合成生物學在腸道微生態(tài)療法研發(fā)中的應用

高夢學，王麗娜，黃鶴，2

（1 天津大學化工學院，教育部合成生物學前沿科學中心，系統(tǒng)生物工程教育部重點實驗室，天津 300072；2 天津大學浙江紹興研究院，浙江 紹興 312000）

腸道菌群是指定植于哺乳動物腸道內(nèi)的共生微生物群，在宿主新陳代謝、免疫調(diào)節(jié)和信號傳導過程中扮演著重要角色［1-2］。健康的腸道菌群具有相對穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，能在一定程度上幫助宿主抵抗病原菌入侵、適應環(huán)境變化［3］。然而，步入工業(yè)化時代以來，尤其隨著生活方式的改變、醫(yī)療衛(wèi)生水平的提高，腸道菌群的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生了顯著變化［圖1（a）］［4-9］。這種重塑的“工業(yè)化”腸道菌群對人類健康產(chǎn)生了深遠影響，加速了消化系統(tǒng)疾病、代謝性疾病和精神疾病等多種慢性疾病的發(fā)生發(fā)展［10］。在過去十幾年里，以失衡腸道菌群為靶點的微生態(tài)療法在生物醫(yī)學研究界引起了廣泛的關注。

常見的微生態(tài)療法主要包括益生元療法、益生菌療法和糞菌移植療法［圖1（b）］。益生元（prebiotics）是一類能夠被宿主微生物選擇性利用并有益于宿主健康的底物［11］，包括低聚果糖、低聚半乳糖、菊粉和抗性淀粉等。它們可以富集雙歧桿菌等特定微生物，產(chǎn)生有機酸等代謝終產(chǎn)物，幫助機體改善健康［12-13］。益生菌（probiotics）是一類當給予足夠的量時能給宿主帶來健康益處的微生物［14］，其主要產(chǎn)品益生菌膳食補充劑和非處方藥已用于減輕胃腸道功能紊亂癥狀、提高免疫系統(tǒng)功能和調(diào)節(jié)能量代謝［15-24］。然而，到目前為止益生元療法和益生菌療法的有效性在很多應用場景存在較大爭議［25-26］。Wilson 等［27］通過對11 項隨機對照研究進行薈萃分析，發(fā)現(xiàn)β-低聚半乳糖和瓜爾膠等益生元無法顯著改善腸易激綜合征及其他功能性腸病患者的癥狀，且不同種類的益生元對癥狀的影響顯示出差異性。Costeloe 等［28］在一項多中心隨機對照3 期臨床試驗中發(fā)現(xiàn)短雙歧桿菌BBG-001在預防極早產(chǎn)兒的壞死性小腸結(jié)腸炎及晚發(fā)性敗血癥方面無顯著功效。另外，近期發(fā)表在JAMA等雜志上的試驗結(jié)果也表明鼠李糖乳桿菌GG等益生菌在緩解輪狀病毒等常見病原體感染引起的急性腸胃炎［29］和預防危重病人呼吸機相關肺炎［30］方面缺乏有效證據(jù)。糞菌移植（fecal microbiota transplantation，F(xiàn)MT）是指將從健康人糞便中獲得的功能菌群移植到患者胃腸道內(nèi)，重建新的腸道菌群并實現(xiàn)腸內(nèi)外的疾病治療［31］。2013 年2 月美國食品及藥品監(jiān)督管理局首次將FMT 寫入復發(fā)性或難治性艱難梭菌感染（Clostridium difficileinfection，CDI）治療指南［32］。近十年來，F(xiàn)MT 在治療CDI 方面取得了突出的療效，受到國內(nèi)外越來越多的關注。然而作為一項尚不完全成熟、只在局地獲批使用的臨床治療手段，F(xiàn)MT 的安全性和重現(xiàn)性有待進一步驗證［33］。

合成生物學的出現(xiàn)為解決上述問題帶來了轉(zhuǎn)機。合成生物學是指在工程學思想指導下，按照特定目標理性設計、改造乃至從頭重新合成生物體系，即生物學的工程化［34］。作為一個新興交叉學科，它已經(jīng)在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)境等多個研究領域取得了長足發(fā)展。其中，合成生物學技術的醫(yī)學轉(zhuǎn)化應用研究更是受到了生物學界和醫(yī)學界的重點關注。在醫(yī)學應用領域，利用合成生物學技術構(gòu)建的工程益生菌可在腸內(nèi)生理或病理信號刺激下，表達酶、細胞因子、抗菌肽、激素、抗體等特定產(chǎn)物［35］，改善腸道微環(huán)境［圖1（c）］。與傳統(tǒng)藥物治療相比，工程益生菌具有更高的靈活性、特異性、可預測性和可控性。目前，乳酸菌特別是乳酸乳球菌（經(jīng)常作為發(fā)酵乳制品的一部分被食用），因較高的安全性常被用作遞送治療藥物的表達載體，具有廣泛的臨床應用價值。此外，芽孢桿菌和大腸桿菌等益生菌也是重組活體生物藥研究過程中常見的底盤微生物［36-37］。近年來，隨著合成生物學的發(fā)展，微生物活體療法的遺傳工具箱不斷擴充，CRISPR-Cas［38］和Mobile-CRISPRi［39］等工具的開發(fā)為模式和非模式微生物的基因整合研究提供了有效方法。另外，基于合成生物學技術發(fā)展起來的智能微生物工程［40］，賦予了微生物自主決策能力，在精準醫(yī)療方面具有廣泛的發(fā)展前景，為具有傳感、生產(chǎn)和生物遏制作用的全功能活菌生物制劑的成功研發(fā)提供了可能。

