǎn)，各自的特點(diǎn)決定了其在生物制造領(lǐng)域的應(yīng)用前景。首先，基于CO 的研究，大多聚焦以合成氣作為底物（CO 為主，含有H2、CO2等的混合氣體），利用氣態(tài)有氧或無(wú)氧發(fā)酵，實(shí)現(xiàn)化合物的生產(chǎn)［4］。但是，目前該方式存在的問(wèn)題有產(chǎn)品種類(lèi)較少（如乙醇、乙酸、2，3-丁二醇），產(chǎn)量較低，所用菌株多為楊氏梭菌（Clostridium ljungdahlii），不利于工程化改造［5］，因此本文不做重點(diǎn)討論。CH4和CO2作為溫室效應(yīng)的主要?dú)怏w，高效利用二者不僅可以緩解能源問(wèn)題，還可以緩解溫室效應(yīng)，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。但是，由于CO2本身較弱的親電性而不易被激活，非自養(yǎng)生物在以CO2作為C1底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化時(shí)，面臨著能量供應(yīng)缺乏、代謝供應(yīng)不足、轉(zhuǎn)化效率低、高能耗等多種問(wèn)題［3］，因此，當(dāng)前的研究大多聚焦于提高固碳效率［6-7］，CO2的催還還原［8］，CO2和甲酸的共應(yīng)用［7-8］等方面，力求實(shí)現(xiàn)非自養(yǎng)微生物能夠高效利用CO2生長(zhǎng)，而僅以CO2作為碳源和能源進(jìn)行化學(xué)品的高效生產(chǎn)鮮有報(bào)道。與CO2相比，甲烷作為天然氣的主要成分，其本身富含能量、具有更強(qiáng)的還原性，在生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中能夠獲得更高的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率，美中不足，氣態(tài)的甲烷不易存儲(chǔ)和運(yùn)輸，且生物發(fā)酵過(guò)程中，氣液界面物質(zhì)交換的低速傳遞限制了其高效的生物利用。甲酸和甲醇均可來(lái)源于甲烷的氧化、劣質(zhì)煤炭和生物廢料的轉(zhuǎn)化、CO2的還原等方式，二者來(lái)源豐富且富含高能，是生物轉(zhuǎn)化的理想原材料［8-9］。相比于價(jià)格較為昂貴的甲酸，甲醇作為全球五大商品之一，其制備方式容易且多樣化［10］，使得其成本日漸低廉，逐漸成為上述C1化合物中最具工業(yè)化應(yīng)用潛力的底物原材料，因而大量研究聚焦于甲醇的生物轉(zhuǎn)化。因此，針對(duì)豐富的C1底物，挖掘并構(gòu)建高效的微生物細(xì)胞工廠(chǎng)，是推進(jìn)C1化合物生物利用的關(guān)鍵。

甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物（methylotrophs）是一類(lèi)能夠利用C1化合物（甲醇、甲烷、甲酸和其他甲基化物質(zhì)）作為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)的微生物［11］，大致可分為兩類(lèi)：天然甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物和合成甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物。天然甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物可以通過(guò)自身的代謝途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)C1化合物的利用，而合成甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物是結(jié)合豐富的基因編輯手段，改造模式微生物，使其利用C1化合物高效生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物。因此，探尋并發(fā)掘天然的甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物，解析其C1化合物的代謝途徑，不僅有利于化合物的生產(chǎn)，也為后續(xù)打造合成甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物奠定基礎(chǔ)；打造合成甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物，不僅有利于拓寬C1底物的利用范圍，增強(qiáng)C1底物的利用率，而且有利于增加C1底物生物制造可行性，二者相輔相成。

因此，本文結(jié)合現(xiàn)有的研究成果，介紹了天然甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物利用甲醇、甲烷、甲酸和二氧化碳作為底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵酶和代謝途徑，并概括了據(jù)此形成的多種化學(xué)品。其次，介紹了基于大腸桿菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）3 種常見(jiàn)的微生物構(gòu)建合成甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物的多種形式及相應(yīng)產(chǎn)物；最后，探討了當(dāng)前重點(diǎn)研究的CO2、CH3OH、HCOOH 3 種C1底物進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化所面臨的瓶頸與挑戰(zhàn)，以期為后續(xù)的研究提供方向。

1 天然甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)

目前，研究發(fā)現(xiàn)多種天然甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物，通過(guò)自身的代謝途徑實(shí)現(xiàn)對(duì)一碳化合物的利用。整體代謝網(wǎng)絡(luò)大致上可分為3個(gè)模塊：一碳底物的氧化模塊（即甲烷、甲醇、甲醛的氧化）、同化模塊（即C1化合物進(jìn)入中心代謝的途徑）、異化模塊（即甲烷等一碳物質(zhì)最終轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2）［12］。甲烷、甲醇、甲酸和CO24 種一碳底物的代謝網(wǎng)絡(luò)一脈相承，甲烷和甲醇經(jīng)相應(yīng)的氧化酶（如甲烷氧化酶、甲醇氧化酶等）轉(zhuǎn)變后，均會(huì)形成甲醛，甲醛作為大多數(shù)甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物一碳代謝網(wǎng)絡(luò)的中心代謝物，既可介導(dǎo)同化途徑實(shí)現(xiàn)C1底物的生物利用，也可氧化形成甲酸，并經(jīng)過(guò)甲酸脫氫酶生成CO2，有助于微生物脫毒（圖1）。其中，同化途徑作為主要的C1代謝模式，有氧條件下，主要包括

圖1 天然C1利用途徑Fig.1 C1 metabolic networks of native methylotrophs

續(xù)表

續(xù)表

1.1 一碳化合物的氧化模塊

1.1.1 甲烷的氧化

甲烷氧化菌中存在的甲烷氧化酶（methane monooxygenase，MMO）可以轉(zhuǎn)變甲烷為甲醇，主要有兩種形式：微粒型MMO（particulate MMO，pMMO）和可溶型MMO（soluble MMO，sMMO）［54］。前者廣泛存在于甲烷營(yíng)養(yǎng)菌中，是一種膜結(jié)合蛋白，但是該酶反應(yīng)所需的輔因子尚未清晰；后者僅存在于特定類(lèi)型的甲烷氧化菌中，需要NADH作為輔因子提供還原力；同時(shí)具有兩種MMO 的甲烷氧化菌，其MMO 的表達(dá)受到胞內(nèi)銅離子濃度的影響，銅離子濃度高，主要表達(dá)pMMO，銅離子濃度低，主要表達(dá)sMMO［55］。研究表明在細(xì)胞中表達(dá)pMMO 和sMMO 后，pMMO 對(duì)甲烷的氧化效率更高，細(xì)胞生長(zhǎng)率強(qiáng)于sMMO［54］。

