雙奇保肺顆粒治療慢性阻塞性肺病機制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

鄭 奪，王 露，賈淑杰，陳 冠*

（1.天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所，天津 300020； 2.天津市海河醫(yī)院，天津市呼吸疾病研究所，天津 300350）

近年來呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)病率及病死率呈逐年上升趨勢，其中以慢性阻塞性肺疾病（COPD）為主的呼吸系統(tǒng)疾病，病情易反復(fù)，病程長，且由于COPD 患者長時間處于慢性炎癥狀態(tài)，并產(chǎn)生大量炎性因子，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞產(chǎn)生，引發(fā)粒細(xì)胞增殖與活化，容易誘發(fā)和加速并發(fā)癥的形成和發(fā)展［1-2］。

臨床針對COPD 患者，通常采用支氣管擴張劑、全身糖皮質(zhì)激素及抗生素等為主的藥物進(jìn)行強化和維持治療，以達(dá)到改善肺功能、解痙平喘的目的，但維持治療階段臨床患者經(jīng)常出現(xiàn)依從性差，自身防御和免疫功能降低，產(chǎn)生心肺并發(fā)癥等，治療效果不理想［3-4］。中醫(yī)藥對呼吸系統(tǒng)疾病的治療，體現(xiàn)出中醫(yī)藥治慢病的優(yōu)勢與特色。雙奇保肺顆粒（SQBF）由生石膏、麻黃、苦杏仁、甘草、蜜桑白皮、黃芩、魚腥草、龍葵、千日紅、炒僵蠶、地龍等組成，具有清熱化痰、止咳平喘的作用［5］，具有副作用小、療效顯著的特點，從整體出發(fā)，從多個角度及作用途徑進(jìn)行綜合治療。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析方法能夠在系統(tǒng)水平上，揭示中藥復(fù)方通過多成分、多靶標(biāo)而對機體發(fā)揮全方位、整體的調(diào)控作用機制。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，通過搜索數(shù)據(jù)庫收集SQBF 包含的化合物及其相對應(yīng)的靶標(biāo)，構(gòu)建和分析靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)，確定網(wǎng)絡(luò)中的重要靶標(biāo)，并對重要靶標(biāo)進(jìn)行功能富集分析，確立與COPD 之間的關(guān)聯(lián)作用，從分子水平闡明SQBF 治療COPD 的機制。

1 方法

1.1 慢性阻塞性肺病靶點的篩選 通過TTD、Drugbank、DisGeNET、GAD、KEGG 數(shù)據(jù)庫篩選慢性阻塞性肺?。–OPD）相關(guān)靶點。

1.2 雙奇保肺顆?；瘜W(xué)成分的篩選 本研究通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫、檢索雙奇保肺顆粒處方組成中15 味中藥（甘草、當(dāng)歸、紫菀、苦杏仁、馬兜鈴、旋覆花、防風(fēng)、麻黃、千日紅、龍葵、桑白皮、魚腥草、黃芩、瓜蔞、白果）的主要功效成分，以口服生物利用度OB≥30%、類藥性DL≥0.18 和藥物半衰期≥4 h 對上述成分進(jìn)行篩選；通過TCMID 數(shù)據(jù)庫及文獻(xiàn)獲取其他4 味中藥石膏、僵蠶、全蝎和地龍的主要化學(xué)成分。

1.3 雙奇保肺顆粒靶點預(yù)測 通過TCMSP 數(shù)據(jù)庫和SEA 數(shù)據(jù)庫獲取雙奇保肺顆?；瘜W(xué)成分的預(yù)測靶點，通過Uniprot 數(shù)據(jù)庫尋找適用物種為人的蛋白靶點。

1.4 雙奇保肺顆粒-疾病-靶點的合并 將獲得的雙奇保肺顆粒化合物靶點與COPD 相關(guān)靶點取交集，得到雙奇保肺顆粒作用COPD 的靶點。

1.5 雙奇保肺顆粒-疾病-靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 為了明確雙奇保肺顆粒對疾病靶點蛋白在系統(tǒng)水平上的相互作用，構(gòu)建雙奇保肺顆粒-疾病靶點的PPI 網(wǎng)絡(luò)。將獲得的交集靶點導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫中，限定物種為“Homo sapiens”，將評分條件設(shè)置為＞0.90，剔除離散蛋白節(jié)點，獲取蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)并保存為TSV 文件格式。獲取的數(shù)據(jù)導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化分析。