圖1 腸道微生態(tài)療法（a）腸道菌群失衡；（b）常見微生態(tài)療法；（c）工程益生菌療法Fig.1 Gut microbiome therapeutics(a)Gut microbiota dysbiosis;(b)Traditional modalities to manipulate microbiome;(c)Engineered probiotics

本文將基于靶向消化系統(tǒng)疾病、代謝性疾病和精神疾病的微生態(tài)療法進行綜述，首先回顧工程益生菌在上述重大慢病中的調(diào)節(jié)作用，然后探究利用工程益生菌構(gòu)建人工合成菌群面臨的機遇與挑戰(zhàn)，最后對應用合成生物學理念開發(fā)多細胞菌群的新型微生態(tài)療法進行展望。

1 靶向消化系統(tǒng)疾病的微生態(tài)療法

消化系統(tǒng)疾病是一類多發(fā)且常見的慢性腸道疾病，近年來全球流行率不斷增加，給醫(yī)療系統(tǒng)帶來了巨大的財政和資源負擔［41-42］。炎癥性腸病和結(jié)直腸癌都是常見的消化系統(tǒng)疾病。盡管具體發(fā)病機制尚不清楚，但研究表明失衡的腸道菌群為消化系統(tǒng)疾病的重要誘因［43-44］。靶向失衡腸道菌群的工程益生菌療法在消化系統(tǒng)疾病防治研究中展現(xiàn)出巨大潛力。

1.1 炎癥性腸病

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一組病因不明的復發(fā)性腸道炎癥性疾病，包括潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn's disease，CD）［45］。其發(fā)病機制涉及遺傳、環(huán)境、腸道菌群等多種因素，其中腸道菌群的作用不容忽視。在炎癥反應期間，患者腸道內(nèi)硫酸鹽還原菌的水平升高［46］，與硫酸鹽還原菌相關的硫代謝物硫代硫酸鹽含量增加。硫代硫酸鹽是一種重要的炎癥生物標志物，可作為輸入信號用于IBD的診療。2017年，萊斯大學Tabor團隊［47］在希瓦菌中首次發(fā)現(xiàn)了可用于檢測硫代硫酸鹽的雙組分系統(tǒng)，并在益生菌大腸桿菌Nissle 1917（Escherichia coliNissle 1917，EcN）底盤細胞中進行了驗證。之后在此雙組分系統(tǒng)基礎上，Woo等［48］結(jié)合布爾運算生成了同時檢測硫代硫酸鹽和硝酸鹽等多個信號的布爾門生物傳感器，Mimee等［49］整合細菌傳感器與微電子設備發(fā)明了可植入胃腸道的微型檢測器，為炎癥相關疾病的非侵入性診斷提供了新途徑。

目前，IBD尚無根治的方法，緩解炎癥反應是治療IBD 的現(xiàn)有目標。因此，以炎性因子為靶標腸內(nèi)原位遞送治療藥物的重組益生菌被認為是 治 療IBD 的 潛在 有 效 療 法。Steidler 等［50］和Vandenbroucke等［51］利用乳酸乳球菌分泌體系，分別構(gòu)建了表達白細胞介素-10（interleukin-10，IL-10）和抗腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNFα）納米抗體的遞送系統(tǒng)。每天口服這些遞送系統(tǒng)導致了IL-10 和抗TNFα 納米抗體在結(jié)腸內(nèi)的局部釋放，提高了IL-10 和抗TNFα 納米抗體的生物利用度，避免了全身給藥導致的副反應，有效緩解了小鼠結(jié)腸炎癥水平。哈佛醫(yī)學院Quintana 課題組［52］通過結(jié)合定向進化和合成基因回路的方法，推出了用于治療IBD 的自調(diào)節(jié)工程酵母菌。該工程菌能夠根據(jù)腸道內(nèi)促炎代謝物三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，eATP）的水平啟動三磷酸腺苷雙磷酸酶的表達和分泌，以降解過多的eATP并產(chǎn)生抑制炎癥的腺苷，從而提供局部的炎癥治療。此外，重組益生菌還可通過遞送轉(zhuǎn)化生長因子、超氧化物歧化酶、血紅素氧合酶、胰島素樣生長因子、血吸蟲免疫調(diào)節(jié)蛋白和胱抑素等蛋白類藥物治療IBD［53-54］。除蛋白類藥物外，清華大學陳國強團隊［55］還利用工程化的EcN 合成了3-羥基丁酸（3-hydroxybutyrate，3HB）等酮體分子，并通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、增加短鏈脂肪酸含量實現(xiàn)了硫酸葡聚糖鈉鹽（dextran sulfate sodium，DSS）誘導的小鼠結(jié)腸炎的治療。此外，為進一步提高遞送過程的可控性，天津大學王漢杰研究團隊［56］結(jié)合光學傳感技術和光遺傳學技術，在EcN中開發(fā)了受近紅外光和pH 同時調(diào)控的光治療納米系統(tǒng)，可用于UC 的家庭護理，具有一定轉(zhuǎn)化應用前景。