1.1.2 甲醇的氧化

甲醇氧化為甲醛是甲醇生物利用的限速步驟。前期研究表明，天然的甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物將甲醇轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹饕? 種甲醇利用酶：NAD 依賴(lài)的甲醇脫氫酶（methanol dehydrogenase，MDH）、吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）依賴(lài)的MDH、N，N-二甲基-4-亞硝基苯胺-氧化還原酶（N，N-dimethyl-4-nitrosoaniline oxidoreductase，MNO）及醇氧化酶（alcohol oxidase，AOX）［11］。前3 種存在于細(xì)菌中，AOX 主要存在于甲醇酵母當(dāng)中。PQQ 依賴(lài)的MDH 主要存在于革蘭氏陰性菌中（如Methylophilus methylotrophus），還原型PQQ（PQQH2）首先轉(zhuǎn)移2 個(gè)電子至呼吸鏈上的細(xì)胞色素CL，然后經(jīng)由細(xì)胞色素CL 傳遞2 個(gè)電子至最終電子受體，即氧化酶［56］，此時(shí)該酶轉(zhuǎn)化O2為水。天然甲醇酵母利用AOX 將甲醇轉(zhuǎn)化為甲醛，在此過(guò)程中，O2轉(zhuǎn)變?yōu)楦碑a(chǎn)物過(guò)氧化氫，有毒的過(guò)氧化氫被催化酶（catalase，CTA）分解成水和O2；值得注意的是AOX 和CTA 均定位在過(guò)氧化物酶體中，甲醇氧化過(guò)程也發(fā)生在過(guò)氧化物酶體中［57］。甲醇氧化酶-MNO 存在于部分革蘭氏陽(yáng)性甲基營(yíng)養(yǎng)菌（如Amycolatopsis、Mycobacterium）中［58］，與NADPH 結(jié)合緊密［59］，結(jié)構(gòu)與Ⅲ型乙醇脫氫酶類(lèi)似［60］。NAD 依賴(lài)的MDH 主要來(lái)自于革蘭氏陽(yáng)性甲基營(yíng)養(yǎng)菌（如Bacillus），轉(zhuǎn)化過(guò)程中產(chǎn)生NADH，可存儲(chǔ)于細(xì)胞中用于其他的代謝活動(dòng)［56］。此外，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)甲醛被快速消耗并維持在較低水平時(shí)，NAD-MDH 活性更佳，對(duì)甲醇的氧化能力更 強(qiáng)［56］。因 此，相 比 于PQQ-MDH 和AOX，NAD-MDH 在有氧和無(wú)氧條件下均具有氧化活性且反應(yīng)機(jī)制容易，具有更加高效的能量轉(zhuǎn)化能力［61］，已被廣泛應(yīng)用于合成甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物代謝底盤(pán)的構(gòu)建。

當(dāng)前，來(lái)自于B.methanolicus的NAD-MDH［62］已被成功用于E.coli甲醇代謝底盤(pán)的構(gòu)建［63-64］。該酶活性依賴(lài)于內(nèi)源的激活蛋白（anendogenousactivator，ACT），它可促進(jìn)MDH 對(duì)甲醇的利用，但酶本身對(duì)于甲醇的親和力較低，而對(duì)乙醇的親和力更高［56］，因而所構(gòu)建的工程菌甲醇轉(zhuǎn)化率較低。為了進(jìn)一步提高甲醇轉(zhuǎn)化率，眾多研究聚焦于該酶的篩選、挖掘、工程化改造，以期得到高效的NAD-MDH。James C.Liao 實(shí) 驗(yàn) 室［65］2016 年 報(bào) 道 了 來(lái) 源 于Cupriavidus necatorN-1 的NAD 依賴(lài)的甲醇脫氫酶（Mdh2），該酶來(lái)源于革蘭氏陰性菌，可產(chǎn)生NADH，對(duì)甲醇的親和力明顯高于B.methanolicus，且不依賴(lài)于內(nèi)源激活蛋白，特異性較強(qiáng)；隨后，作者通過(guò)多輪易錯(cuò)PCR 構(gòu)建Mdh2突變體文庫(kù)，結(jié)合高通量篩選的方式，得到的Mdh2 CT4-1 對(duì)甲醇的親和力比原先提高6 倍，Kcat/Km［L/（mol·s）］達(dá)到9.3（野生型為1.6），具有更好的催化活性和轉(zhuǎn)化效率。Whitaker 等［66］2017 年在E.coli中分別引入來(lái)自革蘭氏陽(yáng)性菌B.stearothermophilus的BsMdh和B.methanolicus的BmMdh2，發(fā)現(xiàn)BsMdh具有更強(qiáng)的甲醇轉(zhuǎn)化能力，通過(guò)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明BsMdh 的活性大約為16 mU/mg，而B(niǎo)mMdh2 的活性?xún)H為8 mU/mg。此外，David R.Liu 實(shí)驗(yàn)室［67］利用噬菌體輔助的非連續(xù)進(jìn)化的方式篩選BmMdh2 突變體，最終得到的BmMdh2 Q5L-A164P-A363L 突變體活性提高了3.5 倍，Kcat/Km［L/（mol·s）］達(dá)到1.08（野生型為0.23），但是低于CnMdh2 CT4（4.77）；隨后，作者進(jìn)一步通過(guò)體內(nèi)同位素標(biāo)記實(shí)驗(yàn)證明，在該酶的作用下，經(jīng)過(guò)13C 標(biāo)記的甲醇進(jìn)入中心碳代謝的比例高于對(duì)照菌株（BmMdh wt、CnMdh2 CT4-1）2 倍多，說(shuō)明雖然突變體活性低于Mdh2CT4-1，但是體內(nèi)的甲醇利用率明顯提高。