1.6 聚類分析 通過 MCODE 插件對雙奇保肺顆粒-疾病-靶點進(jìn)行聚類分析。

1.7 雙奇保肺顆粒-疾病-靶點的GO 和KEGG 富集分析 將獲得的 113 個雙奇保肺顆粒-疾病靶點導(dǎo)入Metascape 在線分析網(wǎng)站對其進(jìn)行GO 和 KEGG富集分析，最后將富集分析得到的結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 軟件進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 疾病相關(guān)靶點 通過TTD 數(shù)據(jù)庫獲取COPD 相關(guān)靶點 64 個、Drugbank 78 個 、DisGeNET 355 個、GAD 17 個、KEGG 數(shù)據(jù)庫 3 個，去重后共獲得疾病相關(guān)靶點458 個。

2.2 復(fù)方成分與靶點 復(fù)方共包含278 個名稱不同的化合物，其中甘草83 個、當(dāng)歸2 個、紫菀12 個、苦杏仁 6 個、馬兜鈴 10 個、旋覆花 18 個、防風(fēng) 10 個、麻黃 6 個、千日紅 2 個、龍葵 7 個、桑白皮 21 個、魚腥草6 個、黃芩 50 個、瓜蔞 10 個、白果 19 個、石膏 1 個、僵蠶4 個、全蝎11 個和地龍7 個，對應(yīng)不同的靶標(biāo)694 個。各中藥成分化合物和靶標(biāo)個數(shù)見表1。

表1 雙奇保肺顆粒包含的化合物和對應(yīng)的潛在靶標(biāo)個數(shù)（去重）

結(jié)果證實，雙奇保肺顆粒中不同活性化合物可作用于相同的靶點，同一個活性化合物也可作用于不同的靶點，反應(yīng)其多成分、多靶點干預(yù)慢性阻塞性肺病的作用模式。將694 個靶點與COPD 相關(guān)的藥物靶標(biāo)對比分析，交集歸納得到113 個與COPD 治療相關(guān)的潛在作用靶點。見圖1。

圖1 復(fù)方成分-疾病-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.3 復(fù)方-疾病-靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與聚類分析結(jié)果 將共有的113 個雙奇保肺顆粒-疾病-靶點導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫中并將評分條件設(shè)置為＞0.90，得到復(fù)方治療COPD 的PPI 網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)圖中共有95 個節(jié)點，321條邊，Cytoscape 可視化結(jié)果見圖2。

圖2 復(fù)方-疾病-靶點PPI 可視化網(wǎng)絡(luò)

利用Cytoscape 軟件中的Network Analyzer 插件計算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點degree，得到排名前20 位的靶點分別為：STAT3、IL6、TNF、CXCL8、NFKB1、IL1B、MAPK1、MAPK14、MAPK3、VEGFA、IL10、EDN1、TP53、MMP9、PTGS2、TIMP1、IL4、CCL2、TGFB1、NR3C1。通過MCODE插件進(jìn)行聚類分析后發(fā)現(xiàn)，雙奇保肺顆粒治療慢性阻塞性肺病治療靶點主要分為7 個聚類，見表2。

表2 雙奇保肺顆粒治療COPD 靶點聚類分析

2.4 雙奇保肺顆粒-疾病-靶點GO 和KEGG 分析 使用Metascape 數(shù)據(jù)庫對Cluster 1 的10 個核心靶點（STAT3、IL6、TNF、CXCL8、IL1B、IL10、IL4、CCL2、CXCL2、ICAM1）進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明雙奇保肺顆粒在干預(yù)和治療慢性阻塞性肺病過程中主要參與：慢性炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、白介素相關(guān)信號通路、細(xì)胞因子與炎癥反應(yīng)、上皮細(xì)胞凋亡過程的調(diào)控、白細(xì)胞遷移、miRNA 參與敗血癥的免疫反應(yīng)、Th17 細(xì)胞分化、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡過程的負(fù)調(diào)控、RNA 聚合酶Ⅱ?qū)?primiRNA 轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、細(xì)胞對生長因子刺激的反應(yīng)等過程；與趨化因子活性、受體結(jié)合，細(xì)胞因子活性、受體結(jié)合，生長因子活性、受體結(jié)合，G 蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合等分子功能有關(guān)。見圖3。

