人參皂苷Rb1通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路抑制腎小管上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

劉志文 徐江雁 張振強(qiáng) 張效威 高改 王萌萌 王輝 李真珍 謝治深

中圖分類號(hào) R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2022）05-0535-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2022.05.05

摘 要 目的 研究人參皂苷Rb1（G-Rb1）對(duì)腎小管上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響及可能機(jī)制。方法 采用10 ng/mL 生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）誘導(dǎo)人腎小管上皮細(xì)胞HK-2發(fā)生EMT。觀察10、20、30 μmol/L G-Rb1作用48 h后HK-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化;測(cè)定1.0、2.5、5.0、10、20、30 μmol/L G-Rb1 作用24 h后人胚胎腎細(xì)胞HEK293中報(bào)告基因載體SBE轉(zhuǎn)錄活性，并測(cè)定上述濃度G-Rb1 作用24 h后對(duì)HK-2細(xì)胞相對(duì)活力的影響。檢測(cè)10、20、30 μmol/L G-Rb1作用24 h后HK-2細(xì)胞中α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、Ⅰ型膠原蛋白（COL-Ⅰ）、纖連蛋白（FN） mRNA的表達(dá);檢測(cè)10、20、30 μmol/L G-Rb1作用24 h后HK-2細(xì)胞中α-SMA、Smad家族成員3（Smad3）、磷酸化Smad3（p-Smad3）、COL-Ⅰ、FN和E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的表達(dá)。結(jié)果 10～30 μmol/L G-Rb1能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT，顯著抑制因TGF-β1刺激導(dǎo)致的SBE轉(zhuǎn)錄活性升高（P<0.05），并且對(duì)HK-2細(xì)胞的相對(duì)活力無(wú)明顯影響（P>0.05）。在TGF-β1誘導(dǎo)下，細(xì)胞中α-SMA、COL-Ⅰ、FN蛋白及其mRNA和Smad3、p-Smad3蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)（P<0.05），E-cadherin蛋白的表達(dá)顯著下調(diào)（P<0.05）;而G-Rb1則可有效地逆轉(zhuǎn)上述蛋白或mRNA的表達(dá)。結(jié)論 G-Rb1可在一定程度上保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞免受TGF-β1誘導(dǎo)引起的EMT，這可能與其抑制了TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活有關(guān)。

關(guān)鍵詞 人參皂苷Rb1;TGF-β1/Smad3信號(hào)通路;轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1;腎小管上皮細(xì)胞;上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化

Inhibition of ginsenoside Rb1 on the epithelial-mesenchymal transition of renal tubular epithelial cells by regulating TGF-β1/Smad3 signaling pathway

LIU Zhiwen1，XU Jiangyan1，ZHANG Zhenqiang1，ZHANG Xiaowei1，GAO Gai1，WANG Mengmeng1，WANG Hui2，LI Zhenzhen3，XIE Zhishen1（1. Academy of Chinese Medical Science， Henan University of Chinese Medicine， Zhengzhou 450046， China; 2. College of Pharmacy， Henan University of Chinese Medicine， Zhengzhou 450046， China; 3. Medical Research Center， the First Affiliated Hospital of Zhengzhou University， Zhengzhou 450052， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE To study the effects of ginsenoside Rb1 （G-Rb1） on epithelial-mesenchymal transition （EMT） of renal tubular epithelial cells and its potential mechanism. METHODS The growth factor β1 （TGF-β1） 10 ng/mL was used to induce EMT of human renal tubular epithelial cells HK-2. The morphological changes of HK-2 cells were observed after treated with 10， 20， 30 μmol/L G-Rb1 for 48 h. The transcriptional activities of biovector SBE in human embryonic kidney cell HEK293 were determined after 24 h treatment with 1.0， 2.5， 5.0， 10， 20， 30 μmol/L G-Rb1. Effects of above concentration of G-Rb1 on the viability of HK-2 cells were determined after 24 h of treatment. mRNA expressions of α-smooth muscle actin （α-SMA）， collagen Ⅰ （COL-Ⅰ） and fibronectin （FN） in HK-2 cells were detected after treated with 10， 20， 30 μmol/L G-Rb1 for 24 h. The expressions of α-SMA， Smad3， p-Smad3， COL-Ⅰ， FN and E-cadherin were detected after treated with 10， 20， 30 μmol/L G-Rb1 for 24 h. RESULTS G-Rb1 of 10-30 μmol/L significantly inhibited TGF-β1-induced EMT in HK-2 cells and? the increase of transcriptional activities of biovector SBE induced by TGF-β1 （P<0.05）， but had no effects on relative activities of HK-2 cells （P>0.05）. The protein and mRNA expressions of α-SMA， COL-Ⅰ and FN， the protein expressions of Smad3 and p-Smad3 were significantly up-regulated induced by TGF-β1 （P<0.05）， while the protein expression of E-cadherin was significantly down- regulated （P<0.05）; G-Rb1 could effectively reverse above protein or mRNA expressions. CONCLUSIONS G-Rb1 can protect renal tubular epithelial cells from EMT induced by TGF-β1 to a certain extent， which may be related to inhibiting the activation of TGF-β1/Smad3 signaling pathway.

