基于CRISPR/Cas工具的腫瘤基因線路構(gòu)建及應(yīng)用

宋斐，劉宇辰，蔡志明，黃衛(wèi)人

（1深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院，深圳市第二人民醫(yī)院，泌尿外科，廣東 深圳 518035；2廣東省泌尿生殖腫瘤系統(tǒng)生物學(xué)與合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 深圳 518035）

癌癥的發(fā)生和發(fā)展是多因素協(xié)同的結(jié)果，涉及復(fù)雜的信息網(wǎng)絡(luò)與許多信號(hào)分子的相互作用［1］。隨著對(duì)人類(lèi)基因組研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)基因表達(dá)調(diào)控并非孤立、單一事件，而是存在相互制約和影響［2］。因此，細(xì)胞信號(hào)通路的調(diào)控和干預(yù)通常復(fù)雜而困難，涉及動(dòng)態(tài)感知和多層次調(diào)控。近年來(lái)，基于多組學(xué)研究對(duì)腫瘤發(fā)展機(jī)制的解析以及腫瘤微環(huán)境的認(rèn)識(shí)，在針對(duì)性治療藥物的開(kāi)發(fā)及其臨床應(yīng)用上取得了巨大進(jìn)展。如，靶向PD1/PDL1免疫檢查點(diǎn)藥物和CAR-T 細(xì)胞免疫治療技術(shù)（2018 年獲FDA 批準(zhǔn)），靶向腫瘤新生抗原的T 細(xì)胞回輸?shù)?，為惡性腫瘤的治療提供了全新策略。然而，現(xiàn)有治療策略通常靶點(diǎn)單一，若要進(jìn)一步提升治療效果，解決現(xiàn)有藥物總體響應(yīng)率不佳和耐藥等問(wèn)題，需開(kāi)發(fā)出系統(tǒng)性干預(yù)的全新技術(shù)手段和策略，突破現(xiàn)有治療瓶頸。

基因線路是指經(jīng)過(guò)人工設(shè)計(jì)的、由不同功能的生物分子和基因元件組成的集合，它可使單個(gè)細(xì)胞根據(jù)預(yù)設(shè)的邏輯執(zhí)行相應(yīng)功能，在導(dǎo)入活細(xì)胞后，感受、整合、處理分子信號(hào)，行使特定生物功能。合成生物學(xué)利用工程化原理，設(shè)計(jì)人工基因線路感知細(xì)胞內(nèi)外多重信號(hào)，進(jìn)而做出邏輯判斷并通過(guò)調(diào)控細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)或釋放治療性藥物，系統(tǒng)性影響細(xì)胞行為以實(shí)現(xiàn)疾病治療之目的，是有望解決現(xiàn)有治療瓶頸的有力工具。迄今，合成生物學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展已嶄露頭角，例如，Lim 等［3］計(jì)了雙受體AND-gate T 細(xì)胞，用以特異高效地清除腫瘤細(xì)胞；Lu等［4］構(gòu)建了基于RNA的免疫調(diào)節(jié)基因線路，實(shí)現(xiàn)免疫刺激劑在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)與釋放，激活T 細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤殺傷；Fussenegger 等［5］開(kāi)發(fā)出“胰島素”基因線路，可自動(dòng)感應(yīng)小鼠血液胰島素濃度變化，維持血糖穩(wěn)定，緩減胰島素抵抗的癥狀。

1 基于CRISPR的基因線路識(shí)別與干預(yù)

十余年來(lái)，合成生物學(xué)和生物信息學(xué)飛速發(fā)展，合理設(shè)計(jì)具有預(yù)期功能的高效人工基因線路取得了長(zhǎng)足進(jìn)展［13］。人工基因線路首先在原核細(xì)胞中構(gòu)建，并逐漸在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)［14-16］。目前，生命體和細(xì)胞中的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)可被重編程，以改變?cè)兄掳┬盘?hào)通路［17］。CRISPR/Cas9 技術(shù)為基因線路設(shè)計(jì)提供了一個(gè)高效的工具，極大提高了基因線路的設(shè)計(jì)和元件效率。已有研究者嘗試使用CRISPR 技術(shù)構(gòu)建簡(jiǎn)單的基因線路用于腫瘤的基因治療［18-19］。實(shí)際上，利用CRISPR 技術(shù)構(gòu)建的基因線路不僅限于腫瘤細(xì)胞，還廣泛應(yīng)用于植物［20-21］和動(dòng)物［4］。然而，人工基因線路應(yīng)用于人體的安全性一直存在爭(zhēng)議，如何利用遺傳基因元件構(gòu)建安全有效的基因線路一直是科學(xué)家們面臨的難題。

為了解決這個(gè)問(wèn)題，研究者在基因線路設(shè)計(jì)中引入了人工開(kāi)關(guān)以提高其安全性。目前，已開(kāi)發(fā)出了可由光［22-24］、內(nèi)源性蛋白質(zhì)［25］、小分子多西環(huán)素［26-27］、阿魏酸鈉［28］等外源 信 號(hào)控制的CRISPR 開(kāi)關(guān)，控制細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的開(kāi)放與關(guān)閉（圖1）。人工、可切換系統(tǒng)的使用提高了基因治療的安全性，而可感知內(nèi)部信號(hào)蛋白的裝置將成為下一代基因治療工具。