1.1.3 甲醛的氧化

甲醛是甲醇和甲烷作為C1底物進(jìn)入中心代謝進(jìn)行生物合成的中間代謝物，高濃度甲醛會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，因此高效的甲醛代謝系統(tǒng)可以促進(jìn)細(xì)胞對(duì)甲醇和甲烷的利用。大多細(xì)胞具有自身的甲醛氧化酶（formaldehyde dehydrogenase，F(xiàn)ADH），可氧化甲醛形成甲酸，再經(jīng)由甲酸脫氫酶形成CO2，完成甲醛代謝，促進(jìn)微生物有效脫毒［61］。根據(jù)所需的輔助因子，F(xiàn)ADH 可分為4 類(lèi)：①需要NAD 作為輔助因子，包括僅以NAD 作為輔因子的FADH［68］、NAD-GSH 雙 輔 因 子FADH［57，69］、NAD-硫醇依賴(lài)性FADH［70］；②不需要輔因子，可直接氧化甲醛；③細(xì)胞色素輔助的FADH（如PQQ-FADH），該類(lèi)FADH 通常不是甲醛特異性酶，源自甲基營(yíng)養(yǎng)菌，活性較低［70］；④四氫葉酸（tetetrahydrofolate，THF）、四氫甲氨蝶呤（tetrahydromethanopterin，H4MPT）作為輔助因子，該途徑是最常見(jiàn)的甲醛氧化途徑，廣泛存在于多種甲基營(yíng)養(yǎng)菌中。此過(guò)程中，以THF 或H4MPT 作為輔因子的微生物，甲醛經(jīng)過(guò)亞甲基-THF（H4MPT）-脫 氫 酶［methylene-THF（H4MPT）dehydrogenase，Mtd］、亞甲基-THF（H4MPT）-環(huán)化酶［methenyl-H4MPT cyclohydrolase，Mch］，分別形成帶有THF和H4MPT 的甲?；衔铮磺罢呓?jīng)過(guò)甲酰-THF合成酶（formyl-THF synthase，F(xiàn)hs）形成甲酸；后者經(jīng)過(guò)甲酰-H4MPT 轉(zhuǎn)移/水解復(fù)合體［formyl-THF（H4MPT）transferase/hydrolase-complex， Fhc］形成甲酸［70］?？傊捎诩兹┒拘詫?duì)微生物正常生長(zhǎng)的影響，其體內(nèi)均形成多種代謝甲醛的形式，為C1底物的生物利用提供了更多有效的研究策略。

1.1.4 甲酸的氧化

甲酸脫氫酶（formate dehydrogenase，F(xiàn)DH）廣泛存在于多種微生物中，可氧化甲酸為CO2，是細(xì)胞脫毒的最后一步，也是C1底物異化途徑的最后一步。目前發(fā)現(xiàn)的甲酸脫氫酶可利用THF、NAD、NADP［71］、細(xì)胞色素等作為輔助因子，所生成的NADH或NADPH 可用于細(xì)胞其他的生命活動(dòng)；以THF 作為輔因子的甲酸營(yíng)養(yǎng)菌，通過(guò)rACoA途徑即可實(shí)現(xiàn)微生物利用甲酸進(jìn)行生長(zhǎng)。

1.2 天然甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物的代謝途徑

1.2.1 RuMP和XuMP途徑

RuMP、XuMP 雖然存在于不同類(lèi)型的甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物中，但本質(zhì)上十分相似，都是甲醛結(jié)合五碳糖進(jìn)行碳原子重排，一碳分子經(jīng)由糖酵解途徑完成碳流向下傳遞的過(guò)程，而五碳糖再生保證循環(huán)持續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)［61］。前者利用5-磷酸核酮糖（ribulose 5-phosphate，Ru5P）作為底物，甲醛經(jīng)由己糖磷酸合成酶（hexulose phosphate synthase，HPS）轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸己酮糖（hexulose 6-phosphate，H6P）后，再通過(guò)磷酸己糖異構(gòu)酶（phosphohexulose isomerase，PHI）轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸果糖（fructose-6-phosphate，F(xiàn)6P）進(jìn)入中樞碳代謝。后者利用5-磷酸木酮糖（xylulose 5-phophate，Xu5P）作為底物，二羥丙酮合成酶（dihydroxyacetone synthase，DAS）可將甲醛和Xu5P 轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸甘油醛（glyceraldehyde-3-phosphate，G3P）和二羥丙酮（dihydroxyacetone，DHA），DHA 可利用二羥丙酮激酶（dihydroxyacetone kinase，DHAK）進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成DHAP，從而進(jìn)入中心代謝。

RuMP途徑中，3 mol甲醛形成1 mol丙酮酸時(shí)，伴隨G3P、Xu5P 和4-磷酸赤蘚糖（erythrose-4-phosphate，E4P）的形成；此外，已有研究報(bào)道，B.methanolicus［72］和P.pastoris［73］中均 存 在兩 種酶，1，7-雙磷酸景天庚糖酶（sedoheptulose 1，7-bisphosphatase，SBP） 和 轉(zhuǎn) 醛 酶（transaldolase，TAL），前者可將1，7-雙磷酸景天庚糖轉(zhuǎn)變?yōu)?-磷酸景天庚糖（sedoheptulose-7-phosphate，S7P），后者將F6P 和E4P 轉(zhuǎn)變?yōu)镾7P 和G3P；S7P 和G3P 經(jīng)由轉(zhuǎn)酮酶（transketolase，TKL）重新轉(zhuǎn)變?yōu)閄u5P 和5-磷酸核糖（ribose 5-phosphate，R5P），從而完成五碳糖的再生循環(huán)。因此，將磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway， PPP） 與RuMP 或XuMP相結(jié)合，加速五碳糖的再生，是提高C1底物利用率的常用策略，如Bennett等［74］通過(guò)表達(dá)多個(gè)PPP途徑的酶提高內(nèi)源Ru5P的含量，詳見(jiàn)表2。

表2 合成甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)胞工廠(chǎng)及其產(chǎn)物Tab.2 Chemicals produced by synthetic methylotrophs