此外，破損的腸黏膜屏障也是IBD治療的潛在靶標。IBD發(fā)作期間腸黏膜屏障被破壞，腸道內(nèi)壁及微生物群暴露于有害環(huán)境中，腸上皮完整性的快速恢復成為了治療的關鍵。三葉因子（trefoil factors，TFFs）和表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）是兩種重要黏膜干預劑，能促進細胞遷移并在較短時間內(nèi)修復黏膜傷口。然而，以口服方式給藥時，TFF 和EGF 易被消化酶降解且易黏附在小腸黏液上，從而導致口服生物利用度降低。已有研究證明，利用合成生物學技術，對EcN 進行遺傳學改造，原位生成TFF［57-58］和EGF［59］的重組益生菌能促進腸黏膜傷口的愈合，對DSS 誘導的結(jié)腸炎發(fā)揮保護作用。

1.2 結(jié)直腸癌

結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）是一種病發(fā)部位位于結(jié)腸或直腸的癌癥［60］，包括散發(fā)型和結(jié)腸炎型兩種類型。近年來，隨著高通量測序技術和微生物培養(yǎng)組學技術的發(fā)展，腸道菌群在CRC 中的作用越來越受到重視。香港中文大學于君、黃曦團隊［61］對不同研究隊列的526 個腸道菌群宏基因組數(shù)據(jù)進行薈萃分析，確定了7 種在CRC 患者中顯著富集的核心微生物。這些微生物作為潛在的診斷標志物，可用于新型生物傳感器的開發(fā)，推動CRC 早期篩查技術的發(fā)展。

慢性炎癥是結(jié)腸炎型CRC 發(fā)展的關鍵驅(qū)動因素。原位分泌抗炎藥物的重組工程菌，不僅可以用于治療IBD，還可以抑制腸息肉的形成，從而阻斷CRC 的發(fā)生發(fā)展［53］。除傳統(tǒng)的抗炎藥物外，來自膳食中的植物化學物也是CRC 防治研究中常用的治療分子。然而，這類天然存在的化學預防藥物生物利用度低、吸收效果差，且通常需要依賴特定催化酶才能發(fā)揮治療作用。針對這些問題，Ho等［62］構(gòu)建了表達芥子酶的重組工程菌，成功將十字花科蔬菜中的芥子油苷轉(zhuǎn)化成了具有抗癌活性的蘿卜硫素，抑制了超過95%的癌細胞增殖，減少了食用十字花科蔬菜的CRC小鼠的腫瘤數(shù)量。此外，An等［63］從鼠李糖乳桿菌中分離出了新型抗癌藥物p8，并將表達p8的基因引入戊糖片球菌中，構(gòu)建了治療CRC 的細菌給藥系統(tǒng)。結(jié)果表明，該系統(tǒng)在CRC 異種移植和氧化偶氮甲烷/DSS 化學誘導的小鼠模型中都具有正向治療效果。另外，Chen等［64］利用重組EcN 將葡萄糖轉(zhuǎn)化為抗癌藥物5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA），并結(jié)合光熱治療技術開發(fā)了一種治療CRC 的新療法。綜上所述，與傳統(tǒng)治療藥物和療法相比，工程益生菌在CRC 治療中更具先天優(yōu)勢，能對癌細胞進行更智能的識別并在腫瘤組織內(nèi)部釋放理想的治療成分。

靶向消化系統(tǒng)疾病的微生態(tài)療法總結(jié)見表1。

續(xù)表

2 靶向代謝性疾病的微生態(tài)療法

代謝性疾病是指葡萄糖、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)在體內(nèi)代謝異常引發(fā)的一類疾病，包括肥胖、糖尿病和非酒精性脂肪肝病等［65］。近年來，隨著生活方式（如久坐［66］等）、飲食習慣（如高脂飲食［67］等）的改變，代謝性疾病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢。越來越多的研究表明，代謝性疾病與腸道微生態(tài)失調(diào)有關。腸道菌群紊亂不僅可以通過破壞腸屏障功能觸發(fā)局部或全身性低度炎癥反應，還能加速宿主對能量的攝入、影響胰島素敏感性。近期，許多研究已經(jīng)證實工程益生菌等微生態(tài)療法在治療代謝性疾病方面的功效。

2.1 肥胖

肥胖（obesity）是指由多因素引起，導致體內(nèi)脂肪堆積過多達到危害健康程度的一種慢性代謝性疾?。?8］。目前諸多研究表明，肥胖的發(fā)生與腸道菌群失衡密切相關。上海交通大學趙立平團隊［69-70］通過對病態(tài)肥胖患者的腸道菌群進行分析，發(fā)現(xiàn)并分離了產(chǎn)內(nèi)毒素的陰溝腸桿菌，并首次證明了它與肥胖之間的直接因果關系。此外，進一步的研究表明失衡的腸道菌群可通過影響機體能量攝入和代謝情況、激發(fā)促炎反應，加速肥胖癥的形成［71］。當前預防和管理肥胖的方法包括飲食干預、有氧運動、藥物治療和手術治療等［72-73］。這些方法主要圍繞著燃脂增加能量消耗和抑制食欲減少能量攝入兩方面開展。從腸道微生態(tài)入手，針對影響代謝的各因素開發(fā)治療方法可能是預防管理肥胖的新途徑。