圖1 基于CRISPR/Cas技術(shù)的人工基因線路［29］（a）在CRISPR/Cas9 基因序列上游插入編碼轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的人工序列，通過(guò)感知細(xì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白來(lái)控制基因表達(dá)。在惡性腫瘤細(xì)胞中，一些特定的轉(zhuǎn)錄因子被異常激活，如β-catenin 和NF-κB。當(dāng)癌細(xì)胞中的異常信號(hào)蛋白與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合并且RNA 聚合酶（RNA poly）被募集到TATA-box 時(shí)，下游CRISPR/Cas9 基因的表達(dá)就會(huì)開(kāi)啟。圖中Effector 指CRISPR 系統(tǒng)的Cas9 蛋白。（b）癌細(xì)胞中基于CRISPR/Cas9技術(shù)的光誘導(dǎo)基因表達(dá)裝置。藍(lán)光刺激誘導(dǎo)擬南芥隱花色素2（CRY2）與其結(jié)合蛋白（隱色素相互作用的基本螺旋-環(huán)-螺旋蛋白1，CIBN）之間形成異二聚化。因此，與CRY2蛋白融合的轉(zhuǎn)錄激活域（AD）被攜帶到指定區(qū)域，促進(jìn)下游基因的表達(dá)。（c）光誘導(dǎo)CRISPR/dCas9的流程。dCas9被分成兩個(gè)缺乏核酸酶活性的片段，dCas9片段與光誘導(dǎo)二聚化結(jié)構(gòu)域（pMag 和nMag）融合。藍(lán)光刺激誘導(dǎo)pMag 和nMag 之間的異源二聚化，使分裂的dCas9 片段能夠重新結(jié)合，從而重建RNA 引導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活活性。（d）小分子人工開(kāi)關(guān)系統(tǒng)。多西環(huán)素與逆四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活因子（rtTA）的結(jié)合導(dǎo)致rtTA 構(gòu)象的變化，活化后的rtTA 與Tet反應(yīng)元件（TRE）進(jìn)一步結(jié)合從而啟動(dòng)靶基因的表達(dá)（如Cas9）Fig.1 Schematic representation for the artificial gene circuits developed based on CRISPR/Cas technology(a) artificial sequences of transcription factor binding site are inserted into the upstream of the Cas9 coding sequences to control gene expression by sensing intracellular signal proteins.In malignant tumor cells, some specific transcription factors such as β-catenin and NF-κB are abnormally activated.The expression of the downstream CRISPR/Cas genes is turned on when abnormal signal proteins in malignant cells bind to the transcription factor binding site and RNA polymerase (RNA poly) is recruited to the TATA box.Effector represents the Cas9 protein.(b) the light-inducible gene expression regulation system in cancer cells developed based on CRISPR/Cas9 technology.Blue light stimulation induces heterodimerization between A.thaliana cryptochrome 2(CRY2)and its binding partner CIBN(cryptochrome-interacting basic helix-loop-helix protein 1).Therefore,the transcriptional activation domain (AD) fused with the CRY2 protein is targeted to the specific region and promotes the expression of downstream genes.(c) schematic diagram for the light inducible CRISPR/dCas9 system.The dCas9 is split into two fragments lacking nuclease activity, and the dCas9 fragments are fused with light-inducible dimerization domains (pMag and nMag).Blue light stimulation induces heterodimerization between pMag and nMag, which enables split dCas9 fragments to reassociate, thereby reconstituting RNA-guided transcriptional activation activity.(d) schematic diagram for a small molecular artificial switch system.The binding of doxycycline results in the conformational change of reverse tetracycline transcriptional activator rtTA, and then the activated rtTA could bind to the Tet-responsive element (TRE) to drive the expression of the target genes,such as Cas9 gene.

光調(diào)控系統(tǒng)不斷更新迭代。Ye 等將紅細(xì)菌中響應(yīng)遠(yuǎn)紅光的蛋白BphS，鏈球菌中的轉(zhuǎn)錄因子BldD［30］以及釀膿鏈球菌中的Cas9核酸酶經(jīng)理性設(shè)計(jì)、組裝和重編程構(gòu)成了遠(yuǎn)紅光調(diào)控的分割型split-Cas9 基因編輯系統(tǒng)（far-red light-activated split-Cas9 system，F(xiàn)AST），該系統(tǒng)以較低強(qiáng)度的遠(yuǎn)紅光外部照射作為控制手段，借助于遠(yuǎn)紅光本身的組織通透性優(yōu)勢(shì)，克服了目前化學(xué)小分子調(diào)控以及藍(lán)光調(diào)控CRISPR/Cas9系統(tǒng)的缺點(diǎn)，具有遠(yuǎn)程無(wú)痕、低本底泄漏、低脫靶效應(yīng)、低毒性等體內(nèi)應(yīng)用優(yōu)勢(shì)，能夠在時(shí)間和空間上特異性地精準(zhǔn)控制體內(nèi)深層組織和器官的基因編輯［31］。Tang等［32］開(kāi)發(fā)一類(lèi)新型光敏感crRNA，豐富了光誘導(dǎo)型gRNA（guide RNA）的種類(lèi)。使用維生素E或膽固醇等具有大位阻疏水基團(tuán)，利用光敏基團(tuán)將其修飾在crRNA的5′末端得到的光敏crRNA可以正常和Cas9結(jié)合形成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）復(fù)合物，維生素E 或膽固醇的修飾阻礙了RNP 復(fù)合物與目標(biāo)DNA 三元復(fù)合物的形成。在給予光照刺激后，維生素E從crRNA上解離，CRISPR/Cas9恢復(fù)功能。Ha 等［33］設(shè)計(jì)了光敏感、可裂解的gRNA（pcRNA），能夠利用光照降解gRNA分子，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)Cas9核酸酶基因編輯活性的調(diào)控。

