合成免疫學與未來NK細胞免疫治療

畢嘉成，田志剛，2

（1 中國科學院深圳先進技術(shù)研究院，深圳合成生物學創(chuàng)新研究院，廣東 深圳 518055；2 中國科學技術(shù)大學免疫學研究所，安徽 合肥 230027）

1 合成免疫學驅(qū)動的腫瘤免疫治療

1.1 腫瘤免疫治療現(xiàn)狀概述

近年來，免疫治療在腫瘤等重大疾病治療領(lǐng)域的應用得到蓬勃發(fā)展，逐漸成為變革腫瘤治療的嶄新范式［1-3］。當前免疫治療主要包括通過單克隆抗體靶向“檢查點分子”的“檢查點療法”［4-5］，以及通過轉(zhuǎn)輸免疫細胞進行腫瘤治療的免疫細胞療法［6-7］。

其中“檢查點療法”主要通過單克隆抗體靶向阻斷免疫細胞表面的抑制性受體，從而解除抑制性受體介導的免疫抑制效應，釋放免疫細胞的抗腫瘤潛能。最具代表性的PD-1/PD-L1 單克隆抗體，通過阻斷PD-1 與PD-L1 之間的相互作用，激活抗腫瘤效應T 細胞發(fā)揮抗腫瘤效應。隨著基于PD-1/PD-L1 抗體單藥治療腫瘤臨床試驗的成功，PD-1/PD-L1 抗體聯(lián)合CTLA-4、TIGIT 等其他檢查點分子的聯(lián)合療法也相繼取得成功。作為免疫治療的重要方向之一，未來檢查點療法結(jié)合生物標志物的篩查，有望使該策略的應答水平進一步提高。

除了檢查點療法之外，免疫細胞療法是免疫治療中的另一個重要方向。免疫細胞療法主要包括基于T 細胞的CAR-T 療法和TCR-T 療法，以及基于NK 細胞、γδT 細胞等固有免疫細胞療法。CAR-T 療法主要通過設計構(gòu)建嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR），使T 細胞通過細胞外的單鏈抗體結(jié)構(gòu)域特異性地識別腫瘤抗原，并通過細胞內(nèi)的一個或多個活化性信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域觸發(fā)活化性信號，二者的結(jié)合能夠使得T細胞通過非MHC 限制性的方式特異性地識別預先設定的腫瘤抗原，并啟動T細胞的抗腫瘤效應功能［8］。除了CAR-T 外，CAR 裝載的NK 細胞也在臨床試驗中體現(xiàn)出較好的有效性［9］，而CAR 裝載的巨噬細胞目前仍在臨床前開發(fā)階段，其臨床治療腫瘤的有效性仍有待檢驗［10］。此外，基于T 細胞的免疫細胞療法也包括同樣在腫瘤免疫治療領(lǐng)域展現(xiàn)出潛力的TCR-T 療法［11］。TCR-T 療法主要通過對病人來源的T 細胞進行體外的基因修飾，以使這些T細胞表達針對特定腫瘤抗原表位的TCR 分子，從而獲得特異性識別腫瘤的能力。與CAR-T 細胞相比，TCR-T療法的優(yōu)勢是能夠使T細胞特異性地識別細胞內(nèi)表達的腫瘤抗原，因而TCR-T 療法與CAR-T 療法具有一定程度的互補性；但TCR-T 療法具有MHC 限制性，而目前所知的能特異性識別特定抗原表位的TCR數(shù)量非常有限。

盡管腫瘤免疫治療取得了上述進展，然而針對大多數(shù)種類的腫瘤，特別是實體瘤，當前免疫療法的療效仍有待提高。原因主要有以下幾點［12］：免疫細胞對腫瘤的識別精準度不足；免疫細胞對腫瘤組織的浸潤水平不足；免疫細胞受腫瘤微環(huán)境抑制；免疫細胞在腫瘤微環(huán)境中會進入耗竭狀態(tài)。為了提高免疫治療的有效性和安全性，亟需針對上述問題進一步發(fā)展免疫治療的技術(shù)和手段。