圖3 雙奇保肺顆粒-疾病-靶點GO 富集分析氣泡圖

KEGG 富集分析結(jié)果顯示，雙奇保肺顆粒在治療慢性阻塞性肺病的過程主要與Th17 細(xì)胞分化、IL-17 信號通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、TNF 信號通路、NOD 樣受體信號通路、NF-κB 信號通路、Toll樣受體信號通路等信號途徑有關(guān)。KEGG 分析圖見圖4。

圖4 雙奇保肺顆粒-疾病-靶點KEGG 富集分析氣泡圖

3 討論

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，依托化合物、蛋白、生物信息注釋等多個數(shù)據(jù)庫，構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)并對靶點通路進(jìn)行富集分析，系統(tǒng)地探討雙奇保肺顆粒治療慢性阻塞性肺病的作用機制，研究發(fā)現(xiàn)雙奇保肺顆粒治療慢性阻塞性肺病具有“多成分、多靶點、多通路”的作用特點。雙奇保肺顆粒-疾病-靶點PPI 網(wǎng)絡(luò)顯示STAT3、IL6、CXCL8、NFkB1、TNF 等靶點在干預(yù)治療慢性阻塞性肺病過程中發(fā)揮著重要作用。Th17 細(xì)胞的主要功能是促進(jìn)中性粒細(xì)胞的動員、募集和活化，介導(dǎo)促炎癥反應(yīng)，一系列細(xì)胞因子如TGFB、IL6、IL-9、IL-1、IL-23、IL-21、STAT3 參與了 Th17 細(xì)胞分化過程。Seung-Hyung Kim［6］等通過實驗證實中藥組合物通過阻斷IL-17/STAT3 途徑調(diào)節(jié)炎癥細(xì)胞因子和CXCL-2 的表達(dá)，從而更有效地抑制嗜中性氣道炎癥，說明篩選靶點可作用于炎癥的發(fā)展進(jìn)程。

本研究顯示，雙奇保肺顆?？赡苁峭ㄟ^調(diào)控免疫相關(guān)通路：IL-17 信號通路、細(xì)胞因子與細(xì)胞因子受體的相互作用、TNF 信號通路、NOD 樣受體信號通路、NF-κB 信號通路、Th17 細(xì)胞分化等信號途徑，起到抑制活化的細(xì)胞因子、消除炎癥的作用。

目前臨床上治療COPD 的藥物種類繁多，作用機制及作用時間各有不同，合理選擇能發(fā)揮協(xié)同作用的藥物，制定合理有效的治療方案，對COPD 的治療及延緩病情進(jìn)展至關(guān)重要［7］。研究過程中發(fā)現(xiàn)復(fù)方-疾病靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)中 MUC5AC、MUC1 靶點與STAT3 緊密關(guān)聯(lián)。有研究發(fā)現(xiàn)氣道黏蛋白MUC5AC和MUC5B 與COPD 患者的氣道黏液濃度升高密切相關(guān)，在嚴(yán)重的氣道阻塞狀態(tài)下，MUC5AC∶MUC5B 的比率更高［8］，這與臨床上雙奇保肺顆粒的平喘的適應(yīng)癥相對應(yīng)，有待于后期的深入研究和進(jìn)一步驗證。

綜上所述，本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對雙奇保肺顆粒的化學(xué)成分、作用靶點進(jìn)行了系統(tǒng)性分析，從分子水平闡述了該復(fù)方多成分、多靶點對機體的整體調(diào)控，為其后續(xù)深入的機制研究提供了方向和理論依據(jù)。