Budeck 等［34］設(shè)計(jì)了一個(gè)光遺傳anti-CRISPR系統(tǒng)，由一個(gè)化膿性鏈球菌Cas9（Streptococcus pyogenesCas9，SpCas9）抑制劑AcrIIA4 蛋白和一個(gè)來(lái)自于燕麥的LOV2光傳感器蛋白雜合構(gòu)成，兩者與CRISPR/Cas9 效應(yīng)器共同表達(dá)，從而實(shí)現(xiàn)光介導(dǎo)的基因組和表觀基因組編輯。

2 CRISPR/dCas9介導(dǎo)的信號(hào)傳感器

近年來(lái)，研究者已經(jīng)開(kāi)發(fā)出一些人工合成元件來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞基因信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。Nissim 等［35］構(gòu)建了一個(gè)雙啟動(dòng)子整合器來(lái)區(qū)分結(jié)腸癌細(xì)胞和正常成纖維細(xì)胞。Xie等［36-38］通過(guò)檢測(cè)5種內(nèi)源性miRNA分子的差異表達(dá)，成功開(kāi)發(fā)了一種特異性細(xì)胞分類(lèi)器，可有效區(qū)分HeLa 細(xì)胞與其他類(lèi)型的細(xì)胞。Morsut等［39］根據(jù)腫瘤相關(guān)抗原-受體系統(tǒng)，構(gòu)建了雙受體“與門(mén)”T細(xì)胞，運(yùn)用布爾邏輯提高特異性識(shí)別腫瘤細(xì)胞的能力：在T細(xì)胞表面設(shè)計(jì)合成了兩個(gè)Notch 受體（即“雙受體”），使T 細(xì)胞能夠識(shí)別對(duì)應(yīng)的兩種腫瘤特異性抗原，只有當(dāng)腫瘤細(xì)胞同時(shí)表達(dá)這兩種抗原時(shí)，該工程化T細(xì)胞才能被激活。在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，除miRNA 和細(xì)胞表面受體蛋白或抗原性蛋白外，一些內(nèi)源性蛋白也會(huì)直接參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控，發(fā)現(xiàn)并利用癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵信號(hào)調(diào)控蛋白質(zhì)，也可開(kāi)發(fā)出更直接的調(diào)節(jié)元件。

構(gòu)建復(fù)雜基因線路的瓶頸之一是缺乏工程化的基因調(diào)控元件，CRISPR 技術(shù)則提供了一種有效解決方案，可以極大提升基因線路的設(shè)計(jì)。Liu 等［40-41］開(kāi)發(fā)了CRISPR 介導(dǎo)的信號(hào)傳感器，可同時(shí)識(shí)別多個(gè)蛋白質(zhì)信號(hào)，解決了傳統(tǒng)基因線路缺陷。該研究創(chuàng)造性地將RNA 核糖開(kāi)關(guān)序列整合到sgRNA 的3′端，構(gòu)建了一種可控制sgRNA 的新型核糖開(kāi)關(guān)。具體來(lái)說(shuō)，首先構(gòu)建RNA 核糖開(kāi)關(guān)（riboswitch）序列，該序列包括可感應(yīng)特定蛋白質(zhì)信號(hào)分子的RNA 核酸適配體（aptamer）以及與DNA 識(shí)別區(qū)互補(bǔ)的反義RNA。隨后將核糖開(kāi)關(guān)序列整合到sgRNA 的3′端，在沒(méi)有相應(yīng)信號(hào)存在情況下，反義RNA 保持雙鏈，不對(duì)靶基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生調(diào)控作用，當(dāng)目標(biāo)信號(hào)與核酸適配體結(jié)合后，分子構(gòu)象發(fā)生變化，雙鏈反義RNA 打開(kāi)形成單鏈，使得DNA 識(shí)別區(qū)域能夠與靶基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合從而產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄激活或抑制效果。該基因線路在活細(xì)胞水平特異感應(yīng)多個(gè)腫瘤信號(hào)分子（ETS-1、AFP、NF-κB、β-catenin），進(jìn)而激活多條下游抑癌信號(hào)通路（E-cadherin 細(xì)胞遷移通路、Bax-Bcl2細(xì)胞凋亡通路），由此組成新的“信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)”，“重新編程”癌細(xì)胞的分子信息程序，逆轉(zhuǎn)其惡性生物學(xué)行為，或誘導(dǎo)其凋亡（圖2）。受蛋白質(zhì)信號(hào)調(diào)控的CRISPR/dCas9 轉(zhuǎn)錄因子能動(dòng)態(tài)響應(yīng)，并有效處理不同的腫瘤信號(hào)，進(jìn)一步改變細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞（信息流）方向，這種特性使其有潛力發(fā)展成為構(gòu)建人工基因線路的重要工具。因此，這種新型CRISPR/dCas9 介導(dǎo)的信號(hào)傳感器可在合成生物學(xué)和癌癥治療中得以發(fā)揮更多應(yīng)用。

圖2 基于CRISPR/Cas 技術(shù)的信號(hào)傳感器［β-catenin激活Wnt通路，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖。人工設(shè)計(jì)的sgRNA優(yōu)先結(jié)合內(nèi)源性β-連環(huán)蛋白，進(jìn)而被激活。接著，人工設(shè)計(jì)的sgRNA與dCas9蛋白結(jié)合，并與靶序列結(jié)合、激活輸出基因，如內(nèi)源性抑癌基因（如p53）或凋亡基因（如p21和caspase 3），使腫瘤細(xì)胞由癌發(fā)生信號(hào)通路重新定向?yàn)榭拱┬盘?hào)通路］Fig.2 Schematic diagram for the signal conductor that links one signal with another developed based on CRISPR/Cas technology[The β-catenin activates the Wnt pathway,and promotes the proliferation of tumor cells.The redesigned sgRNA preferentially binds to the endogenous β-catenin,and then couples with dCas9-AD protein to activate the output genes,such as the endogenous tumor suppressor genes(eg,p53)or apoptosis genes(eg,p21 and caspase 3),enabling the tumor cells to redirect oncogenic signaling to an anti-oncogenic pathway.]