1.2 合成免疫學概述

“合成生物學”是指設計與構(gòu)建新的生物元件、裝置或系統(tǒng)，或?qū)ΜF(xiàn)有的天然生物系統(tǒng)進行再設計和再改造，以付諸應用［13-16］。合成生物學以理性設計、定量化、工程化和智能化等為核心理念和特征，在多個領(lǐng)域發(fā)展出一系列技術(shù)工具，為其廣泛應用奠定了堅實的基礎。合成生物學的理念與技術(shù)，結(jié)合日漸深入的免疫學基礎研究及日益豐厚的免疫治療實踐積累，驅(qū)動著一個嶄新學科的誕生與發(fā)展--合成免疫學［17-18］?！昂铣擅庖邔W”是指通過結(jié)合基礎免疫學知識與合成生物學技術(shù)手段，工程化構(gòu)建生物元件或裝置，通過重塑、糾偏、再造機體的免疫系統(tǒng)，實現(xiàn)對免疫應答的理性操控、進行重大疾病的免疫治療。合成免疫學的研究目標一方面是“致知”，即旨在進一步揭示免疫應答的調(diào)控機制；另一方面目標是“致用”，即通過理性設計、操控免疫應答的若干環(huán)節(jié)來實現(xiàn)重大疾病的免疫治療。合成免疫學的誕生與發(fā)展，代表著未來免疫治療的發(fā)展路徑，即從傳統(tǒng)以定性為主的經(jīng)典免疫學理論上升為定量、可控、規(guī)?；墓こ滩倏貫橹饕卣鞯男聲r代；合成免疫學的重要價值在于，有望通過合成免疫學的賦能，使未來免疫療法克服當前限制免疫治療療效的因素，從而實現(xiàn)更理想的治療有效性和安全性。NK 細胞是重要的抗腫瘤效應細胞，并在免疫治療領(lǐng)域相比其他免疫細胞類型具有獨特的優(yōu)勢，本文將對合成免疫學驅(qū)動的NK 細胞腫瘤免疫治療在未來的潛在發(fā)展路徑進行展望，介紹天然殺傷細胞（natural killer cell，即NK 細胞）的特性、NK 細胞在未來合成免疫細胞療法中的重要地位、合成免疫細胞及分子的設計等內(nèi)容。

2 基于NK細胞的下一代免疫治療路徑

NK 細胞是一種固有免疫細胞，主要通過細胞膜表面一系列活化性、抑制性受體識別泛特異性的分子模式，從而對惡性轉(zhuǎn)化或受感染的細胞進行識別和清除［19-21］。與T 細胞不同，NK 細胞不需要經(jīng)過預先致敏即可殺傷靶細胞。NK 細胞不僅在腫瘤轉(zhuǎn)移以及血液系統(tǒng)腫瘤等的免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要作用，而且NK 細胞在實體瘤中的水平也與病人良好的預后呈正相關(guān)［22］。更重要的是，NK細胞能在T 細胞所無法識別的MHC-I 低表達腫瘤中也發(fā)揮抗腫瘤效應［23］。由于NK細胞具備上述特征與獨特優(yōu)勢，基于NK 細胞的免疫療法是當前免疫治療領(lǐng)域的重要方向，其中主要包括NK 細胞療法［24-26］以及NK細胞檢查點療法［27-29］。

“底盤細胞”是指具備自我復制能力，能被人工修飾、改造以實現(xiàn)一定免疫學效應的免疫細胞。對底盤細胞的選擇和研究是免疫治療及合成免疫學研究的關(guān)鍵問題。當前的免疫治療以基于T細胞的策略占多數(shù)，但基于T細胞的免疫治療存在諸多不足［30-31］：T 細胞檢查點療法總體應答率偏低，腫瘤存在多種逃逸T 細胞應答的機制；CAR-T 和TCR-T 療法則在治療實體瘤方面面臨靶標抗原的丟失、免疫微環(huán)境抑制、免疫耗竭、較高毒性（細胞因子風暴、神經(jīng)毒性、移植物抗宿主反應等）、自體T 細胞質(zhì)量低下、制備時間及成本較高等問題。相比之下，NK 細胞療法則具備一系列對比優(yōu)勢，比如毒性較低、異體來源、貨架式供應模式等［24，32-34］，因而可能是未來免疫治療中更為理想的工程化底盤細胞。

例如，有研究發(fā)現(xiàn)，造血干細胞移植后，供者NK 細胞輸注的患者中，HLA 不完全匹配的NK細胞輸注，使患者的預后更好［35］，提示使用HLA不完全匹配的NK 細胞進行輸注治療可能具有更好的抗腫瘤效果。因此，NK 細胞治療所用的NK 細胞來源不受限于腫瘤患者自身，而可以來自異體健康人（包括外周血、臍帶血、誘導的多能干細胞等等）；在此基礎上，同一位健康人來源的NK細胞還可以用于多位不同配型的腫瘤患者的治療。這被稱為NK 細胞療法的“通用”特征［36-37］?；谶@一特征，提前將NK 細胞進行體外誘導發(fā)育、分化、大量擴增及凍存，隨時進行供應，能為腫瘤患者大大縮短等待治療的時間窗口，即為NK 細胞療法的“貨架式”供應模式。此外，由于NK 細胞療法毒性較小，NK 細胞療法可以施行多次反復的NK 細胞輸注，從而進一步提高療效。2020 年，NK 細胞療法迎來兩項重大突破：其一是不同來源的NK 細胞能夠?qū)崿F(xiàn)規(guī)?；臄U增生產(chǎn)；其二是異體CAR-NK 療法在實現(xiàn)同等療效的情況下，避免了CAR-T 療法的毒副作用［38］。這兩項突破意味著NK 細胞作為一種底盤細胞，從理論上具備作為免疫細胞療法的“通用型”底盤細胞的優(yōu)勢，這種策略不僅在臨床上有效、安全，而且具備規(guī)?；a(chǎn)工藝的可行性。

