CGF、PRF和PRP中各種生長因子定量分析

韓尚志 蘭玲莉 劉銳 孟凡利 陳喜波

血小板作為全血中最重要的組成部分之一，富含多種生長因子(GF)，例如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGFβ-1)、血小板衍生生長因子(PDGF-AB)、表皮生長因子(EGF)等。血小板可釋放多種因子在生理情況下發(fā)揮黏附、聚集、釋放及收縮功能，能參與機(jī)體凝血機(jī)制，且還在血栓形成、炎性反應(yīng)及免疫反應(yīng)等過程中發(fā)揮重要作用[1]。而富血小板血漿(PRP)作為第一代血小板濃縮物，是將新鮮全血通過特定離心方式得到的含高濃度血小板的血漿。在 1998 年 Marx 首先將 PRP 應(yīng)用于骨重建中。因其富含高濃度的血小板，含有高濃度促進(jìn)骨組織和軟骨組織再生修復(fù)的生長因子，對骨再生和傷口愈合有積極的作用[2]；富血小板纖維蛋白(PRF)是在 PRP 基礎(chǔ)上最早在法國由Choukroun等[3]提出的第二代血小板濃縮物。是在 PRP 的基礎(chǔ)上，在無任何化學(xué)添加劑的情況下制得的富含血小板的纖維蛋白，纖維蛋白的聚合過程類似于自然形成的過程，這樣一個纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)將導(dǎo)致一個更高效的細(xì)胞遷移和增殖，且能緩慢釋放生長因子，延長作用時間從而促進(jìn)傷口組織愈合；濃縮生長因子(CGF)是繼 PRP、PRF 之后第三代血小板濃縮物，是利用血液樣本和特殊的離心設(shè)備制備而出的更大、富含更高濃度生長因子的纖維蛋白團(tuán)塊，故這些團(tuán)塊具有更好的促再生能力和可塑性，更易于吸收[4]。PRP、PRF、CGF 作為血漿提取物研究的三個階段的產(chǎn)物，有著各自不同的臨床價值與應(yīng)用[5]。理論上講，CGF由于特殊離心過程使其比其他血小板濃縮物似乎含有更加豐富的生長因子。但是很少有研究來支持這一觀點(diǎn)。本研究的目的是評價CGF中主要生長因子的含量，并與PRP和PRF中的生長因子進(jìn)行比較。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取20名身體健康的志愿者，男12名，女8名，平均年齡41.3歲。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)所有志愿者都被告知實(shí)驗(yàn)的性質(zhì)，并簽署知情同意書。(2)志愿者均無全身系統(tǒng)性疾病，非孕婦或哺乳期女性。(3)過去3個月內(nèi)未服用任何影響血小板數(shù)量或功能藥物的患者，實(shí)驗(yàn)室檢查顯示血小板計(jì)數(shù)正常。

1.3 PRP的準(zhǔn)備 在晨起空腹?fàn)顟B(tài)下抽取志愿者靜脈血10 ml，將血液收集到含有10%檸檬酸三鈉溶液作為抗凝血劑的無菌離心管中(Greiner Bio-One,GmbH,Kremsmunster,Austria)。將試管以1 600 r/min離心6 min，這時離心管中的血液樣本分成兩層，上層是血漿、血小板和白細(xì)胞的混合物，下層是紅細(xì)胞。然后抽取上層和下層上3 mm紅細(xì)胞的血樣本，以900 r/min離心10 min，從而使得兩層分離，上層為缺血小板血漿(PPP)，下層為PRP(濃縮血小板、少量紅細(xì)胞和白細(xì)胞的混合物)。將大部分PPP抽取出來儲存在-80℃以供使用。將剩下的2 mm PPP和PRP混合收集。將含有1 000 U/ml牛凝血酶的10%氯化鈉容易以10∶1的比例混入到PRP試管中，在4℃條件下存儲12 h，然后以1 000 r/min的速度離心20 min，吸取上清液，在-80℃保存以用來測定生長因子的含量。