續(xù)表

XuMP 途徑是甲醇酵母的主要甲醇代謝途徑，其中涉及的AOX、CTA 及DAS 均定位在過(guò)氧化酶體中，DAS 活性可被葡萄糖抑制，被甲醇所誘導(dǎo)［57］。由于甲醇酵母中，甲醇代謝主要發(fā)生在過(guò)氧化物酶體中，區(qū)室化作用有利于降低甲醛毒性，可顯著提高化合物產(chǎn)量，如番茄紅素［84］。當(dāng)前，P.pastoris已被用于多種化合物和蛋白質(zhì)的生物合成（表1），如洛伐他?。?0］、透明質(zhì)酸［17］等；關(guān)于漢遜酵母的研究較少，如利用漢遜酵母生產(chǎn)青霉素［22］。最近，大連化物所的周雍進(jìn)研究組［85］開(kāi)發(fā)了高效的漢遜酵母基因編輯工具，能夠有效提高其同源重組效率，并利用其進(jìn)行脂肪醇的生物合成研究。

表1 天然甲基營(yíng)養(yǎng)型細(xì)胞工廠(chǎng)及其產(chǎn)物Tab.1 Chemicals produced by native methylotrophs

1.2.2 Serine途徑和GLRP途徑

廣義的絲氨酸途徑主要包括3 個(gè)部分：第1 部分是以C1化合物（甲烷、甲醇或甲醛）起始，經(jīng)過(guò)多級(jí)氧化反應(yīng)，形成亞甲基-THF（CH2-THF）的中間產(chǎn)物。第2 部分是以甘氨酸（C2）起始，結(jié)合1 分子CH2-THF，形成絲氨酸（C3），C3化合物經(jīng)過(guò)一系列轉(zhuǎn)化后，形成磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP），隨后羧化引入1 分子CO2，形成C4化合物草酰乙酸（oxaloacetate，OAA），OAA 經(jīng)過(guò)蘋(píng)果酸脫氫酶轉(zhuǎn)變?yōu)樘O(píng)果酸（C4）（malate，MAL）。經(jīng)過(guò)上述兩部分后，完成兩種C1化合物的利用。第3部分主要是乙醛酸的再生過(guò)程。MAL在蘋(píng)果酸硫激酶（malate thiokinase，MTK）的作用下，形成蘋(píng)果酸單酰-CoA。隨后蘋(píng)果酸單酰-CoA 被分解為C2化合物乙醛酸和乙酰CoA，乙醛酸經(jīng)過(guò)絲氨酸-乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶（serine glyoxylate aminotransferase，SGA）形成甘氨酸，從而構(gòu)成完整的絲氨酸循環(huán)［11］。

細(xì)胞中，乙酰CoA 參與多種生命活動(dòng)，而經(jīng)典的乙醛酸循環(huán)［86］可以利用乙酰CoA 和OAA 作為底物，經(jīng)過(guò)檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）、順烏頭酸酶（aconitase，AT）和異檸檬酸裂解酶（isocitrate lyase，ICL），再生成琥珀酸和乙醛酸。但是，部分甲基營(yíng)養(yǎng)菌（如M.extorquens）中缺乏異檸檬酸裂解酶，乙醛酸的再生是通過(guò)乙基丙二酰CoA 途徑（ethylmalonyl-CoA，EMC）完成的，該途徑也被稱(chēng)為GLRP［11，86］。EMC 途徑不僅存在于天然甲基營(yíng)養(yǎng)菌中，部分非甲基營(yíng)養(yǎng)菌也擁有該途徑，如紅桿菌（Rhodobacter）和鏈霉菌（Streptomyces）。該途徑大約有10 步反應(yīng)，中間產(chǎn)物涉及C2、C3、C4化合物，包括多種獨(dú)特的輔酶A中間體，可用于多種工業(yè)化合物的生產(chǎn)［87］，如聚羥基烷酸酯（polyhydroxyalkanoate，PHA）、3-羥基丁酸（3-hydroxybutyrate，3-HB）［30］、3-羥基丙酸（3-hydroxypropionic acid，3-HP）［36］等，見(jiàn)表1。

1.2.3 rACoAP途徑

許多天然的甲酸和甲烷營(yíng)養(yǎng)菌中均存在還原型乙酰CoA 途徑，即Wood-Ljungdahl pathway，該類(lèi)菌株可以利用甲酸作為唯一碳源和能源進(jìn)行生長(zhǎng)。該途徑中，以THF 作為輔助因子，甲酸轉(zhuǎn)變?yōu)镃H2-THF 后，可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為5-甲基-THF。隨后，結(jié)合CO 和CoA 直接形成乙酰CoA，乙酰CoA 在丙酮酸合酶（pyruvate synthase，PC）的作用下，羧化結(jié)合1 分子CO2，最終形成丙酮酸［88］。在此過(guò)程中，不僅可以利用甲酸，同時(shí)可以結(jié)合2分子CO2（CO 可來(lái)源于CO2），具有充分的一碳利用能力。能量方面，雖然該過(guò)程第1步（甲酸轉(zhuǎn)化為甲酰-THF）需要消耗1分子ATP，但是隨后可產(chǎn)生NADPH 用于后續(xù)能量供應(yīng)。目前，已有研究報(bào)道利用該途徑進(jìn)行香葉醇的生物合成［53］。

1.2.4 CBB途徑和rPPC途徑

存在另一種廣義的CBB循環(huán)，又稱(chēng)為還原型磷酸戊糖循環(huán)（reductive pentose phosphate cycle，rPPC），是甲酸營(yíng)養(yǎng)菌（Cupriavidus necator）［8］和少數(shù)甲烷營(yíng)養(yǎng)菌［89］的另一種固碳形式。甲酸氧化形成CO2后，結(jié)合1，5-二磷酸核酮糖（ribulose-1，5-bisphosphate，RuBP）在1，5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶（ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase，RuBisCo）的作用下，轉(zhuǎn)變?yōu)镚3P進(jìn)入中心碳代謝途徑。但是，該途徑需要消耗過(guò)多的還原力和ATP，既不經(jīng)濟(jì)，也不利于微生物生長(zhǎng)［88］。最近有研究報(bào)道，在P.pastoris中引入RuBisCO 和磷酸核酮糖激酶（phosphoribulokinase，PRK），首次實(shí)現(xiàn)天然甲醇酵母利用CO2作為唯一碳源即可生長(zhǎng)［90］。