3 基于CRISPR/Cas9 技術(shù)的多基因同步調(diào)控

與傳統(tǒng)的基因編輯工具如轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)核酸酶（TALENs）和鋅指核酸酶（ZFNs）相比，CRISPR/Cas9不僅高效便捷，尤其具有在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)調(diào)控多個(gè)靶點(diǎn)的潛力［42］。將dCas9 蛋白融合到某基因的轉(zhuǎn)錄抑制或轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，便可下調(diào)或上調(diào)特定的單個(gè)基因，隨著CRISPR 技術(shù)的成熟，利用多基因靶向串聯(lián)sgRNA 陣列設(shè)計(jì)即可實(shí)現(xiàn)同時(shí)調(diào)控多個(gè)內(nèi)源基因的表達(dá)［43］，并且這種控制可以按需求而人為設(shè)置。

單是酒單維護(hù)就已經(jīng)足夠挑戰(zhàn)，“維護(hù)一個(gè)好酒單非常難，要花很多心思，侍酒師有權(quán)去加酒或者減酒，但是哪些酒可以加，哪些酒不可以加，哪些年份不想要等，都需要花很多時(shí)間精力去衡量”。

當(dāng)dCas9直接與一個(gè)轉(zhuǎn)錄相關(guān)域（即激活或抑制）融合時(shí)，它僅提供一種調(diào)節(jié)方法。然而，有研究已經(jīng)表明sgRNA 可以招募不同的轉(zhuǎn)錄相關(guān)結(jié)構(gòu)域，因而具有同時(shí)上調(diào)和下調(diào)不同基因的能力［44］。RNA 結(jié)合蛋白用于攜帶相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄相關(guān)結(jié)構(gòu)域，并特異性結(jié)合RNA 發(fā)夾結(jié)構(gòu)，不同的RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)與sgRNA 融合后，可以激活或抑制相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。這一技術(shù)為癌癥的精準(zhǔn)治療提供了廣闊的應(yīng)用前景和巨大的應(yīng)用價(jià)值，也為生物醫(yī)學(xué)科學(xué)提供了更多的可能性。然而，基因在腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育中始終發(fā)揮著重要作用，但基因的功能復(fù)雜多變，因此需要針對(duì)不同的基因選擇不同的調(diào)控方式。

4 基于新型CRISPR/dCas12a 的工程細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)

CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在腫瘤精準(zhǔn)治療中潛力巨大，其有效遞送至靶細(xì)胞是一個(gè)影響應(yīng)用的重要因素。SpCas9是最常用的CRISPR核酸酶基因，大小約為4.2 kb，這是現(xiàn)有生物技術(shù)應(yīng)用中常見(jiàn)的分子大小。然而，在細(xì)胞中表達(dá)Cas9 蛋白還需要增加啟動(dòng)子等調(diào)控元件，這就增大了該基因系統(tǒng)的總體大小。此外，若要細(xì)胞中表達(dá)的Cas9/dCas9蛋白不發(fā)揮其生物學(xué)功能，還需要在細(xì)胞中共表達(dá)其他成分（如sgRNA、供體模板、轉(zhuǎn)錄激活子或轉(zhuǎn)錄阻遏物等），共表達(dá)載體的尺寸通常大于現(xiàn)有病毒載體容量，因而難以使用常見(jiàn)的載體（如腺相關(guān)病毒AAV）遞送這一“龐大”基因系統(tǒng)。

目前的解決方案是使用小型化、拆分的SpCas9蛋白和CRISPR系統(tǒng)。研究者們相繼發(fā)現(xiàn)了一系列尺寸較小的CRISPR/Cas 蛋白，如來(lái)自金黃色葡萄球菌的Cas9（SaCas9）［45］（3.2 kb）、新發(fā)現(xiàn)的基因組編輯工具CasX（3.0 kb）［46］，或構(gòu)建mini-SpCas9 等系統(tǒng)［47-49］。然而，小型化CRISPR 基因編輯效率可能遠(yuǎn)低于野生型SpCas9 以及來(lái)自普雷沃菌（Prevotella）和弗朗西斯菌1（Francisella1）的CRISPR（Cpf1，也稱為Cas12a）。Cas12a 是麻省理工學(xué)院張鋒研究組發(fā)現(xiàn)的一種比Cas9 更小的蛋白質(zhì)，易于包裝和遞送，其在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中具有與SpCas9 相當(dāng)?shù)陌邢蚯懈钚?。通過(guò)對(duì)Cas12a 基因兩個(gè)位點(diǎn)（D10A、H841A）進(jìn)行點(diǎn)突變，可使Cas12a 蛋白喪失核酸內(nèi)切酶的活性（dCas12a），但保留其通過(guò)sgRNA 結(jié)合特定DNA序列的能力，其在基因組編輯中的信號(hào)放大和轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面具極大的應(yīng)用價(jià)值。