1.4 CGF的制備 在早晨空腹的情況下抽取志愿者靜脈血10 ml。將血液收集到不含抗凝劑的專用無菌離心管中(Greiner Bio-One，GmbH，Kremsmunster，Austria)中。然后使用CGF變速離心機(jī)離心(Medifuge，Silfradentsrl，索非亞，意大利)，方法為：加速30 s，2 700 r/min 2 min，2 400 r/min 4 min，2 700 r/min 4 min，3 000 r/min 3 min，然后減速36 s后停止。這時離心管中的血液樣本分為三層：(1)上層主要成分為血清為主(無纖維蛋白原和凝血因子的血液血漿，貧血小板血漿，PPP)；(2)中層包含CGF，白細(xì)胞和干細(xì)胞以及聚合纖維蛋白；(3)下層為紅細(xì)胞(RBC)層。抽吸PPP層并保存在-80℃下。在接近紅色界面處的CGF切成1～2 mm的小塊，并轉(zhuǎn)移至低溫小瓶中，將小瓶浸入液氮中5 min，然后在37℃下快速加熱5 min，反復(fù)3次。然后將小瓶在4°C(Eppendorf離心機(jī)，德國)中以1 000 g離心20 min。吸出上清液并儲存在-80℃下以測量生長因子。

1.5 PRF的準(zhǔn)備 在早晨空腹的情況下抽取志愿者靜脈血10 ml將血液收集到不含抗凝劑的專用無菌離心管中(Greiner Bio-One，GmbH，Kremsmunster，Austria)中。 通過將血液以2 700 r/min的速度離心12 min(德國，埃彭多夫)獲取PRF。 離心后血液樣本分為三層：上層為PPP層，中層為纖維蛋白凝塊(PRF)層，底部的RBC層。抽吸PPP層并保在-80℃下。在接近紅色界面處的CGF切成1～2 mm的小塊，并轉(zhuǎn)移至低溫小瓶中。將小瓶浸入液氮中5 min，然后在37℃下快速加熱5 min，反復(fù)此過程三次。 然后將小瓶在4℃(Eppendorf離心機(jī)，德國)中以1 000 g離心20 min。 吸出上清液并儲存于-80℃以測量生長因子。

1.6 量化生長因子 使用ELISA法評價了血小板中5個代表性生長因子的水平：血小板衍生生長因子-BB(PDGF-BB)，轉(zhuǎn)化生長 β-1(TGF-β1)，胰島素樣生長因子-1(IGF1)，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)。 使用酶標(biāo)儀(Bio-Rad，美國)在450 nm波長吸收下測量OD值。 根據(jù)制造商的說明測量生長因子的濃度。 對所有測定重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 3組PDGF-BB水平比較 3組間上層、中間層中PDGF-BB水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。組中間層PDGF-BB的水平均高于上層，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組PDGF-BB水平比較

2.2 3組TGF-β1水平比較 3組間上層、中間層TGF-β1水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組中間層TGF-β1水平均高于上層，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 3組TGF-β1水平比較

2.3 3組IGF-1水平比較 3組組間上層、中間層IGF-1水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，3組中間層IGF-1水平高于上層，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 3組IGF-1水平比較

2.4 3組VEGF水平比較 3組組間上層、中間層VEGF水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，3組中間層IGF-1水平高于上層，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表4。

表4 3組VEGF水平比較

2.5 3組bFGF水平比較 3組PPP層bFGF水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，PRF組、CGF組中間層bFGF水平明顯高于PRP組(P<0.01)，PRF組中間層bFGF水平與CGF組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5。

表5 3組bFGF濃度值水平比較

3 討論

本實(shí)驗(yàn)旨在研究測量CGF和其他血小板提取物中生長因子釋放濃度的可用數(shù)據(jù)。本研究證明了CGF是濃縮生長因子的混合物。 但是，五種比較活躍的生長因子中，我們檢測到只有bFGF因子在CGF和PRF中明顯高于PRP。

3.1 實(shí)驗(yàn)方法 PRP是血液借助外源性牛凝血酶而引發(fā)快速凝結(jié)過程產(chǎn)生的，其中的生長因子在凝結(jié)后10 min內(nèi)開始分解，超過95%的預(yù)合成生長因子在1 h內(nèi)被分解[16]，作用時間短暫。與PRP不同，CGF中的生長因子在凝結(jié)后不會立刻溶解，基質(zhì)添加物中的強(qiáng)纖維蛋白凝膠會緩慢地重塑[6]。與PRF相比，交替和可控的離心速度可以分離更大，更密的纖維蛋白基質(zhì)，形成纖維網(wǎng)格起到存儲作用，大量血小板夾在纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)中，這使得生長因子的釋放更加緩慢。因此，CGF延長了生長因子活性的持續(xù)時間。研究發(fā)現(xiàn)PRF可以在至少一周內(nèi)的時間持續(xù)釋放生長因子[7]。劉琳等[8]證明CGF可以在至少13 d內(nèi)持續(xù)釋放TGF-β1。此外，CGF制備過程中的離心分離步驟可以使血小板不斷碰撞和破裂，這也將改善生長因子的釋放[9]。因此從理論上講，CGF可以成為功能強(qiáng)大的生物支架，具有完整的生長因子庫。