2 合成甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物的代謝網(wǎng)絡(luò)

天然的甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物具有豐富的C1代謝酶和代謝途徑，理論上，據(jù)此構(gòu)建下游的生物合成途徑，即可實(shí)現(xiàn)微生物利用C1底物作為唯一的碳源和能源支撐生長(zhǎng)并高產(chǎn)目標(biāo)化合物。但是，由于天然的甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物存在數(shù)據(jù)庫(kù)資源和遺傳信息不完善、基因編輯工具缺乏與產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率低下等問(wèn)題，使C1底物大規(guī)模應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)這一目標(biāo)至今沒(méi)有實(shí)現(xiàn)。因此，結(jié)合天然甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物中發(fā)現(xiàn)的C1代謝途徑，如RuMP、絲氨酸途徑，賦予模式微生物對(duì)C1化合物的高效利用能力，從頭構(gòu)建合成型甲基營(yíng)養(yǎng)微生物，并實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的高產(chǎn)，逐漸成為研究熱點(diǎn)。此外，近幾年的研究中，通過(guò)計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)全新的酶蛋白，打造人造C1代謝途徑，亦成為高效利用C1底物的又一有效策略。當(dāng)前，大多數(shù)研究均在E.coli當(dāng)中開(kāi)展，僅有少量研究以C.glutamicum和S.cerevisiae作為研究對(duì)象，研究的主要內(nèi)容包括兩個(gè)：①以C1底物作為唯一碳源和能源支撐微生物快速生長(zhǎng)，涉及的C1底物為甲醇、甲酸和CO2；②高效利用甲醇和CO2（甲酸輔助）進(jìn)行生物合成。因此，本部分概括了上述3種模式生物作為研究對(duì)象，針對(duì)兩個(gè)主要研究?jī)?nèi)容，所進(jìn)行的代謝網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和生物合成探究。

2.1 大腸桿菌

目前，E.coli是研究最深入的原核模式生物，多種C1底物（甲醇、甲酸、CO2）的生物利用已經(jīng)在E.coli中陸續(xù)開(kāi)展。其中，關(guān)于甲醇的研究成果最為豐富，涉及代謝途徑的挖掘、代謝底盤(pán)的改造與優(yōu)化、共培養(yǎng)底物的優(yōu)化、生物合成化合物等多個(gè)方面，并且已有研究報(bào)道E.coli可以利用甲醇作為唯一碳源和能源正常生長(zhǎng)［91］。關(guān)于甲酸和CO2的研究成果相對(duì)較少，研究側(cè)重于甲酸或CO2的充分利用、已知代謝途徑的改造及新途徑的挖掘［92］，當(dāng)前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)E.coli可以利用甲酸［93］或CO2［94-95］作為唯一碳源生長(zhǎng)，但是生長(zhǎng)情況較弱，有待進(jìn)一步提高。

2.1.1 甲醇

工程化改造E.coli，形成合成型甲醇營(yíng)養(yǎng)菌的研究策略可以分為兩種：引入天然甲醇利用通路和打造全新的甲醇代謝途徑。前一種主要是通過(guò)引入或塑造天然存在的甲醇利用途徑（如RuMP、XuMP），結(jié)合代謝底盤(pán)的輔助改造，代謝流微調(diào)，底物和發(fā)酵條件優(yōu)化，目標(biāo)產(chǎn)物合成途徑的構(gòu)建等，最終實(shí)現(xiàn)E.coli能夠在含有甲醇的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)并合成目標(biāo)產(chǎn)物；后一種主要是結(jié)合計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)和蛋白質(zhì)工程，發(fā)現(xiàn)能夠提升甲醇代謝能力或縮短已知代謝途徑的酶，從而打造全新的甲醇代謝途徑，彌補(bǔ)天然途徑中的不足，以期實(shí)現(xiàn)更高的甲醇利用效率，包括甲醇縮合循環(huán)（methanol condensation cycle， MCC）、 甲 醛 酶途徑（formolase，F(xiàn)LS）、合成型乙酰CoA 途徑（synthetic acetyl-CoA，SACA）、羥酰輔酶A裂解酶途徑（2-hydroxyacyl-CoA lyase，HACL）、修飾絲氨酸循環(huán)（modified serine cycle，MSC）（圖2）。

圖2 合成C1利用途徑Fig.2 C1 metabolic networks of synthetic methylotrophs

天然甲醇利用途徑在前面已經(jīng)有詳細(xì)的介紹，不再贅述。當(dāng)前，大量研究聚焦于整合RuMP 于E.coli中，以期實(shí)現(xiàn)E.coli利用甲醇作為唯一碳源和能源支撐微生物生長(zhǎng)；2015 年的研究通過(guò)在E.coli中整合多種不同來(lái)源的RuMP 中的關(guān)鍵基因，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于B.methanolicus菌株的MDH2、HPS、PHI能夠更好地利用甲醇［63］；2018 年的研究表明，通過(guò)增強(qiáng)甲醛的消耗，降低TCA 代謝，減少NADH 的產(chǎn)生可以促進(jìn)甲醇利用［96］；隨后，通過(guò)在E.coli中加入甲醛感應(yīng)元件，降低NADH 的產(chǎn)生，并加強(qiáng)Ru5P 的再生，進(jìn)一步提高甲醇的利用［97］；2020 年8 月，Liao 團(tuán)隊(duì)［91］發(fā)表在Cell上的文章，首次實(shí)現(xiàn)了甲醇作為唯一碳源支持E.coli生長(zhǎng)，并且在8.5 h 中OD 值可達(dá)到2。上述研究從“零”到有實(shí)現(xiàn)了E.coli利用甲醇作為唯一碳源支撐微生物生長(zhǎng)的能力。此外，已有眾多研究報(bào)道E.coli利用甲醇（葡萄糖或酵母提取物作為輔助碳源）進(jìn)行生物合成，對(duì)底盤(pán)的改造均以RuMP途徑為基礎(chǔ)，包括柚皮素、乙醇、丙酮、琥珀酸、賴(lài)氨酸等，見(jiàn)表2，但是均未實(shí)現(xiàn)甲醇作為唯一碳源。值得關(guān)注的是，2018年Nature Communications首次報(bào)道了基于MSC 構(gòu)建合成型甲醇營(yíng)養(yǎng)菌生成乙醇，此前大多改造均利用RuMP途徑，因而該文章是天然甲醇利用途徑的應(yīng)用突破［79］。