為了充分發(fā)揮NK 細胞療法的上述優(yōu)勢，在下一步研究中，需結(jié)合當前及未來合成免疫學的最新進展，對NK 細胞進行腫瘤感受器及基因回路等的設計與構(gòu)建，繼續(xù)發(fā)展NK 細胞的定向分化與無限量生產(chǎn)技術(shù)，并開發(fā)相應的自動化生產(chǎn)工藝。

3 合成免疫細胞的設計與生產(chǎn)

生物大分子藥物通常被設計用于中和或觸發(fā)特定靶分子的功能；而活細胞則可以執(zhí)行復雜程度更高的應答程序。以免疫細胞為例。免疫細胞能夠基于可精確定義的條件進行復雜環(huán)境信息的感知，隨后觸發(fā)執(zhí)行可編程的治療性應答。因而，免疫細胞療法在執(zhí)行智能程度較高的治療策略方面，相比生物大分子而言更具潛力，將在基于合成免疫學的未來免疫治療中扮演重要角色。下文將以NK 細胞為例，闡述其智能設計與人工合成的關(guān)鍵技術(shù)。

3.1 腫瘤感受器的合成組裝

免疫細胞對腫瘤細胞的精準識別是免疫細胞抗腫瘤療法的關(guān)鍵。裝載合成的抗原識別受體，將在NK 細胞對腫瘤細胞的固有識別方式基礎上，額外賦予NK 細胞以腫瘤特異性識別的能力?！缎掠⒏裉m醫(yī)學雜志》發(fā)表的一項里程碑式的研究表明，針對11 個病人，轉(zhuǎn)載CAR 的NK 細胞療法在8 個病人中體現(xiàn)出應答，而其中的7 個病人甚至在中位數(shù)13.8 個月的時間內(nèi)不再能檢測出疾病的指標［38］。該研究顯示CAR-NK 療法的良好耐受性以及較好的抗腫瘤療效，從概念上證明合成的抗原識別受體與NK細胞療法之間的相容性。

考慮到NK 細胞信號轉(zhuǎn)導規(guī)律的獨特性［39-40］，為了充分調(diào)動NK細胞的效應功能，CAR的設計需要適應NK 細胞特有的信號轉(zhuǎn)導規(guī)律［41-42］。比如，在CAR 的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導模塊設計上使用NK 細胞活化性受體的信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域［43］。研究表明，DAP12（活化性受體NKG2C、NKp44、KIR3DS1等的接頭蛋白）［44］、2B4.z（2B4受體的共刺激結(jié)構(gòu)域+CD3ζ 結(jié)構(gòu)域）［45］，以及DAP10.z（活化性受體NKG2D 的接頭蛋白+CD3ζ 結(jié)構(gòu)域）［46］等構(gòu)造顯示出較強的激活CAR-NK細胞的潛能。

3.2 NK細胞的定向分化與無限量生產(chǎn)技術(shù)

合成免疫細胞療法需要制備大量免疫細胞并進行基因改造，然而，免疫細胞作為接近于終末分化狀態(tài)的細胞，其體外擴增能力存在瓶頸。誘導多能干細胞技術(shù)的發(fā)展則為此提供了新的解決途徑。誘導多能干細胞具有類似胚胎干細胞的性質(zhì)，具備自我更新能力，能在體外進行大規(guī)模擴增，能通過基因編輯技術(shù)進行精確修飾和改造，并在特定條件下被誘導分化成特定類型的免疫細胞。而通過對誘導多能干細胞及進行NK 細胞定向分化的技術(shù)路線，有潛力形成“貨架式”供應的“通用型”免疫細胞療法［47］。

NK 細胞的定向分化技術(shù)是其中的關(guān)鍵，該技術(shù)主要包含兩個環(huán)節(jié)。首先，人胚胎干細胞以及人多能干細胞在基質(zhì)細胞等的輔助下產(chǎn)生CD34+CD45+造血前體細胞；隨后，將富集或流式分選所得的造血前體細胞在IL-3、IL-7、IL-15、SCF、FLT3L 等細胞因子組合的條件下誘導分化成NK 細胞［48-50］。研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)由干細胞分化所得的NK 細胞與原代分離的NK 細胞及NK92 細胞系等相比具有等同的效應功能，表明該技術(shù)路線是可行的，能用于免疫治療用NK細胞的制備［47］。

另一方面，免疫細胞的大規(guī)模擴增工藝也是實現(xiàn)“貨架式”供應“通用型”免疫細胞療法的一種關(guān)鍵技術(shù)。以NK 細胞為例，其擴增技術(shù)主要分為“使用飼養(yǎng)細胞”或“無飼養(yǎng)細胞”兩種方式。