研究表明，凍融法作為一種純粹的物理方法可以安全有效地激活血小板[10]。研究發(fā)現(xiàn)兩種PRP中PDGF-AA和TGF-β1的濃度之間沒有顯著差異[11]。在另一項(xiàng)研究中，Wen等[12]證明了凍融激活和凝血酶激活的PRP均可促進(jìn)人類牙髓細(xì)胞的增殖。此外，前者對細(xì)胞增殖的刺激作用強(qiáng)于后者。但是，一些作者發(fā)現(xiàn)血小板的激活方法在生長因子釋放方面有所不同。 Textor等[13]通過四種方法激活PRP：自體凝血酶，牛凝血酶，氯化鈣(CaCl2)或凍融法，結(jié)果表明，CaCl2激活PRP所產(chǎn)生的PDGF-BB釋放量明顯高于其他任何方法。通過四種不同的方法激活PRP后，TGF-β1的釋放具有可比性。需要更復(fù)雜的研究來識別或解釋不同文獻(xiàn)之間的差異。

Nishimoto等[14]發(fā)現(xiàn)，PRF底部的生長因子濃度最高。 他們的組織學(xué)觀察表明，血小板在PRF的黃色和紅色部分密集。 Rodella等[15]評估了CGF中TGF-β1和VEGF的表達(dá)，免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示CGF和RBC層均存在廣泛的免疫染色。 在本研究中，紅色界面的纖維蛋白阻滯被切為PRF或CGF。 凍融活化方法避免溶血之前，應(yīng)丟棄RBC層的大部分。存儲在RBC層中的生長因子可能會部分丟失，這可能會影響結(jié)果，造成實(shí)驗(yàn)誤差。

3.2 研究結(jié)果 在本研究中，我們清楚地證明了PRP，PRF和CGF含有豐富的生長因子。眾所周知，這些生長因子能有效促進(jìn)組織愈合和再生。有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在牙周炎患者牙根表面涂抹各種濃度的PDGF-BB，并在24 h后觀察成纖維細(xì)胞的黏附性和細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果表明，PDGF-BB誘導(dǎo)牙周膜成纖維細(xì)胞黏附牙根表面的最佳濃度為50 ng/ml[16]。 IGF-1對成骨細(xì)胞也具有劑量依賴性的趨化作用。PRP，PRF和CGF也有類似的趨勢。在體外，PRP中的血小板濃度與成人間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖，成纖維細(xì)胞的增殖以及I型膠原的產(chǎn)生存在劑量反應(yīng)關(guān)系[17]。在體內(nèi)，PRP可能以劑量依賴的方式在一定水平上對腸道吻合愈合產(chǎn)生積極影響，但當(dāng)其高度濃縮時會產(chǎn)生不利影響。在先前的研究中，證明了在一定濃度下，CGF以劑量依賴性方式顯著促進(jìn)人牙周膜細(xì)胞的增殖和堿性磷酸酶活性[18]。在未來的研究中，我們需要更多的數(shù)據(jù)來找到適合于不同臨床應(yīng)用的血小板濃縮液的合適治療劑量。

本實(shí)驗(yàn)表明， CGF中含有大量PDGF-BB，TGF-β1，IGF-1，VEGF和bFGF。 此外，CGF和PRF中的bFGF水平明顯高于活化PRP中的bFGF水平。 作為生長因子的儲存載體，CGF是組織工程和再生的新應(yīng)用。 CGF的簡便性和快速性為臨床應(yīng)用帶來了希望。 以后需要進(jìn)行更多精心設(shè)計(jì)的研究，以提供有關(guān)CGF傷口愈合和組織再生能力的確鑿證據(jù)。