最早的合成途徑來(lái)自L(fǎng)iao 實(shí)驗(yàn)室的MCC 途徑，其將非氧化糖酵解（nonoxidative glycolysis，NOG）途徑和RuMP 途徑結(jié)合，利用體外無(wú)細(xì)胞體系實(shí)現(xiàn)甲醇的利用。該途徑中，F(xiàn)6P或X5P可通過(guò)一步反應(yīng)直接生成乙酰磷酸，隨后轉(zhuǎn)化為乙酰CoA，不僅避免丙酮酸脫羧所造成的碳損失，同時(shí)減少ATP 的消耗；但是至今沒(méi)有研究報(bào)道該途徑在體內(nèi)的應(yīng)用情況。隨后，美國(guó)David Baker 實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并人工合成了以甲醛酶為核心的FLS 途徑，僅通過(guò)2 步即可實(shí)現(xiàn)甲醛到二羥丙酮磷酸（dihydroxyacetone phosphate，DHAP）的轉(zhuǎn)化（消耗1 分子ATP），而RuMP 途徑中從甲醛到DHAP需要4步反應(yīng)，因而該反應(yīng)極大縮短了C1底物進(jìn)入中樞代謝的步驟；同時(shí)，此途徑可以甲酸作為底物，經(jīng)過(guò)乙酰CoA 合成酶（acetyl-CoA synthase，ACS）和乙醛脫氫酶（acetaldehyde dehydrogenase，ACDH）轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹?，過(guò)程中需要消耗1 分子NADH［98］。2019 年報(bào)道了兩條合成途徑，一條來(lái)自天津工業(yè)生物技術(shù)研究所江會(huì)峰團(tuán)隊(duì)［99］報(bào)道的SACA 途徑，通過(guò)計(jì)算設(shè)計(jì)合成的乙醇醛合成酶（glycolaldehyde synthase，GALS）、乙酰磷酸合成酶（acetyl-phosphate synthase，ACPS）可以通過(guò)三步反應(yīng)快速轉(zhuǎn)化甲醛為乙酰CoA，不需要消耗ATP、無(wú)碳損失，可惜的是文章中僅在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了該途徑的作用，而在E.coli中沒(méi)有明顯的甲醇利用效果；另一條途徑來(lái)自美國(guó)Ramon 實(shí)驗(yàn)室所設(shè)計(jì)的HACL 途徑，該實(shí)驗(yàn)室篩選兩種酶，RuHACL和?；o酶A還原酶（acyl-CoA reductase，ACR），首次實(shí)現(xiàn)C1化合物甲醛至C2化合物乙醇酸（glycolate）的轉(zhuǎn)變，該途徑同樣可用甲酸為底物，經(jīng)由甲酰CoA轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹?1］。

2.1.2 甲酸和二氧化碳

目前，E.coli主要是通過(guò)還原型甘氨酸途徑（reductive glycine pathway，rGlyP）利用甲酸和CO2，僅有少量研究借助CBB循環(huán)實(shí)現(xiàn)一碳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。首先，rGlyP 可以利用甲酸和CO2兩種C1化

合物，代謝途徑整體結(jié)構(gòu)與rACoAP 類(lèi)似，同樣是借助THF 作為輔助因子，通過(guò)引入THF 循環(huán)，從而實(shí)現(xiàn)甲酸和CO2的利用［8］。該途徑有3 個(gè)優(yōu)點(diǎn)：①僅通過(guò)一個(gè)酶，甘氨酸裂解酶復(fù)合體（glycine cleavage system，GCS）即可完成中間產(chǎn)物CH2-THF向C2甘氨酸的轉(zhuǎn)化，而rACoAP涉及眾多輔助酶且許多至今未知。②與絲氨酸途徑和CBB 途徑相比，該途徑更加經(jīng)濟(jì)節(jié)能，具有高效的甲酸利用能力；該途徑產(chǎn)生1 分子乙酰CoA 需要消耗6 分子甲酸，而前兩者分別需要11 分子甲酸和7 分子甲酸［8］。③該途徑的中間產(chǎn)物（甘氨酸、絲氨酸）與中心代謝關(guān)聯(lián)較少，不像rACoAP（乙酰CoA）和絲氨酸途徑（蘋(píng)果酸、乙醛酸等）的中間產(chǎn)物與多種代謝有密切聯(lián)系，因而可以避免考慮復(fù)雜的代謝流。2018年，Arren Bar-Even實(shí)驗(yàn)室［100-101］通過(guò)在E.coli中構(gòu)建rGlyP，在體內(nèi)證明了該途徑可以利用C1底物支撐微生物生長(zhǎng)。同年，Lee Sang Yup實(shí)驗(yàn)室［102］在E.coli中引入rGlyP 和FDH（Candida boidinii），首次實(shí)現(xiàn)了E.coli僅利用甲酸和CO2即可輕微生長(zhǎng)（不需要添加葡萄糖）。2020 年先后發(fā)表了兩篇文章，通過(guò)引入不同來(lái)源的酶構(gòu)建rGlyP，引入不同來(lái)源的FDH 達(dá)到提供能量和還原力的作用，均實(shí)現(xiàn)了E.coli利用甲酸作為唯一碳源支撐微生物生長(zhǎng)；2020年初的文章中，利用ALE實(shí)現(xiàn)改造菌株在甲酸和CO2中生長(zhǎng)的倍增時(shí)間不到8 h，生物量達(dá)到2.3 g CDW/mol 甲 酸［93］；Lee Sang Yup 實(shí) 驗(yàn)室［103］2020 年中所發(fā)表的文章是2018 年工作的延續(xù)，作者進(jìn)一步對(duì)底盤(pán)進(jìn)行改造，引入多種來(lái)源的FDH 并調(diào)整胞內(nèi)細(xì)胞色素泛素氧化酶（bo3、bd-I）的表達(dá)水平，最終菌株僅以甲酸和CO2作為碳源，OD 能夠在450 h 達(dá)到7.38（1.3 L 發(fā)酵罐）。關(guān)于利用CO2作為主要碳源的研究較少，現(xiàn)有的兩篇通過(guò)在E.coli中引入CBB 循環(huán)固定CO2；2016 年Ron Milo實(shí)驗(yàn)室首次實(shí)現(xiàn)E.coli利用CO2（丙酮酸作為輔助底物）合成中樞代謝的各種糖類(lèi)物質(zhì)，此時(shí)能量部分由丙酮酸所介導(dǎo)的TCA循環(huán)所提供［94］；2019年，該實(shí)驗(yàn)室利用CO2和甲酸一起作為底物，結(jié)合ALE，最終實(shí)現(xiàn)E.coli利用CO2作為唯一碳源支撐生長(zhǎng)的目的，此時(shí)由甲酸氧化提供能量［95］。