“使用飼養(yǎng)細胞”策略通常選擇在NK 敏感靶細胞的表面過表達提供NK 細胞存活、增殖信號的細胞因子如膜型IL-15 或IL-21，以及能激活NK 細胞活化性受體的配體分子如4-1BB 等。有報道在K562-mb15-4-1BBL刺激下，NK細胞能在3周內(nèi)擴增數(shù)萬倍，并在8 周內(nèi)擴增至千萬倍［51］；而過表達膜型IL-21的腫瘤細胞膜提取物PM21能刺激NK細胞在14天內(nèi)擴增825倍［52］；另外，經(jīng)過TERT轉(zhuǎn)染的NK 細胞可以在K562-mb15-4-1BBL 刺激下持續(xù)被擴增超過1年［53］，等等。

盡管“使用飼養(yǎng)細胞”策略已被用于多項腫瘤治療的臨床試驗，但“無飼養(yǎng)細胞”策略長遠來說更具優(yōu)勢?！盁o飼養(yǎng)細胞”策略擴增所得的NK 細胞避免了飼養(yǎng)細胞摻入的風險，從而降低了質(zhì)控的難度?！盁o飼養(yǎng)細胞”策略擴增NK 細胞已有多項研究報道。比如通過培養(yǎng)瓶包被抗CD16 抗體，將PBMC 在AIM V 培養(yǎng)基、5%自體血漿、700 IU/mL IL-2的條件下進行培養(yǎng)，經(jīng)過前24小時OK432（力爾凡，即由溶血性蓮球菌Su 株經(jīng)青霉素處理、冷凍干燥制成的菌苗）的處理，在2～3 周 之 后 能 夠 獲 得4×109、純 度95.4% 的NK 細胞［54］。還有報道使用覆蓋了抗CD2、抗NKp46 抗體的珠子（miltenyi biotec）或類似的可溶性微球（Cloudz，R&D），在10 天內(nèi)獲得超過100 倍擴增的NK 細胞［55］。此外，使用CD34+臍帶血來源干細胞，在IL-2、IL-7、IL-15 存在的條件下也可以進行NK細胞的定向分化及擴增［49］。以及在細胞因子基礎上使用額外的輔助因子，比如曾有研究者在IL-15 和/或IL-2 基礎上結(jié)合煙酰胺或唑來膦酸及A類鏈球菌的使用，進行NK細胞的擴增［56-57］。

3.3 NK細胞的功能增效

免疫細胞療法盡管在血液腫瘤的治療中取得較大突破，但目前對實體瘤的治療仍面臨有效性不足的問題。主要原因有以下幾方面：①免疫細胞對腫瘤細胞的識別精準度不足；②免疫細胞對腫瘤組織的浸潤不足；③免疫細胞受腫瘤微環(huán)境抑制；④免疫細胞的耗竭狀態(tài)；⑤免疫細胞在體內(nèi)持續(xù)存活能力不足。為了進一步提升免疫細胞療法的有效性，未來可能從上述幾個方面入手，結(jié)合當前及未來合成免疫學的最新進展，對免疫細胞進行修飾或改造，從而實現(xiàn)免疫細胞的功能增效。

首先，NK 細胞可以進行腫瘤感受器如CAR分子的裝載，從而增強NK 細胞識別腫瘤細胞的特異性（3.1 節(jié)“腫瘤感受器的合成組裝”已有討論）。

其次，實體腫瘤組織中存在大量的細胞外基質(zhì)成分，阻礙著免疫細胞的遷移和浸潤［58］，有報道肝素酶［59］在免疫細胞浸潤腫瘤的過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，缺少肝素酶的NK 細胞對腫瘤浸潤水平降低、抗腫瘤能力大幅削弱［60］，因此，通過使NK細胞過表達肝素酶，有可能使得NK 細胞對腫瘤細胞外基質(zhì)降解能力提高，提高浸潤腫瘤的能力。

浸潤到腫瘤微環(huán)境中的NK 細胞還會受到來自微環(huán)境的免疫負調(diào)控細胞和因子的抑制，其中最具代表性的細胞因子是腫瘤壞死因子beta（tumor growth factor beta，TGF-β）［61］。TGF-β 能通過抑制NK 細胞的mTOR 信號通路從而抑制NK 細胞的活性［62-63］。而通過在NK細胞上過表達突變型的TGFβ 顯性陰性受體（mutant TGF-β dominant-negative receptor），能使NK 細胞在TGF-β 富集的腫瘤微環(huán)境中顯示出更強的腫瘤殺傷活性，并延長荷瘤小鼠的生存率［64］。

NK 細胞在腫瘤微環(huán)境中往往進入功能低下的免疫耗竭狀態(tài)，這與NK 細胞在腫瘤微環(huán)境中異常表達的檢查點分子有關(guān)［22］。其中，檢查點分子TIGIT 在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中在NK 細胞表面逐漸上調(diào)表達，并介導NK 細胞的腫瘤免疫耗竭，而通過單克隆抗體阻斷TIGIT 可以逆轉(zhuǎn)NK 細胞的免疫耗竭狀態(tài)，在一定程度上恢復其抗腫瘤功能［65］。根據(jù)這一原理，對NK 細胞進行Tigit基因的敲除，有可能增強NK 細胞在腫瘤微環(huán)境中抵抗免疫耗竭的能力。