Cas12a 對(duì)靶標(biāo)識(shí)別更加嚴(yán)格，其有望解決Cas9“基因靶向特異性低”的問(wèn)題。Liu 等［50］首先在真核細(xì)胞鑒定了CRISPR/dCas12a 調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄激活或抑制的能力，再利用構(gòu)建crRNA 偶聯(lián)核糖開(kāi)關(guān)、將G 蛋白偶聯(lián)受體融合到Cas12a 蛋白這兩種方式，分別實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)不同類(lèi)型配體分子控制的可編輯Cas12a 系統(tǒng)以調(diào)節(jié)內(nèi)源基因轉(zhuǎn)錄。這一設(shè)計(jì)使細(xì)胞能夠通過(guò)響應(yīng)不同類(lèi)型的配體信號(hào)調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的轉(zhuǎn)錄，從而在細(xì)胞內(nèi)構(gòu)建具有全新輸入-輸出連接的人工信號(hào)通路，以控制細(xì)胞行為。當(dāng)從一個(gè)轉(zhuǎn)錄本中加工多個(gè)串聯(lián)的crRNA 時(shí)，該系統(tǒng)表現(xiàn)出信號(hào)放大，這符合細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳遞級(jí)聯(lián)放大的重要特征，提示Cas12a 為工程化定制細(xì)胞信號(hào)線路提供了一個(gè)可靠、有效的平臺(tái)，極大提高了智能化基因線路在未來(lái)精準(zhǔn)癌癥治療中的應(yīng)用潛力。

5 無(wú)啟動(dòng)子基因表達(dá)技術(shù)（CRISPReader）

隨著CRISPR 系統(tǒng)結(jié)合并激活靶DNA 轉(zhuǎn)錄能力的不斷優(yōu)化，基于CRISPR 的人工基因表達(dá)調(diào)控裝置得到了廣泛的研究［51］?；蛴蒁NA 密碼子組成，包括啟動(dòng)子及其讀碼控制等表達(dá)元件。Liu等［52］利 用CRISPR 開(kāi) 發(fā) 了 一 種 讀 碼 系 統(tǒng)（CRISPReader），它是一種新型的以穩(wěn)健方式控制的非啟動(dòng)子依賴的基因表達(dá)技術(shù)，其顯著特征是能夠“閱讀”基因簇的開(kāi)放閱讀框架，而不需要傳統(tǒng)的調(diào)控元件或其他輔助因子。該系統(tǒng)通過(guò)TATA 盒進(jìn)行初步轉(zhuǎn)錄起始，然后利用sgRNA 介導(dǎo)的基于dCas9 的轉(zhuǎn)錄激活因子與TATA 盒上游序列的結(jié)合促進(jìn)轉(zhuǎn)錄，實(shí)現(xiàn)正反饋的表達(dá)回路（圖3）。利用該策略建的緊湊型AAV-CRISPR-Cas9 一體化系統(tǒng)，簡(jiǎn)化了冗余的基因線路，消除調(diào)控元件與細(xì)胞基因組之間的相互干擾，不僅在反式激活、DNA 切割和基因編輯方面比編碼兩個(gè)獨(dú)立Cas9 元件的雙AAV 載體更有效，還解決了現(xiàn)有AAV 對(duì)CRISPR系統(tǒng)包裝尺寸問(wèn)題。

圖3 CRISPReader 通過(guò)耦合轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制來(lái)驅(qū)動(dòng)無(wú)啟動(dòng)子基因表達(dá)［52］（a） CRISPReader 通過(guò)組合的轉(zhuǎn)錄和翻譯的平臺(tái)構(gòu)成。當(dāng)dCas9-VP64 融合蛋白包括1 個(gè)催化失活的Cas9 和1 個(gè)VP64 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，VP64 結(jié)構(gòu)域可招募RNA 聚合酶Ⅱ，sgRNA 與靶基因TATA 盒上游位點(diǎn)同源，sgRNA 與靶序列結(jié)合進(jìn)一步引導(dǎo)dCas9-VP64 結(jié)合與TATA 盒上游，強(qiáng)力激活靶報(bào)告基因RLuc的轉(zhuǎn)錄。RNA激活導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄起始因子復(fù)合物的形成，其包括eIF4G以及招募來(lái)的核糖體，這時(shí)翻譯啟動(dòng)。（b） CRISPReader 驅(qū)動(dòng)基因簇表達(dá)的機(jī)制。在dCas9-VP64 激活轉(zhuǎn)錄后，RNA 激活劑與每個(gè)目標(biāo)mRNA 結(jié)合并獨(dú)立啟動(dòng)mRNA 翻譯。RNAPII-RNA polymerase Ⅱ（RNA聚合酶Ⅱ）Fig.3 CRISPReader drives gene expression by coupling the transcriptional and translational mechanisms［52］(a)CRISPReader is constructed by combining transcriptional and translational platforms.The dCas9-VP64 protein robustly activated transcription of reporter is constructed when combined with sgRNA targeting sequences near the TATA box.Then, the RNA activator leads to the formation of initiation factor complexes involving eIF4G and recruits ribosomes to initiate translation.(b) mechanisms of the CRISPReader designed to drive the gene cluster expression.After dCas9-VP64-mediated transcription, the RNA activators bind to each targeted mRNA and independently initiates mRNA translation.