分泌激素類藥物的重組益生菌有助于控制肥胖。胰高血糖素樣肽1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）是一種腸促胰島素分泌激素，具有延緩胃排空和控制食欲的作用［74］。GLP-1 引領了新一代的抗肥胖藥物，然而目前注射仍是GLP-1 等激素類藥物釋放的主要途徑，常伴有藥物半衰期短、患者服藥依從性差等問題。為解決這些問題，陳廷濤課題組［75］構(gòu)建了分泌GLP-1 的質(zhì)粒過表達型工程菌MG1363-pMG36e-GLP-1，顧建文團隊［76］合成了分泌GLP-1長效類似物的重組EcN。給高脂飲食誘導的肥胖小鼠口服上述工程菌發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠的體重明顯降低、腸道菌群多樣性顯著增加。除GLP-1 外，研究人員還關注了胃泌酸調(diào)節(jié)素（oxyntomodulin，OXM）、未羧基化或低羧基化的骨鈣素（uncarboxylated or low-carboxylated OC，ucOC）和成纖維細胞生長因子21（fibroblast growth factor 21，F(xiàn)GF21）等激素類藥物。Long 等［77］以雙歧桿菌為載體開發(fā)了新型口服給藥系統(tǒng)，用于遞送OXM 及其類似物。Namai等［78］基于乳鏈菌肽控制基因表達（NICE）系統(tǒng)構(gòu)建了生產(chǎn)ucOC的基因工程乳酸菌NZ-OC，在誘導劑nisin 的存在下產(chǎn)生并分泌了ucOC。Cao 等［79］以LacF基因代替抗生素抗性基因作為選擇標記，合成了乳酸乳球菌NZ3900/PNZ8149系統(tǒng)，實現(xiàn)了FGF21表達。

除激素類藥物外，還有許多治療分子可由益生菌合成用于治療肥胖。N-?；字Ｒ掖及罚∟-acylphosphatidylethanolamines， NAPEs） 是 一類具有抗肥胖特性的脂質(zhì)家族。范德堡大學Davies團隊［80-81］通過研究證明，使用來自擬南芥中的NAPEs 合酶改造EcN 可產(chǎn)生具有生物活性的NAPEs。持續(xù)8 周服用表達NAPEs 的工程菌可降低高脂飲食小鼠的肥胖水平，改善小鼠胰島素抵抗和肝脂肪變性情況。且研究表明，小鼠在服用工程化EcN 之前用或不用抗生素預處理腸道菌群都能得到相似的肥胖改善效果。短鏈脂肪酸是微生物發(fā)酵膳食纖維的主要產(chǎn)物，包括乙酸、丙酸和丁酸等，對宿主能量代謝具有調(diào)節(jié)作用。本研究團隊［82］利用CRISRP/Cas9 基因編輯技術，在枯草芽孢桿菌基因組中引入丁酸合成途徑關鍵酶基因，敲除自溶調(diào)控基因和乙酸合成調(diào)控基因，構(gòu)建了高產(chǎn)丁酸的重組益生菌。通過評估產(chǎn)丁酸工程菌對高脂飲食誘導的肥胖小鼠的體重增加、內(nèi)臟脂肪堆積、肝臟損傷、葡萄糖耐受和胰島素抵抗的緩解改善情況，證明了產(chǎn)丁酸工程菌在肥胖預防管理方面的潛力。綜上所述，使用重組益生菌原位遞送抗肥胖藥物可能是預防或治療肥胖的一種有價值的策略。

2.2 糖尿病

糖尿?。╠iabetes）是一組以高血糖為常見表型的代謝性疾病，包括1 型糖尿?。╰ype 1 diabetes，T1DM）和2型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）［83］。除生活方式和飲食習慣外，越來越多的證據(jù)表明，腸道菌群在糖尿病的發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用［84-85］。糖尿病作為一種終身性疾病，很難完全治愈。目前治療糖尿病的一線藥物通常與非靶向性和低耐受性相關［86］?？乖f送是治療T1DM 的一種有吸引力的策略。Robert 等［87］和Takiishi 等［88］通過在小鼠腸內(nèi)釋放胰島素原和IL-10，改善了非肥胖性糖尿?。╪onobese diabetic，NOD）小鼠的T1DM發(fā)病率。Lang等［89］通過給NOD小鼠口服表達葡萄球菌核酸酶（staphylococcal nuclease，SNase）的重組乳酸乳球菌，降低了NOD 小鼠的發(fā)病率和死亡率。進一步研究表明，SNase 延緩T1DM 發(fā)作的機制與中性粒細胞胞外陷阱的早期干預有關。DiaPep277，一種衍生自熱休克蛋白的多肽，有助于控制自身免疫系統(tǒng)對β細胞的攻擊。之前已有研究指出，DiaPep277 以熱休克蛋白65（heatshock protein65，HSP65）為免疫原性載體經(jīng)鼻給藥可顯著降低NOD 小鼠的糖尿病發(fā)病率。然而，由于HSP65的自降解性質(zhì)，HSP65-6P277在治療過程中并不穩(wěn)定。為了提供大量融合蛋白并增強長期免疫耐受效應，Ma 等［90］構(gòu)建了腸內(nèi)原位表達HSP65-6P277 的乳酸乳球菌。給NOD 小鼠口服此重組乳酸乳球菌導致了NOD 小鼠血糖水平的下降和胰島炎癥的減輕。