在NK 細胞體內(nèi)存活能力方面，有報道對胞內(nèi)檢查點分子CIS［66］進行基因敲除，獲得的臍帶血或誘導多能干細胞來源的NK 細胞展現(xiàn)出更強大的抗腫瘤效能，伴隨著更強的mTOR 信號通路活性、更好的代謝狀態(tài)以及更強的體內(nèi)存活能力［67-68］。

3.4 NK細胞的“定制式+通用型+貨架式”供應

標準化和通用化是合成生物學的重要理念［69-72］，也是合成免疫學將賦予未來免疫治療的重要特征。標準化和通用化能解決當下免疫細胞來源不足、價格高昂等問題，同時將利于免疫治療符合監(jiān)管的要求。在該背景下，“通用型”免疫細胞療法的概念應運而生。

“通用型”免疫細胞療法通過提取健康人來源的免疫細胞，經(jīng)過體外基因修飾等工程化改造，然后大規(guī)模擴增及凍存，形成可以“貨架式”供應的工程化免疫細胞產(chǎn)品；當有患者需要進行治療時，根據(jù)對患者生物標志物的篩查結(jié)果，在數(shù)據(jù)庫中匹配最有可能產(chǎn)生應答的工程化免疫細胞產(chǎn)品，從而“定制”最合適患者的治療方案，快速地將產(chǎn)品復蘇并提供給患者進行臨床使用。NK細胞是一種具有殺傷功能的底盤細胞，NK 細胞免疫療法的優(yōu)勢之一是天然具備在同種異體間使用的特點，因而更容易實現(xiàn)“貨架式”供應［73］。NK細胞免疫療法與當前使用較多的自體免疫細胞療法［74-75］（如CAR-T、TCR-T 等）不同，其細胞來源不受限于患者自身，因而可以從來源廣泛的健康人獲取，從而進行大規(guī)模的提前制備。如此制備獲得的產(chǎn)品對不同的患者而言是“通用”的?！巴ㄓ眯汀泵庖呒毎煼ǔ藢⒋蠓档蜕a(chǎn)成本之外，還能夠執(zhí)行嚴格的質(zhì)控標準，有助于推動監(jiān)管法規(guī)的發(fā)展，利于免疫治療行業(yè)的推廣使用及長遠發(fā)展。因此，“通用型”免疫細胞療法是未來合成免疫細胞療法的關(guān)鍵之一。

3.5 創(chuàng)建“無人值守”的細胞工廠

合成免疫學驅(qū)動的下一代免疫治療，其核心在于免疫細胞底盤。包括化學藥和蛋白藥在內(nèi)的常規(guī)藥物是相對穩(wěn)定、均一、化學成分明確；而免疫細胞則是活的、可自我復制、會發(fā)生改變、能對環(huán)節(jié)產(chǎn)生響應的［6］。只有在生產(chǎn)工藝上盡可能地使細胞藥物具有相對穩(wěn)定的遺傳成分與細胞狀態(tài)，才能使免疫細胞治療達成目標的有效性與安全性。因而，免疫細胞生產(chǎn)環(huán)節(jié)的標準化及嚴格的質(zhì)控非常重要［76-78］。為了實現(xiàn)標準化和嚴格的質(zhì)控，需要改革當下集成度低、人手操作為主、產(chǎn)品質(zhì)量參差不齊的生產(chǎn)模式。

針對上述難題，工業(yè)界嘗試開發(fā)封閉式、自動化、可編程的細胞處理系統(tǒng)，即“細胞工廠”［79-81］。細胞工廠通過對實驗流程進行軟硬件編程，實現(xiàn)全流程自動化封閉式操作，從而產(chǎn)出質(zhì)量穩(wěn)定、批次間差異小、可重復性較高的細胞產(chǎn)品。由于細胞工廠消除了人工處理的環(huán)節(jié)及在不同設備之間人工轉(zhuǎn)移中間產(chǎn)物的步驟，從而系統(tǒng)性地降低潛在的污染風險、降低來自人工操作導致的批次間質(zhì)量差異。細胞工廠針對特定類型細胞產(chǎn)品進行調(diào)試及優(yōu)化的結(jié)果還可以應用于后續(xù)規(guī)模放大的生產(chǎn)流程。