6 基于CRISPReader 的微型基因線路（minigene）

通過(guò)將dCas9 與VP64（一個(gè)強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活域）融合，可以實(shí)現(xiàn)CRISPR 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活［53］，在dCas9 的引導(dǎo)下，VP64 將轉(zhuǎn)錄元件招募到特定序列上，從而實(shí)現(xiàn)靶基因的轉(zhuǎn)錄起始激活或鏈延伸。Liu 等［52］通過(guò)調(diào)節(jié)sgRNA 間隔的長(zhǎng)度，可控制Cas9-VP64 融合蛋白在轉(zhuǎn)錄激活和DNA 切割兩種功能之間的切換：當(dāng)sgRNA 間隔區(qū)長(zhǎng)度為20 nt時(shí)，Cas9-VP64 可誘導(dǎo)DNA 切割斷裂，而當(dāng)sgRNA 間隔區(qū)長(zhǎng)度為14 nt 時(shí)，Cas9-VP64 僅起轉(zhuǎn)錄激活作用，并且Cas9-VP64 的靶向特異性優(yōu)于Cas9蛋白。

如圖4 所示，首先將Cas9-VP64 引入基因線路，并刪除膀胱組織特異性啟動(dòng)子UPII 和癌特異性啟動(dòng)子TERT 元件，僅保留相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件。結(jié)合已知TERT 啟動(dòng)子序列的腫瘤靶向轉(zhuǎn)錄活性主要由c-Myc 轉(zhuǎn)錄因子決定，而UPII 啟動(dòng)子序列的膀胱上皮組織特異性主要由Get1 轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。理論上講，c-Myc和Get1僅在膀胱癌細(xì)胞中具有相對(duì)高的表達(dá)水平。初始表達(dá)后，sgRNA 可進(jìn)一步與自身轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TATA box）上游結(jié)合，并通過(guò)正反饋機(jī)制放大轉(zhuǎn)錄信號(hào)（c-Myc 和Get1）的激活效應(yīng)，驅(qū)動(dòng)其下游基因轉(zhuǎn)錄。Cas9-VP64/sgRNA2 進(jìn)一步抑制LacI基因的表達(dá)，使熒光素酶報(bào)告基因被轉(zhuǎn)錄激活。在正常的膀胱上皮細(xì)胞中，熒光素酶不能被有效轉(zhuǎn)錄，并且在背景水平上被微量的LacI表達(dá)進(jìn)一步沉默。從傳統(tǒng)的基因線路中減少3.2 kb 的DNA 序列后，利用單個(gè)質(zhì)粒載體將minigene 線路轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中（傳統(tǒng)的基因線路需要多個(gè)質(zhì)粒載體共轉(zhuǎn)染）。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后檢測(cè)報(bào)告基因熒光素酶表達(dá)水平顯示，正常細(xì)胞中熒光素酶表達(dá)泄漏在minigene 線路中幾乎不存在，而在膀胱癌高惡性亞組中熒光素酶表達(dá)水平約為低惡性亞組的1.5 倍，這表明與傳統(tǒng)基因線路相比，小基因線路對(duì)膀胱癌的識(shí)別靈敏度更高。將熒光素酶基因換為Bax、p21、E-cadherin 等抑癌因子的基因，進(jìn)一步利用體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)，測(cè)試線路對(duì)膀胱癌細(xì)胞的選擇性識(shí)別及抑癌能力后發(fā)現(xiàn)，高度控制的微型基因線路相比傳統(tǒng)邏輯線路和基因線路有更好的癌癥診斷和抑癌效率［53］。這一研究工作為精準(zhǔn)腫瘤治療提供了一個(gè)應(yīng)用工具，并可能為目前醫(yī)學(xué)合成生物學(xué)應(yīng)用的障礙提供一個(gè)潛在的有效解決方案。

圖4 與門(mén)微型基因線路的設(shè)計(jì)與構(gòu)建［54］（UPII啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)Cas9 mRNA 的轉(zhuǎn)錄，而TERT 啟動(dòng)子用于促進(jìn)靶向LacI的sgRNA 的轉(zhuǎn)錄。輸出海腎熒光素酶基因受LacI控制的CMV 啟動(dòng)子調(diào)控。熒光素酶僅在UPII啟動(dòng)子和TERT 啟動(dòng)子都被激活時(shí)表達(dá)。在小基因線路的設(shè)計(jì)中，UPII和TERT 啟動(dòng)子被它們各自的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件取代。c-Myc 和Get1 僅在膀胱癌細(xì)胞中同時(shí)具有相對(duì)較高的表達(dá)水平。sgRNA1 和sgRNA2 初始表達(dá)后，它們可以進(jìn)一步結(jié)合自身轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游，通過(guò)正反饋機(jī)制放大c-Myc 和Get1 的轉(zhuǎn)錄信號(hào)，分別放大下游基因的轉(zhuǎn)錄。此外，LacI 基因被sgRNA2 敲除，熒光素酶報(bào)告基因被轉(zhuǎn)錄激活。在正常膀胱上皮細(xì)胞中，熒光素酶不能被有效轉(zhuǎn)錄，并被在背景水平表達(dá)的痕量LacI進(jìn)一步沉默）Fig.4 Design and construction of the AND gate minigene circuits［54］(The UPII promoter drives the transcription of Cas9 mRNA,while the TERT promoter is used to promote the transcription of sgRNA targeting LacI.The output Renilla luciferase gene is regulated by a LacI-controlled CMV promoter.The luciferase is expressed only when both UPII promoter and TERT promoter are activated.In the design of the minigene circuit,the UPII and TERT promoters are replaced by their respective transcription factor binding elements.Both c-Myc and Get1, only in bladder cancer cells, have a relative high expression level at the same time.After initial expression of sgRNA1 and sgRNA2, they could further bind to the upstream of their own transcription initiation sites, and amplify the transcription signals of c-Myc and Get1 through the positive feedback mechanism to amplify their downstream gene transcription.Furthermore,the LacI gene is knocked out by sgRNA2, and luciferase reporter gene is activated by transcription.In normal bladder epithelial cells, luciferase could not be effectively transcribed and further silenced by a trace amount of LacI expressed at the background level.)