除誘導免疫耐受外，一些工程益生菌還能刺激腸上皮細胞轉(zhuǎn)化為胰島素分泌細胞，恢復并維持腸內(nèi)分泌功能。Agarwal 等［91］將編碼GLP-1 的質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌中，開發(fā)了GLP-1 的活體口服給藥系統(tǒng)LL-pUBGLP-1。與對照相比，LL-pUBGLP-1 誘導了倉鼠胰島β 細胞分泌胰島素。Zucker 糖尿病肥胖大鼠模型在口服LL-pUBGLP-1 2～11 h 后血糖水平顯著降低，胰島素水平顯著增加。此外，Duan 等［92］的研究結(jié)果也證明了口服分泌GLP-1的共生細菌可以刺激腸上皮細胞轉(zhuǎn)化為胰島素分泌細胞，改善糖尿病大鼠模型中的高血糖癥。Exendin-4（Exd4）是GLP-1受體激動劑，由于其對二肽基肽酶4的抗性而具有更持久的生物活性，被認為是治療T2DM的有效藥物。進一步的研究發(fā)現(xiàn)，重組乳酸乳球菌分泌的Exd4增強了葡萄糖依賴性胰島素的合成，并激活了PI3-K/AKT信號通路［93］。

此外，通過直接遞送抗糖藥物，也可以達到治療糖尿病的效果。D-塔格糖是一種新型低熱量糖，對人體健康有許多益處，可以降低血糖、控制肥胖，并表現(xiàn)出強烈的抗生物膜作用。D-塔格糖可以作為食品添加劑添加到飲料、食品和保健品等產(chǎn)品中，替代蔗糖、葡萄糖、麥芽糖等傳統(tǒng)高能量糖類，是糖尿病患者的理想糖原。分泌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的重編程乳酸乳桿菌具有體內(nèi)原位生產(chǎn)D-塔格糖的能力，對糖尿病小鼠顯示出良好的降血糖作用［94］。

靶向代謝性疾病的微生態(tài)療法總結(jié)見表2。

表2 靶向代謝性疾病的微生態(tài)療法Tab.2 Intestinal microecological treatment for metabolic diseases

續(xù)表

3 靶向精神疾病的微生態(tài)療法

精神疾病是一組復雜的心理綜合征，主要表現(xiàn)為認知或行為的不同程度障礙［95］。近年來，隨著生活方式的改變（如長期酗酒和使用抗生素等），精神疾病的發(fā)病率逐年攀升，精神疾病患者也因此面臨著沉重的健康和經(jīng)濟負擔。常見的精神疾病包括抑郁癥和阿爾茨海默癥等，這些重大腦疾病都是我國即將啟動的“腦計劃”中重點支持的方向。目前，精神疾病的發(fā)病機制尚不完全明確，具有多種研究學說，基于這些學說開發(fā)的藥物僅在部分患者中表現(xiàn)出緩解作用。因此，研究人員要想實現(xiàn)精神疾病的精準治療，必須挖掘新的發(fā)病機制和治療靶點。腸道菌群被認為是治療精神疾病的下一個潛在靶點。它們可通過具有雙向調(diào)節(jié)作用的腸-腦軸與大腦發(fā)生聯(lián)系，從而影響大腦的發(fā)育并調(diào)節(jié)宿主行為，所以基于腸道菌群開發(fā)的新療法有望把精神疾病患者從沉重的疾病負擔中解脫出來。

3.1 抑郁癥

抑郁癥（depression）是臨床精神科中一類常見的精神疾病，也是導致殘疾和自殺的常見原因之一［96］。它具有患病率高、復發(fā)率高和疾病負擔沉重等特點。單胺假說、神經(jīng)內(nèi)分泌假說等都是目前較為公認的抑郁癥病因假說［97］，但針對這些假說開發(fā)的現(xiàn)有抗抑郁藥物對部分患者來說是無效的，這提示抑郁癥可能還存在其他的病理生理學機制。其中，腸道微生態(tài)失衡導致抑郁癥發(fā)病的機制受到越來越多研究人員的關注［98］。Zheng等［99］對接受健康志愿者或抑郁癥患者腸道菌群的無菌小鼠進行比較研究，發(fā)現(xiàn)接受抑郁癥患者菌群的小鼠表現(xiàn)出相似的抑郁樣行為且其碳水化合物和氨基酸代謝過程發(fā)生紊亂。另外，Strandwitz等［100］利用共培養(yǎng)方法鑒定出一系列與抑郁癥呈負相關的產(chǎn)γ-氨基丁酸（GABA）的擬桿菌屬，Medina-Rodriguez 等［101］通過分析應激誘導的抑郁小鼠的腸道菌群闡釋了分節(jié)絲狀菌通過自體誘導物Ⅱ類分子誘發(fā)小鼠抑郁樣行為的機制。這些發(fā)現(xiàn)都為闡明腸道菌群失調(diào)與抑郁癥的關系帶來了新啟發(fā)，也為抑郁癥的防治提供了新思路。