目前“細胞工廠”主要覆蓋三個主要的生產(chǎn)工藝環(huán)節(jié)：原材料加工與儲存、產(chǎn)品擴容與增能、成品儲存與提貨。具體而言，原材料加工與儲存的環(huán)節(jié)包括有核細胞分離、凍存與復蘇；產(chǎn)品擴容與增能環(huán)節(jié)包括目的細胞分選、細胞擴增與分化、細胞洗滌與分裝；而成品儲存與提貨環(huán)節(jié)，包含細胞凍存、儲存與復蘇環(huán)節(jié)。此外，細胞的基因修飾與改造則根據(jù)具體細胞制備工藝的要求，可以以病毒載體等可選功能模塊的形式按需整合進入生產(chǎn)工藝流程中。目前每個實驗步驟都已有成品儀器被研制成功；而用以銜接不同儀器的機械臂技術(shù)、管路銜接技術(shù)及相關(guān)的軟件設計，國內(nèi)外多個單位已有一定的技術(shù)積累?？梢灶A見，經(jīng)過軟件和硬件的進一步整合，“貨架式”供應的免疫細胞治療產(chǎn)品的全流程“細胞工廠”生產(chǎn)線將很快能實現(xiàn)。屆時，以正常人的外周血作為起始原材料，經(jīng)過細胞工廠的擴增，在一個月內(nèi)擴增數(shù)千倍并規(guī)模凍存，一旦有患者需要用藥，即可在短時間內(nèi)復蘇細胞、運輸?shù)结t(yī)院住院部或門診供患者進行使用。

4 合成免疫分子的設計

免疫細胞的細胞間通訊主要通過自分泌或旁分泌細胞因子或趨化因子來實現(xiàn)［82］。細胞間通訊調(diào)控免疫細胞的招募、增殖、分化、死亡等環(huán)節(jié)，從而調(diào)節(jié)免疫應答。為了實現(xiàn)對免疫應答的人工操控，未來免疫治療將使用比天然細胞因子功能更強大、更安全可控的新分子。“合成免疫分子”作為合成免疫學驅(qū)動的未來免疫治療的重要組成部分，是指免疫治療中使用的經(jīng)過工程化改造的蛋白質(zhì)分子，這種蛋白質(zhì)分子經(jīng)過理性設計（工程化）、功能模塊的組合重構(gòu)等，從而使親和力和半衰期達到目的水平（定量化）；另一方面，使合成免疫細胞能夠表達、分泌經(jīng)過上述重組/重構(gòu)的免疫分子，實現(xiàn)目標的免疫調(diào)節(jié)效應。合成免疫分子由于具有復合的功能或條件響應性（智能化），因而能夠執(zhí)行天然蛋白質(zhì)分子所不具備的生物學功能。

4.1 免疫組學指導合成免疫分子的設計與使用

免疫組學是指免疫相關(guān)的組學技術(shù)，主要包括轉(zhuǎn)錄組［83］及蛋白質(zhì)組［84］，蛋白質(zhì)翻譯后修飾如磷酸化、乙?；⒎核鼗鹊慕M學分析，以及表觀遺傳學方面的基因組甲基化的全局信息等。免疫組學的發(fā)展和應用對合成免疫分子的設計與開發(fā)具有重要意義。腫瘤微環(huán)境的屬性取決于腫瘤類型、進展階段和“冷/熱”狀態(tài)等因素，其影響因素復雜多變，全面而準確地對腫瘤微環(huán)境進行描繪已成為當今腫瘤免疫學研究的關(guān)鍵挑戰(zhàn)［12］。未來不同層次的組學技術(shù)，特別是在單細胞水平、結(jié)合組織空間定位信息的情況下，將有機構(gòu)成完善的免疫組學系統(tǒng)分析體系。通過多學科交叉的合作，借助強大的生物信息學分析能力，整合不同層次的海量數(shù)據(jù)，從中提取具有生物學意義的信息，將為合成免疫分子的理性設計及生物標志物的發(fā)現(xiàn)提供重要的支撐。

首先，免疫組學可能提供免疫治療的新靶點及相關(guān)信息。比如，單細胞轉(zhuǎn)錄組可以揭示出腫瘤微環(huán)境中重要的抗腫瘤效應細胞群體，并提示群體特異性的潛在檢查點分子，描繪出腫瘤微環(huán)境中檢查點分子及其配體分子的完整表達譜，繼而推測可能涉及的細胞間相互作用關(guān)系，為新檢查點療法的開發(fā)提供重要的理論依據(jù)。

另一方面，生物標志物對包括免疫檢查點療法在內(nèi)的合成免疫分子的理性設計與臨床治療使用至關(guān)重要［85］，而免疫組學將有可能為上述免疫療法提供新的生物標志物。比如，PD-1/PD-L1 免疫檢查點療法的應答水平高度依賴于腫瘤局部高表達的PD-L1分子，因而通過PD-L1生物標志物的篩查，能夠預判腫瘤患者是否適用于PD-1/PD-L1免疫檢查點療法，從而通過腫瘤標志物的篩查提高患者應答療法的可能性［86］。