此外，研究發(fā)現(xiàn)了幾種人工改造的合成型甲酸和CO2利用途徑，目前關(guān)于這些途徑的研究多聚焦于體外研究，沒(méi)有被大量應(yīng)用于生物合成。大致可分為3類(lèi)：

（1）甲酸和CO2作為共同底物 包括絲氨酸-蘇氨酸循環(huán)（serine-threonine cycle，STC）、丙酮酸-甲酸裂解酶（pyruvate formate-lyase，PFL）-蘇氨酸循環(huán)（PFL-threonine cycle，PTC）、酮丁酸-甲酸裂解酶（ketobutyrate formate-lyase，KBFL）循環(huán)（KBFL cycle，KBFLC）。其中，STC 類(lèi)似與絲氨酸循環(huán)，THF 作為輔助因子，利用甲酸和固定CO2的方式與之相同，不同點(diǎn)在于OAA 裂解形成天冬氨酸而不是MAL；PTC 循環(huán)中甲酸的利用方式不同于STC 循環(huán)，不需要THF 作為輔助因子，甲酸和乙酰CoA 在PFL 的作用下直接形成丙酮酸；KBFLC 不同于上述途徑，丙酰-CoA 和甲酸在KBFL 的作用下2-酮丁酸，隨后固定無(wú)機(jī)碳源，終產(chǎn)物為乙醛酸（圖3）。

圖3 合成甲酸利用途徑Fig.3 Synthetic metabolic networks for formate utilization

（2）僅利用甲酸作為底物 如PFL-磷酸轉(zhuǎn)酮酶（phosphoketolase，PKT）循 環(huán)（PFL-PKT cycle，PPC），該途徑中，PKT 轉(zhuǎn)化Xu5P 為酰基磷酸和G3P，酰基磷酸可以轉(zhuǎn)化為乙酰CoA，從而和甲酸在PFL 的作用下形成丙酮酸；此外，甲酸可還原為甲醛，從而通過(guò)RuMP、FLS途徑代謝。

（3）僅以CO2作為底物 巴豆?；鵆oA-乙基丙二酰CoA-羥基丁酸?；鵆oA（crotonyl-CoA/ethylmalonyl-CoA/hydroxybutyryl-CoA，CETCH） 循環(huán)［104］。由于甲酸和CO2之間的相互轉(zhuǎn)化關(guān)系，賦予了上述途徑更加豐富的利用空間。

2.2 谷氨酸棒狀桿菌

目前，關(guān)于C.glutamicum的C1利用研究主要聚焦于甲醇的代謝。2013年Bott實(shí)驗(yàn)室［105］研究發(fā)現(xiàn)，C.glutamicum內(nèi)源存在甲醇轉(zhuǎn)化為CO2的一系列酶，乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADHA）可以催化甲醇轉(zhuǎn)變?yōu)榧兹兹┛捎梢胰┟摎涿福╝cetaldehyde dehydrogenase，ALD）或以硫醇作為輔因子的FADH（adhE）轉(zhuǎn)變?yōu)榧姿?，隨后甲酸經(jīng)內(nèi)源FDH（fdhF）轉(zhuǎn)變?yōu)镃O2；該文章首次完整展示了C.glutamicum中甲醛脫毒的所有基因，為后續(xù)的改造研究奠定了基礎(chǔ)。隨后的研究中，通過(guò)敲除adhE和ALD，阻斷C.glutamicum中甲醇至CO2的轉(zhuǎn)化途徑，并引入RuMP，以葡萄糖或核糖輔助甲醇利用，利用甲醇合成尸胺［75］；以木糖和甲醇作為主要碳源，生物合成谷氨酸［76-77］；2020年孫際賓團(tuán)隊(duì)［76］通過(guò)適應(yīng)性進(jìn)化，將菌株所耐受的甲醇濃度提高到15 g/L，且甲醇與木糖利用率為7.04∶1；大大提高了甲醇的利用效率。但是，截至目前，并沒(méi)有研究實(shí)現(xiàn)C.glutamicum以甲醇作為唯一碳源和能源支撐其生長(zhǎng)。

2.3 釀酒酵母

作為真核模式生物，S.cerevisiae具有詳細(xì)的基因信息，完善的數(shù)據(jù)庫(kù)和多樣的基因編輯工具，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞工廠(chǎng)的構(gòu)建。由于S.cerevisiae本身對(duì)甲醇和甲醛具有更高的耐受性［106］，因此S.cerevisiae在C1的生物轉(zhuǎn)化中具有廣闊的應(yīng)用前景。當(dāng)前，僅有少量文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于合成型“甲醇酵母”的研究，研究?jī)?nèi)容停留在S.cerevisiae的菌株選擇和生長(zhǎng)兩個(gè)方面，沒(méi)有實(shí)現(xiàn)任何一種C1化合物作為唯一底物原材料即可支撐微生物正常生長(zhǎng)目的。南京工業(yè)大學(xué)姜岷實(shí)驗(yàn)室［107］首次在S.cerevisiae中引入RuMP 和XuMP，賦予其對(duì)甲醇的利用能力，但是其在甲醇當(dāng)中的生長(zhǎng)能力有待提高。澳大利亞的Paulsen 實(shí)驗(yàn)室［108］結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，對(duì)比了兩類(lèi)常見(jiàn)的酵母品系（CEN.PK 和S288C）在甲醇當(dāng)中的生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)CEN.PK 更適合用于構(gòu)建合成型“甲醇酵母”。隨后，Paulsen實(shí)驗(yàn)室［109］發(fā)表在Nature Communications 的研究，通過(guò)對(duì)S.cerevisiaeCEN.PK113-5D 進(jìn)行適應(yīng)性進(jìn)化，發(fā)現(xiàn)其具有天然的甲醇利用能力，進(jìn)化后可在含有甲醇和酵母提取物的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。此外，Arren Bar-Even 實(shí) 驗(yàn)室［110］研究 表明，rGlyP 在S.cerevisiae中具有很強(qiáng)的甲酸代謝能力，該研究首次報(bào)道了S.cerevisiae通過(guò)rGlyP 利用甲酸和CO2。因此，根據(jù)已有的C1 代謝途徑重構(gòu)S.cerevisiae代謝底盤(pán)，并結(jié)合ALE，能夠進(jìn)一步發(fā)掘其對(duì)C1底物的利用潛力［111］。