7 靶向線粒體DNA 的CRISPR/Cas工具

線粒體DNA（mtDNA）序列的變異在腫瘤中很常見(jiàn)，線粒體基因型的細(xì)微變化會(huì)對(duì)細(xì)胞核、癌發(fā)生和進(jìn)展產(chǎn)生深遠(yuǎn)的影響［55-56］。CRISPR/Cas9在核基因編輯方面取得了快速進(jìn)展，其應(yīng)用涉及gRNA 引導(dǎo)Cas9 至待編輯DNA 區(qū)域，由于線粒體缺乏輸入RNA 的能力，如何將RNA 引入線粒體等問(wèn)題限制了CRISPR/Cas9 系統(tǒng)在線粒體基因編輯應(yīng)用的可行性和有效性。

2015 年首次報(bào)道CRISPR/Cas9 系統(tǒng)成功應(yīng)用于線粒體基因編輯［57］。然而，該研究結(jié)果與另一研究存在一些爭(zhēng)議。首先，gRNA 引入線粒體的機(jī)制尚不明確。20 個(gè)核苷酸莖環(huán)系列來(lái)自H1 RNA（RNase P enzyme RNA component）［58］，它附著在注入的細(xì)胞質(zhì)RNA 上，可以成功地將RNA靶向到線粒體中。該方法對(duì)非編碼RNA（如tRNA）和編碼蛋白質(zhì)的mRNA 均有效，為在CRISPR/Cas9 系統(tǒng)中將gRNA 導(dǎo)入線粒體提供了思路。Gammage 等總結(jié)了現(xiàn)有的RNA 導(dǎo)入理論，他們否認(rèn)mtRNase P 中存在RNA 成分，認(rèn)為RNase P 和RNase MRP 主要在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，并質(zhì)疑線粒體核糖體在協(xié)助rRNA 和PNPase 在細(xì)胞質(zhì)RNA 運(yùn)輸中的作用［59］。也有報(bào)道稱，酵母胞質(zhì)tRNALys（CUU）的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域F-arm 和D-hairpin［60］，以及5S RNA 的一些結(jié)構(gòu)域也可能幫助RNA進(jìn)入線粒體［61］。

由于線粒體中只存在同源重組（HR）修復(fù)途徑，缺乏非同源末端連接（NHEJ）修復(fù)，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)產(chǎn)生雙鏈斷裂（DSB）和支持同源互補(bǔ)的外源DNA 片段，已成功在人和斑馬魚(yú)線粒 體［62］、酵 母 線粒 體的mtDNA 中 插 入DNA 序列［62］。過(guò)去，由于膜電位、pH 和噬菌體的吞噬作用，DNA 對(duì)線粒體的滲透面臨很大困難［63］。近年來(lái)， 用DNA 包 被 鎢 顆 粒、 DQAsome （ 由dequalinium 制成的陽(yáng)離子囊泡）/DNA 復(fù)合物和TAT（trans-activator of transcription protein）等方式修飾的DNA，加載至基因槍對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轟擊，成功實(shí)現(xiàn)了外源DNA進(jìn)入酵母的線粒體［61］。

另一項(xiàng)研究利用MTS 修飾腺相關(guān)病毒衣殼VP2 并成功將ND4 基因轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中，為線粒體遞送DNA 序列提供了一種新方法［64］。其他用于藥物或蛋白質(zhì)的線粒體輸送系統(tǒng)是通過(guò)金屬有機(jī)物開(kāi)發(fā)的框架（MOF）或三苯基膦（TPP）和細(xì)胞穿透聚（二硫化物）（CPD）修飾的可生物降解二氧化硅納米粒子（BS-NPs），它們有可能用于外源性DNA 或RNA 成 分 的 線 粒 體 遞 送［65-66］。在Bian等［67］的研究中，在體外用MTS 和轉(zhuǎn)錄物修飾Cas9，然后將gRNA和體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物顯微注射到細(xì)胞質(zhì)中；他們還通過(guò)ViaFect 轉(zhuǎn)染引入了含有同源臂的外源DNA 載體。令人驚訝的是，具有短同源臂的外源ssDNA 被準(zhǔn)確敲入了靶向位點(diǎn)，這種誘變可以穩(wěn)定地傳遞給F1 代斑馬魚(yú)，這表明ssDNA和gRNA可以不加修飾地轉(zhuǎn)運(yùn)到線粒體中，這與最近的研究一致［68］。

8 基于CRISPR/Cas9基因線路的挑戰(zhàn)與展望

CRISPR/Cas 系統(tǒng)已成為合成生物學(xué)領(lǐng)域的重要工具，但其局限性不容忽視。當(dāng)dCas9蛋白發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄激活或轉(zhuǎn)錄抑制作用時(shí)，它通常與轉(zhuǎn)錄激活因子（VPR）或轉(zhuǎn)錄抑制因子（KRAB）融合以增強(qiáng)功能，而dCas9-VPR/KRAB 的體積大于現(xiàn)有病毒載體容量，這導(dǎo)致CRISPR/dCas9 系統(tǒng)在現(xiàn)實(shí)中的應(yīng)用受到限制。因此，開(kāi)發(fā)高效的遞送途徑是臨床治療前應(yīng)解決的重要問(wèn)題。