4.2 高效減毒細胞因子的設計與合成

合成免疫分子理性設計的重要目標是同時具備高效、減毒的特性［87-89］。比如，天然的IL-2分子在臨床使用中具有較大的毒性［90］，但研究發(fā)現(xiàn)IL-2分子的毒性在IL-2 受體的高親和力亞基CD25（IL-2Rα）的基因缺失小鼠中大為減輕［91］。因此，Garcia等［92］針對性構(gòu)建出的一種IL-2 超級細胞因子（Super-2）能夠繞過CD25來發(fā)揮功能。CD25是腫瘤微環(huán)境中富集的具有免疫負調(diào)控功能的調(diào)節(jié)性T細胞標志［93］。Super-2 的使用有可能在腫瘤微環(huán)境中激活T 細胞的應答，同時避免刺激調(diào)節(jié)性T 細胞的擴增。而為了在繞過CD25 的情況下同時進一步增強IL-2 的活性及穩(wěn)定性，Garcia 組與Baker組［94］合作開發(fā)了一種從頭設計合成分子的計算手段，得到的Neo-2/15 具有與天然IL-2 幾乎完全不同的序列（與天然IL-2 同源性僅在20%左右），它不僅可以繞開CD25 產(chǎn)生高效低毒的免疫學效應，而且具有更高的親和力和穩(wěn)定性。除了親和力、穩(wěn)定性外，基于氨基酸序列免疫原性的預測，人工合成免疫分子還可以通過使用較低免疫原性的序列，提高在體內(nèi)長期使用時的穩(wěn)定性及治療有效性。如此類似Super-2 和Neo-2/15 的高效減毒的合成免疫分子，或單獨用于治療，或聯(lián)合合成免疫細胞療法使用，或由合成免疫細胞分泌產(chǎn)生，在未來的免疫治療策略中，是調(diào)控免疫應答的啟動和終止的有力工具，能夠使免疫應答更有效、更安全地達成治療目標。

4.3 雙/多功能抗體

合成免疫分子的一種重要類別是雙功能抗體。

單克隆抗體藥物主要通過結(jié)合一個抗原表位產(chǎn)生生物學效應。單克隆抗體藥物在臨床治療腫瘤、自身免疫性疾病等的成功［95］，推動著抗體分子的工程化發(fā)展。與單克隆抗體相比，雙功能抗體可以同時結(jié)合兩個抗原表位，是一種代表性的合成免疫分子。雙功能抗體可以將效應細胞直接靶向腫瘤細胞，增強其細胞毒性；或激活/中和超過一個免疫受體分子，從而發(fā)揮特殊的生物學功能；與兩種單抗藥物聯(lián)合使用相比，雙功能抗體減少了藥物開發(fā)和臨床試驗的成本［96］。

目前獲批上市的具有腫瘤免疫學效應的雙功能抗體中，Catumaxomab 能夠同時靶向腫瘤表面抗原EpCAM和T細胞標志CD3［97］，而Blinatumomab可以同時結(jié)合B 細胞瘤標志CD19 和T 細胞標志CD3［98］。通過這樣的方式，這些抗體激活并招募殺傷性T細胞直接對腫瘤細胞進行攻擊，發(fā)揮抗腫瘤效應。

除此之外，雙功能抗體還可以同時靶向兩個腫瘤抗原，或兩種細胞因子，從而起到雙重的中和效應，比 如靶 向HER2/HER3［99］、IL-17A/IL-17F［100］等的雙特異性抗體。

因而，雙/多功能抗體是一種前瞻性的合成免疫分子技術(shù)，能發(fā)揮單抗藥物所不能及的生物學效應，但其產(chǎn)業(yè)化面臨的諸多挑戰(zhàn)，如生產(chǎn)工藝上的錯配問題、純化問題和穩(wěn)定性問題等等，仍有待進一步的研究投入才能解決［101-102］。

4.4 腫瘤新生抗原的預測指導合成免疫分子的設計

嵌合抗原受體是一類與免疫細胞療法密切相關(guān)的合成免疫分子［103-105］。前述章節(jié)中提到，免疫細胞療法的關(guān)鍵技術(shù)之一是通過“腫瘤感受器”即嵌合抗原受體的設計與構(gòu)建，使免疫細胞精準識別腫瘤細胞。作為一種能區(qū)分腫瘤細胞與正常細胞的合成免疫分子，嵌合抗原受體的設計難點在于精準地獲悉腫瘤特異性的抗原信息。在腫瘤發(fā)展過程中，腫瘤細胞會逐漸積累體細胞突變［106-107］，這些突變中的一部分會發(fā)生在蛋白質(zhì)的DNA 編碼區(qū)域，從而產(chǎn)生新的腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤新生抗原［108］。通過高外顯子測序進行初步篩選，然后對HLA-1 親和富集所得的抗原表位肽段進行質(zhì)譜分析，最后進行計算分析，從而得到獲取腫瘤新生抗原表位的序列信息［109-110］?；谶@些序列信息，就能夠精準地設計具有腫瘤特異性的嵌合抗原受體，從而使免疫細胞能夠精準識別腫瘤細胞。