精神益生菌（psychobiotics）有望成為治療抑郁癥的新興療法。精神益生菌是一類可產(chǎn)生并遞送神經(jīng)活性物質(zhì)的益生菌，最早是由科克大學的神經(jīng)藥理學家John Cryan 和精神病醫(yī)生Ted Dinad［102］于2013 年共同提出的。精神益生菌可通過調(diào)節(jié)腸-腦軸的平衡起到抗抑郁作用。與傳統(tǒng)的抗抑郁藥物不同，精神益生菌的療效好副作用小，且具有改善焦慮和失眠等癥狀的多種生理功能，是治療抑郁癥的潛在藥物。產(chǎn)生GABA 等神經(jīng)遞質(zhì)是精神益生菌的一個重要標志性特征。嬰兒雙歧桿菌、瑞士乳桿菌和干酪乳桿菌等乳酸菌都是常見的精神益生菌，也是產(chǎn)生GABA 的重要微生物［103］。然而許多乳酸菌在合成GABA 方面顯示出菌株特異性，不同菌株的GABA 生產(chǎn)能力差異很大。因此，通過基因工程定向調(diào)控GABA 代謝通路是開發(fā)GABA 高產(chǎn)菌株的重要途徑。提高GABA 產(chǎn)量的直接方法是過表達谷氨酸脫羧酶（glutamic acid decarboxylase，GAD）基因［104-105］。此外，還可以通過利用葡萄糖直接生產(chǎn)GABA。為此，Van Dung 等［106］通過進行谷氨酸合酶、谷氨酸脫羧酶和GABA 轉(zhuǎn)運蛋白的共定位，將三羧酸循環(huán)通量重定向到GABA 途徑中，構(gòu)建了從頭合成GABA的大腸桿菌重組菌株。然而此類研究目前只停留在如何利用合成生物學和代謝工程技術對益生菌進行途徑改造提高產(chǎn)量的階段，未真正用于抑郁癥等精神疾病的治療研究?；诔墒斓臉?gòu)建策略，將已有的高產(chǎn)菌株與疾病防治研究相結(jié)合，開發(fā)從腸道著手治愈大腦的新療法，將會為抑郁癥的治療帶來新發(fā)現(xiàn)。

3.2 阿爾茲海默癥

阿爾茲海默癥（Alzheimer disease，AD）是一種以進行性認知功能障礙和記憶障礙為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病［107］。目前全球有超過5000萬人正在遭受AD 的影響，但AD 的治療仍然無藥可循。AD 的具體發(fā)病機制并不清晰，但有越來越多的研究表明腸道菌群與AD 之間具有緊密的聯(lián)系。與健康對照個體不同，AD 患者的菌群多樣性降低，脂多糖、淀粉樣蛋白等內(nèi)源性有害滲出物增加［8］。這些有害滲出物有可能進一步發(fā)生“泄漏”，通過體循環(huán)到達大腦部位誘導炎癥級聯(lián)反應，從而增加AD的發(fā)病風險［108］。

腸內(nèi)釋放對大腦有益物質(zhì)的工程益生菌或許可作為AD 的直接或輔助療法，成為臨床治療腦部疾病的新選擇。GLP-1除抗糖減脂作用外，可通過與神經(jīng)細胞的樹突膜或胞體膜上的受體結(jié)合預防β-淀粉樣肽的毒副作用，從而阻止或逆轉(zhuǎn)神經(jīng)退行性病變過程。陳廷濤團隊［109］已經(jīng)通過在乳酸乳球菌乳脂亞種中引入合成GLP-1 的基因片段，構(gòu)建了高效表達GLP-1 的工程益生菌。連續(xù)攝入這類工程菌的AD 小鼠的空間學習記憶障礙得以恢復，腦部的炎癥反應和海馬區(qū)β-淀粉樣蛋白的積聚減少。這些指標的改善主要與腸球菌等病原菌的生長被抑制、MAPKs 和PI3K/Akt 的磷酸化反應被破壞等過程相關［110］。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，鯊肌醇和多功能蛋白質(zhì)p62 也可以與β-淀粉樣肽相互作用，減輕腦部的炎癥反應。因此，Yamaoka 等［111］操縱枯草芽孢桿菌的肌醇代謝途徑將肌醇轉(zhuǎn)化為了鯊肌醇，構(gòu)建了用于生產(chǎn)鯊肌醇的細胞工廠；Cecarini 等［112］使用編碼p62 蛋白的工程乳酸乳桿菌，開發(fā)了用于治療早期AD 小鼠的活菌生物制劑。綜上所述，工程益生菌在防治AD 方面展現(xiàn)出了廣闊的前景，但到目前為止此類研究還多停留在細胞水平，因此針對此類工程益生菌有必要進一步開展體內(nèi)外驗證和機制探究工作。

靶向精神疾病的微生態(tài)療法總結(jié)見表3。

表3 靶向精神疾病的微生態(tài)療法Tab.3 Intestinal microecological treatment for mental illness

4 新一代微生態(tài)療法——人工合成腸道菌群

如上所述，益生元、益生菌、FMT 和工程益生菌在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)環(huán)境和防治重大慢病方面確實各有所長。然而，這些微生態(tài)療法的功能還是相對單一。因此，有必要開發(fā)新型微生態(tài)療法來完善現(xiàn)有的治療策略。人工合成腸道菌群是新一代微生態(tài)療法。人工合成腸道菌群的構(gòu)建允許以較低的復雜性利用改造的腸道微生物生成已定義的系統(tǒng)。人工合成腸道菌群能提高對環(huán)境脅迫因子的魯棒性，提高對復雜任務的功能可編程性［113］。盡管人工合成菌群已在能源開發(fā)、環(huán)境保護等領域進行了廣泛的應用基礎研究［34］，然而靶向腸道微生態(tài)的人工合成菌群的研究仍處于初級階段，面臨著一系列的機遇與挑戰(zhàn)（圖2）。