3 結(jié)語(yǔ)

本綜述總結(jié)了基于天然和合成型甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物利用C1底物進(jìn)行生物合成的主要代謝網(wǎng)絡(luò)及現(xiàn)有產(chǎn)品。已發(fā)掘的天然甲基營(yíng)養(yǎng)菌大多直接利用甲醇或CO2作為C1底物，通過(guò)自身所具有的一磷酸核酮糖途徑、絲氨酸途徑和還原型乙酰CoA途徑，完成C1底物向中樞代謝的轉(zhuǎn)運(yùn)，產(chǎn)物主要為氨基酸類(lèi)（如絲氨酸、賴(lài)氨酸、谷氨酸等）、PHA 或PHB；天然甲醇酵母主要利用一磷酸木酮糖途徑，產(chǎn)物除了氨基酸和小分子有機(jī)酸，還有他汀類(lèi)藥物。雖然天然甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物能夠高效利用C1底物，但是缺乏完善的基因組信息和基因編輯工具，因而在進(jìn)一步提升底物利用率、目標(biāo)物產(chǎn)量及產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率方面，都具有較大的困難。當(dāng)前，隨著高通量測(cè)序和多組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，針對(duì)已被廣泛應(yīng)用的天然甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物建立數(shù)據(jù)庫(kù)，提供更加全面和豐富的基因信息，可以有效提高其生物合成的應(yīng)用范圍；此外，基于天然甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物開(kāi)發(fā)高效的基因編輯工具，提高菌株自身的同源重組效率，可以有效增加其用于生物合成的操作可行性。近年來(lái)，關(guān)于畢赤酵母的基因信息和數(shù)據(jù)庫(kù)資源日漸豐富，已有多項(xiàng)研究聚焦于優(yōu)化畢赤酵母的基因編輯方法，如開(kāi)發(fā)高效的CRISPRi（clustered regularly interspaced short palindromic repeat interference）系 統(tǒng)［112-113］；敲除Ku70（ATP 依賴(lài)的DNA 解旋酶）［114］、引入Rad52（DNA修復(fù)蛋白）提高非同源重組效率［115］；此外，針對(duì)天然甲基營(yíng)養(yǎng)菌的基因編輯手段也逐漸增多，如優(yōu)化CRISPRi系統(tǒng)中dCas9 啟動(dòng)子［116］、開(kāi)發(fā)sRNA（small regulatory RNA）系統(tǒng)用于抑制基因表達(dá)［117-118］。合成甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物能夠彌補(bǔ)其在基因編輯上的不足，但是卻存在C1底物利用效率低的問(wèn)題，導(dǎo)致微生物不能以甲醇或CO2作為唯一碳源和能源快速生長(zhǎng)。當(dāng)前，雖有少量研究實(shí)現(xiàn)E.coli利用甲醇或CO2進(jìn)行生長(zhǎng)，但是距離產(chǎn)物合成及工業(yè)化應(yīng)用還有較遠(yuǎn)的距離。目前，合成型甲基營(yíng)養(yǎng)微生物的研究策略主要依賴(lài)于代謝底盤(pán)的改造（如天然甲醇利用途徑的引入）、打造全新的代謝途徑（如還原型甘氨酸途徑，甲醛酶途徑）、關(guān)鍵酶的挖掘（如高效MDH 的篩選）、適應(yīng)性進(jìn)化（如葡萄糖、木糖等多底物偶聯(lián)進(jìn)化）等；最近的文章將納米材料應(yīng)用于CO2的固定，結(jié)合多條已有的C1利用途徑，有效提高了CO2的轉(zhuǎn)化效率，展示了納米材料在生物轉(zhuǎn)化研究中的應(yīng)用前景［119］，為未來(lái)的C1化合物的高效利用提供更有效的思路。

值得注意的是，兩種類(lèi)型的甲基營(yíng)養(yǎng)型微生物都面臨同樣的問(wèn)題，即底物毒性耐受性問(wèn)題。多種C1底物，如甲烷、甲醇的代謝網(wǎng)絡(luò)一脈相承，高度的相似性伴隨而來(lái)的是甲醛毒性的問(wèn)題，甲醛積累而引起的細(xì)胞毒性，是導(dǎo)致微生物不能正常生長(zhǎng)的根本原因，也限制了甲基營(yíng)養(yǎng)微生物底物利用率的提高［120］。因此加強(qiáng)細(xì)胞對(duì)毒性物質(zhì)的代謝能力，或者提高細(xì)胞對(duì)毒性物質(zhì)的耐受性，是實(shí)現(xiàn)C1底物高效利用的重中之重［121］。針對(duì)這一問(wèn)題，目前的主要手段均為適應(yīng)性進(jìn)化，雖然能夠在一定程度上提高微生物的甲醛耐受能力，但是所需時(shí)間較長(zhǎng)，且現(xiàn)有研究均沒(méi)有突破甲醛毒性所帶來(lái)的生長(zhǎng)限制；未來(lái)，利用多種誘變手段加快進(jìn)化速度，加強(qiáng)對(duì)甲醛致毒機(jī)制的剖析，同時(shí)結(jié)合不同微生物自身的特點(diǎn)（如酵母的區(qū)室化效應(yīng)）［122］，是微生物突破生長(zhǎng)瓶頸的有效途徑?？傊?，充分提升C1底物利用率和目標(biāo)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率，以生物制造推動(dòng)新型工業(yè)化改革，對(duì)世界經(jīng)濟(jì)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。