4.5 人源化小鼠模型指導合成免疫療法

合成免疫治療策略的優(yōu)化設計，要求更完整地認識人類疾病的發(fā)病機制。然而，目前仍缺少能夠真實反映人類疾病發(fā)病機制的動物模型。小鼠的免疫系統(tǒng)和疾病模型與人體內(nèi)發(fā)生的真實情形有一定差距，導致很多在小鼠模型中觀察到的現(xiàn)象及揭示的規(guī)律無法在人類疾病中重現(xiàn)。為了解決這一問題，使 用 人 源 細 胞 在NOD（non-obese diabetic）-SCID（severe combined immunodeficient）-IL2γ-/-（即NSG 小鼠）［111］等免疫缺陷小鼠體內(nèi)重建人類免疫系統(tǒng)（HIS，humanized immune system）及人源組織器官［112］的方式，可以在小鼠體內(nèi)建立最大程度反映人類疾病發(fā)病機制的人源化小鼠模型，從而使免疫學基礎研究的結(jié)論更加準確，以及免疫治療策略的研發(fā)成功率更高。另一方面，腫瘤組織相比普通組織器官而言具有更復雜的區(qū)域特性［113］。真實的腫瘤微環(huán)境的形成，是一個腫瘤細胞與基質(zhì)細胞、免疫細胞等多種細胞類型相互作用下時間演進變化的結(jié)果。腫瘤患者來源的腫瘤組織可以最大程度地反映人類腫瘤微環(huán)境的屬性，因此，在免疫系統(tǒng)人源化小鼠基礎上，通過人源腫瘤組織來源移植瘤（PDX，patient-derived xenograft）［114］建立腫瘤模型，能夠建立最接近人類腫瘤組織區(qū)域特性的腫瘤模型。在此基礎上，進行多組學比對研究（Exome-Seq、Methylomics、Proteomics、Metabolomic、scRNA-Seq、CyTOF等等），可獲知接近于人類腫瘤微環(huán)境的全景信息，從而可以動態(tài)了解其抗腫瘤免疫應答，所獲取的海量信息將有助于設計更有效的合成免疫療法。

5 結(jié)語及展望

在前文中，我們對腫瘤免疫治療的現(xiàn)狀及未來可能的發(fā)展趨勢進行了描繪?？傮w而言，當代免疫治療已經(jīng)成為繼手術(shù)、放療、化療之后的又一重要范式，繼代表性的PD-1/PD-L1 檢查點療法和靶向CD19的CAR-T細胞療法之后，隨著越來越多適應證的一線治療方案獲批，免疫治療將在腫瘤治療等領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用，并將吸引越來越多研究資源的投入。此時更需要仔細分析免疫治療手段所處的發(fā)展階段，從而前瞻性地對關(guān)鍵突破方向進行布局。毋庸置疑，免疫治療近年來在腫瘤治療等領(lǐng)域取得了突破性的進展，然而有效性和安全性仍需進一步提高；盡管CAR-T療法等在一些血液系統(tǒng)腫瘤的治療中取得了較高的治愈率，但考慮到更多的腫瘤屬于實體瘤范疇，而CAR-T 療法及檢查點療法等對此的應答率仍偏低，因而免疫治療離治愈大多數(shù)腫瘤的目標仍有很大的距離。這種差距的內(nèi)在原因之一是我們對免疫細胞和分子的工程化改造仍處在早期階段，僅僅初步展現(xiàn)了人工操控免疫應答的潛力。而未來只有充分掌握免疫細胞和分子工程化改造的規(guī)律，才能充分調(diào)動免疫應答的潛力；而為了更好地揭示免疫細胞和分子工程化改造的規(guī)律，更根本的手段是進一步認識免疫應答的調(diào)控原理，特別是在作為工程學基礎的定量研究方面。

而此時合成生物學的發(fā)展則適逢其時地助推了這一發(fā)展趨勢。合成生物學更講究理性設計、定量化、工程化，正符合免疫治療從定性研究為主過渡到定量研究、工程化改造的發(fā)展階段?；赟ynNotch“與門”設計的雙抗原識別型CAR-T［115］、高效減毒“超級細胞因子”Super-2等［94］的從頭設計或理性設計等，正是合成生物學應用到免疫細胞或分子工程化改造的典范。除此之外，工程化改造免疫細胞及分子的“合成免疫學”領(lǐng)域正在揭示免疫治療在未來更多的可能性：免疫細胞療法將逐漸走向“通用型”的“貨架式”供應模式；NK 細胞作為免疫細胞治療行業(yè)的“后起之秀”，以其獨特的優(yōu)勢，將在“通用型”免疫細胞療法中嶄露頭角；精準設計的嵌合抗原受體及基因回路將賦予免疫細胞更高的“智能”和更強的療效；封閉式、自動化、可編程的“細胞工廠”將顛覆細胞治療行業(yè)“小作坊”式的普遍亂象，為行業(yè)的規(guī)?；?、規(guī)范化發(fā)展鋪平道路；免疫組學及人源化小鼠模型將提供更貼近人類疾病狀況的海量數(shù)據(jù)，為理性設計減毒增效的合成免疫分子奠定基礎，而合成免疫分子的使用，將結(jié)合合成免疫細胞療法，為人工操控免疫應答提供了更多的可能性。可以預期，合成免疫學將大大拓寬我們對免疫學基礎理論的認識，在更充分揭示免疫細胞及分子的工程化改造規(guī)律基礎上，將驅(qū)動未來免疫治療走上更高的舞臺。