圖2 腸道微生態(tài)療法面臨的機遇與挑戰(zhàn)Fig.2 Opportunities and challenges for gut microbiome therapeutics

生物信息學、微生態(tài)學和合成生物學的快速發(fā)展加速了以合成腸道菌群為基礎的治療方法的研究。首先，明確腸道微生物群落中的種間相互作用對于設計合成綜合群落至關重要。評估微生物相互作用的一種簡單有效的方法是直接測量在共培養(yǎng)體系中生長的微生物物種的表型，對所有可能的兩兩相互作用進行研究。雖然這種方法在了解相對較少的群落時非常有效，但當我們試圖了解包含成百上千物種的腸道微生態(tài)系統(tǒng)時，需要有補充策略如二代機器學習［114］和薈萃分析［115］等。這對了解重大慢病狀態(tài)下腸道菌群之間復雜的相互關系及可能的生物機制具有重要作用，可以幫助研究人員從交互數(shù)據(jù)集中提取盡可能多的信息，從而鑒定健康或疾病狀態(tài)下的核心菌株或菌群、明確工程化的目標。其次，高通量培養(yǎng)組學［116］、宏基因組學［117］、全基因組代謝分析模型［118］、“即插即用”元件模塊實體庫和CRISPR 基因編輯工具［119］等技術平臺的開發(fā)優(yōu)化，擴大可選擇的合成生物學底盤的同時也對益生菌株實現(xiàn)了更高水平的控制。隨后，自上而下、自下而上等指導策略的提出，使以工程益生菌為基石的人工合成菌群的構(gòu)建成為了可能［120］。最終，研究菌群藥代動力學和藥效學的新工具的開發(fā)，如HUMiX［121］、類器官［122］、腸道芯片［123］、轉(zhuǎn)基因或人源化小鼠模型［124-125］等，將進一步明確人工合成腸道菌群“功能多樣性與物種多樣性”“功能冗余與系統(tǒng)魯棒性”的關系，指導候選藥物選擇和藥物開發(fā)過程，使藥物開發(fā)人員能夠從臨床前數(shù)據(jù)的集合中推斷人體給藥方案，為臨床試驗設計的劑量選擇提供信息。

雖然目前已有許多先進設計理念和技術的支持，但人工合成腸道菌群的研究并不順利。首先，細菌作為基因載體治療疾病的概念早在20 世紀90 年代就被提出［126］，但出于對基因工程安全性認知的缺陷，到目前為止真正用于臨床研究的工程菌還是寥寥無幾。工程菌確實存在將自身攜帶基因轉(zhuǎn)移給其他微生物的部分風險。但許多研究已經(jīng)通過編輯細菌的染色體而非質(zhì)粒來避免此類風險［127-128］。此外，研究人員還嘗試通過構(gòu)建營養(yǎng)缺陷型菌株，使工程菌無法在自然環(huán)境中存活，來減少工程菌轉(zhuǎn)移到其他宿主體內(nèi)的機會［129］。這些方法確實成效顯著，但沒有完全規(guī)避基因轉(zhuǎn)移等風險。免疫學家Carding 等［130］通過研究依賴胸苷存活的卵形擬桿菌發(fā)現(xiàn)，細菌間的基因交流導致了插入基因的隨意擴散，從而使卵形擬桿菌具有了合成胸苷的能力。因此，在利用工程益生菌構(gòu)建人工合成腸道菌群之前，需要通過實驗明確工

程益生菌的安全性。基因組學［131］、蛋白組學［132］等組學數(shù)據(jù)可以幫助研究人員獲得不具有致病基因等潛在危害因素的腸來源的益生菌底盤細胞，從而減少有害基因轉(zhuǎn)移事件的發(fā)生。MetaCHIP 等生物信息學分析工具可以通過分析群落水平上的基因轉(zhuǎn)移事件，幫助研究人員明確工程益生菌的潛在安全問題，從而使工程益生菌在解決未滿足醫(yī)療需求的關鍵領域時能得到公眾認可［133］。其次，傳統(tǒng)微生物群落研究一般采用自上而下或自下而上的策略，自下而上策略通常又有賴于群體感應系統(tǒng)或營養(yǎng)互補關系。Vedanta Biosciences 公司研發(fā)的由11 種微生物組合而成的先導藥物VE800，聯(lián)合Opdivo 療法已經(jīng)進入了一期臨床試驗［134］?；谌后w感應系統(tǒng)［135］或交叉喂養(yǎng)策略［136］開發(fā)的人工合成腸道菌群，已經(jīng)成功預測了細菌群落的動態(tài)變化，增加了復雜環(huán)境中種群的均勻性。然而，目前還沒有通過利用工程益生菌構(gòu)建人工合成腸道菌群用于重大慢病診療的相關研究。因此，先前的構(gòu)建策略需要進一步規(guī)范細化，構(gòu)建菌群所需的微生物種類和數(shù)量需要明確標準，以適應人工合成腸道菌群的構(gòu)建。另外，與其他傳統(tǒng)的治療方式不同，人工合成腸道菌群是一個活的并不斷生長的復雜微生物群體，它們與腸內(nèi)微生物及宿主之間不斷發(fā)生復雜的相互作用。因此在體外研究中表現(xiàn)良好的人工合成腸道菌群的體內(nèi)效果可能也會出現(xiàn)治療效果不佳的狀況，最終導致研究的失敗。所以明確人工合成腸道菌群各成員的體內(nèi)生長狀況、移植表達產(chǎn)物的安全劑量、與腸道微生物組現(xiàn)有成員的合作競爭關系及與宿主的相互作用對人工合成腸道菌群的優(yōu)化升級至關重要。最后，合成菌群系統(tǒng)的穩(wěn)健性及靈敏性需要不斷維護優(yōu)化，才能使其在病理條件存在或消失的情況下自動切換治療和非治療狀態(tài)，以應對復雜的慢病狀況。通過基因工程分泌卷曲纖維形成的水凝膠可原位包裹和保護工程益生菌，提高工程益生菌的穩(wěn)健性［137］。低氧或低pH 啟動子可控制工程益生菌在腸道內(nèi)的響應情況，增加工程益生菌的靈敏性［138］。這些單菌水平上的策略對人工合成菌群系統(tǒng)的構(gòu)建也具有指導作用，有利于提高人工合成菌群系統(tǒng)的穩(wěn)定性和靈敏性。