腺相關(guān)病毒（adeno associated virus，AAV）在臨床治療疾病已多年，具有良好的遞送效率和相對(duì)較高的安全性［69］。AAV 作為穩(wěn)定的輔助物存在，不會(huì)整合到宿主細(xì)胞的基因組中。過(guò)去幾年，AAV 在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行基因轉(zhuǎn)移的能力已經(jīng)得到證實(shí)，包括人體靶組織，如肝臟、視網(wǎng)膜、心臟、肌肉和中樞神經(jīng)系統(tǒng)［70-71］。因此，AAV 仍然是用于惡性腫瘤細(xì)胞基因治療的常用載體。研究者正在努力尋找較小的Cas蛋白，例如空腸彎曲桿菌中Cas13d（僅1000 個(gè)氨基酸），以適應(yīng)AAV 遞送系統(tǒng)。

溶瘤病毒是一種減毒或工程化病毒，可因選擇性復(fù)制而導(dǎo)致癌細(xì)胞裂解，并引發(fā)系統(tǒng)免疫反應(yīng)，已被認(rèn)為是一類(lèi)癌癥免疫治療藥物［72］，同時(shí)也是癌癥治療有前途的替代載體。有研究利用溶瘤腺病毒作為載體遞送靶向EGFR 的CRISPR/Cas12a 系統(tǒng)，以破壞腫瘤細(xì)胞增殖信號(hào)通路，從而實(shí)現(xiàn)精確和癌癥特異性基因組重編程和有效的腫 瘤消 退［73］。 利 用重 組溶 瘤 黏液 瘤病 毒（oncolytic myxoma virus，MYXV）遞送誘導(dǎo)型CRISPR 靶向RAS基因，也顯著降低了胚胎橫紋肌肉瘤細(xì)胞的增殖［74］。雖然許多溶瘤病毒單獨(dú)只引起微弱的免疫反應(yīng)，但通過(guò)編碼和局部釋放細(xì)胞因子和趨化因子，可以大大增強(qiáng)溶瘤病毒對(duì)腫瘤的治療效果，這有助于克服腫瘤微環(huán)境中的免疫抑制，與免疫調(diào)節(jié)劑的系統(tǒng)給藥相比，副作用更小。Xie 等［75］利用microRNA 開(kāi)關(guān)構(gòu)建的基因線路，進(jìn)一步提高溶瘤病毒的癌癥靶向特異性，并在癌癥微環(huán)境中成功觸發(fā)了針對(duì)癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)。

2021 年8 月張鋒研究團(tuán)隊(duì)［76］開(kāi)發(fā)了一種全新的RNA 遞送平臺(tái)--SEND（selective endogenous ncapsidation for cellular delivery），其核心是一種逆轉(zhuǎn)錄病毒樣蛋白PEG10，它能夠與自身的mRNA結(jié)合并在其周?chē)纬汕蛐捅Ｗo(hù)囊。研究團(tuán)隊(duì)將其改造設(shè)計(jì)后用來(lái)包裝和遞送RNA。PEG10 是逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子衍生蛋白質(zhì)的其中一種，可形成類(lèi)似于病毒的結(jié)構(gòu)，優(yōu)先結(jié)合并促進(jìn)其自身信使RNA（mRNA）的囊泡分泌，并能夠在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移RNA。而且，PEG10 所攜帶的mRNA 可以被與PEG10 的非翻譯區(qū)域和相關(guān)RNA 的側(cè)翼基因重編程。利用這種可重編程性，設(shè)計(jì)了小鼠和人類(lèi)PEG10 來(lái)包裝、分泌和遞送特定的RNA，用PEG10 蛋白實(shí)現(xiàn)了對(duì)Cas9 mRNA 以及sgRNA 的包裝，并對(duì)人類(lèi)細(xì)胞和小鼠細(xì)胞基因組的目標(biāo)位點(diǎn)均成功實(shí)現(xiàn)了基因編輯。通過(guò)改造PEG10 蛋白的RNA 包裝組件和識(shí)別組件，理論上能針對(duì)不同疾病提供模塊化的治療平臺(tái)。

另一方面，Cas9 等外源蛋白在人體中使用的安全性也不容忽視。自問(wèn)世以來(lái)，脫靶一直是Cas9 編輯哺乳動(dòng)物細(xì)胞的潛在問(wèn)題。提高CRISPR/Cas 的保真度可增強(qiáng)基因線路的可靠性，并最大化地減少副作用。Doudna 等［77-79］通過(guò)設(shè)計(jì)一種開(kāi)關(guān)，使CRISPR/Cas9 完成編輯后失活，從而減少CRISPR 技術(shù)的脫靶效應(yīng)。研究者未來(lái)還可利用定向進(jìn)化和理性設(shè)計(jì)等方法改善堿基編輯系統(tǒng)，以實(shí)現(xiàn)理想的、寬度可窄至單個(gè)核苷酸的靶向窗口，甚至達(dá)到100%的堿基替換效率。

目前，基于CRISPR/Cas 的哺乳動(dòng)物基因工具和基因線路正用于越來(lái)越宏大的目標(biāo)，最大限度地提高CRISPR/Cas 系統(tǒng)的保真度以及遞送效率將對(duì)該領(lǐng)域的發(fā)展作用巨大，使用CRISPR 技術(shù)的智能化基因線路將成為未來(lái)腫瘤基因治療領(lǐng)域的一個(gè)重要方向。