5 總結(jié)與展望

居住在人體腸道內(nèi)的微生物群與宿主形成了密切的共生關系，對維持宿主健康具有重要作用，同時它也是消化系統(tǒng)疾病、代謝性疾病和精神疾病等重大慢病防治的關鍵靶點。目前，許多研究已經(jīng)強調(diào)了以腸道微生物為靶點的益生元、益生菌和FMT 療法在重大慢病防治方面的重要作用。然而，由于安全性低、可控性差等問題的存在，這些傳統(tǒng)微生態(tài)療法的治療效果并不總是可靠的。作為另一種選擇，利用合成生物學技術開發(fā)的工程益生菌則表現(xiàn)出更高的穩(wěn)健性和可控性，成為了下一代微生態(tài)療法的重要組成。合成生物學技術可促進工程益生菌在腸道內(nèi)的定植和生長。利用合成生物學技術在益生菌表面展示配體、表達生物膜形成成分、合成黏附素或分泌卷曲蛋白［139］，可提高工程益生菌在腸黏膜上的黏附作用，改善工程益生菌的腸道定植策略，保護工程益生菌免受黏膜更新和胃酸的破壞作用，從而提高其穩(wěn)健性。合成生物學技術還可以增強工程益生菌的可控性，使工程益生菌在感知特異性群體感應信號分子［140］或非正常氧濃度［128］后才釋放治療藥物。此外，工程益生菌的可控性還可以通過設計營養(yǎng)缺陷型菌株來實現(xiàn)，從而確保工程益生菌的生物安全性［129］。目前，利用合成生物學技術，單菌的定制改造已初步實現(xiàn)。許多初創(chuàng)公司也已經(jīng)籌集了數(shù)億美元，啟動了相關臨床試驗。其中，合成學生物公司Synlogic被認為是這一領域的先驅(qū)。其用于治療苯丙酮尿癥的候選產(chǎn)品SYNB1618［141］和SYNB1934［142］目前已經(jīng)通過二期臨床試驗，并有望進入三期臨床試驗。Synlogic公司也正在評估用于治療腸高草酸尿癥、實體瘤和IBD 等疾病的候選藥物。此外，美國活體生物藥公司Novome Biotechnologies 也針對腸源性高草酸尿癥開發(fā)了候選藥物NOV-001，其一期臨床試驗結(jié)果表明該藥物中的工程菌株能夠在腸道內(nèi)安全定植，二期臨床試驗也正在進行中。雖然目前多家公司都在開展利用工程益生菌治療重大慢病的臨床研究，但還沒有一株工程益生菌獲得美國食品和藥物管理局的批準［143］。一些前期臨床試驗結(jié)果呈陽性的工程益生菌也未能通過后期的臨床試驗，這可能與復雜腸道微生態(tài)環(huán)境密切相關。

因此，考慮到單一工程益生菌負荷低、抗干擾能力弱、執(zhí)行復雜功能受限等問題，人工合成腸道菌群有望成為新一代的微生態(tài)療法。合成生物學應用于人工合成腸道菌群構(gòu)建有獨特優(yōu)勢，可塑性強。合成生物學可以根據(jù)不同個體的腸道微生態(tài)環(huán)境改造微生物構(gòu)建人工合成腸道菌群，同時檢測多種疾病標志物開發(fā)精準診斷產(chǎn)品，在不對其他細胞或組織產(chǎn)生損傷的情況下進行個性化治療、維護腸道健康。盡管合成生物學技術在人工合成腸道菌群研究中發(fā)揮著獨特的作用，具有較大的應用潛力，但仍有較多問題亟待解決。如何確保工程益生菌的安全性、如何規(guī)范構(gòu)建策略、如何明確人工合成腸道菌群的疾病診療機制、如何確保人工合成腸道菌群的穩(wěn)定性等問題仍未得到系統(tǒng)的回答。未來應深化合成生物學、材料學、微生態(tài)學等多學科的交叉，充分利用各學科的優(yōu)勢進一步開展人工合成腸道菌群的構(gòu)建工作，最終設計一套普適性強的人工合成腸道菌群構(gòu)建方法，助力人類健康產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。