KEYWORDS? ?ginsenoside Rb1;TGF-β1/Smad3 signaling pathway; transforming growth factor β1; renal tubular epithelial cells; epithelial-mesenchymal transition

糖尿病腎臟疾?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿病患者嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，且30%～47%的糖尿病患者都伴隨有DKD，而DKD是終末期腎病的主要原因[1-4]。上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是DKD發(fā)生的主要病理特征之一[5]。腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT后，會(huì)影響腎小管重吸收功能，并引發(fā)腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF），導(dǎo)致腎功能下降[6]。因此，抑制腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT可延緩DKD的進(jìn)程[7-8]。研究表明，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1/Smad家族成員3（transforming growth factor-β1/mothers against decapentaplegic homolog 3，TGF-β1/Smad3）通路的激活與DKD的發(fā)展及腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT密切相關(guān)[9]。TGF-β1能有效誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）如膠原蛋白、纖連蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）的表達(dá)[10-11]?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，人參能夠抗糖尿病，調(diào)節(jié)EMT[12-13]。人參皂苷Rb1（ginsenoside Rb1，G-Rb1）是人參的主要活性成分之一[14]。臨床上已有報(bào)道，G-Rb1能改善早期DKD患者的腎功能[15]。此外，G-Rb1可抑制FN、Ⅰ型膠原蛋白（collagen Ⅰ，COL-Ⅰ）和TGF-β1的表達(dá)，減輕小鼠腎組織損傷[16]。但G-Rb1是否能夠抑制TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT尚不明確。因此，本研究擬采用TGF-β1誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，探討G-Rb1對(duì)人腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的影響及其是否對(duì)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路有調(diào)節(jié)作用，為 G-Rb1 治療DKD提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有FORMA SERIES Ⅱ WATER JACKET 型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱、Multiskan GO型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;Eclipset S100型倒置顯微鏡（日本Nikon公司）;CKX41型熒光倒置顯微鏡（北京元中銳科集成檢測(cè)技術(shù)有限公司）;7500 Fast型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）儀（美國(guó)ABI公司）;Mini-protean 3 Dodeca型電泳系統(tǒng)、 ChemiDoc MP型全能型凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）。

1.2 主要藥品與試劑

本研究所用的主要藥品與試劑包括：G-Rb1對(duì)照品（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)41753-43-9，純度≥98%），人源TGF-β1試劑（美國(guó)PeproTech公司，批號(hào)100-21-10UG），特異性Smad3抑制劑SIS3鹽酸鹽（美國(guó)MCE公司，批號(hào)HY-13013/CS5768，純度98.02%），DME/F-12（1 ∶ 1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基（美國(guó)HyClone公司，批號(hào)SH30023.01），DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Corning公司，批號(hào)10013CVR），胎牛血清（美國(guó)Gibco公司），報(bào)告基因載體SBE（Smad binding element）質(zhì)粒（武漢淼靈生物科技有限公司，批號(hào)P0756），Luciferase Assay Sysem Free- zew Pack熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Promega公司，批號(hào)0000440829），BeyoRTM Ⅲ cDNA第一鏈合成試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號(hào)103118190503），Power UpTM SYBRTM Green PCR Master Mix（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)00837276），MTT檢測(cè)試劑盒、RIPA試劑盒、TritonX-100、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為725C056、R0010、T8200、PC0020），辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)BST14B25C15K27），兔源α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）多克隆抗體（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號(hào)GB111364），兔源FN多克隆抗體、兔源E-鈣黏蛋白（E-cadherin）多克隆抗體、小鼠源COL-Ⅰ單克隆抗體、小鼠源Smad3單克隆抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為15613-1-AP、20874-1-AP、66761-1-lg、66516-1-lg），兔源磷酸化Smad3（p-Smad3）單克隆抗體（美國(guó)CST公司，批號(hào)9520），小鼠源β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司，批號(hào)sc-8432），HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（美國(guó)Proteintech Group公司，批號(hào)分別為SA00001-1、SA00001-2）;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

人腎小管上皮細(xì)胞HK-2、人胚胎腎細(xì)胞HEK293均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將HEK293細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素混合液的DMEM高糖培養(yǎng)基中，將HK-2細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、1%青-鏈霉素混合液的DME/F- 12培養(yǎng)基中。待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)進(jìn)行傳代，取6～10代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 HK-2細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞，按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為對(duì)照組（含1‰二甲基亞砜的DME/F-12培養(yǎng)基）、TGF-β1組（10 ng/mL TGF-β1，質(zhì)量濃度參考文獻(xiàn)[17]設(shè)置）、SIS3組（10 nmol/L SIS3+10 ng/mL TGF-β1，陽(yáng)性對(duì)照藥SIS3的濃度參考產(chǎn)品說(shuō)明書設(shè)置）以及10 、20、30 μmol/L G-Rb1組（分別為10、20、30 μmol/L G-Rb1+10 ng/mL TGF-β1，G-Rb1濃度參考前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。加入相應(yīng)培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)48 h后，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并收集圖像。

2.3 HEK293細(xì)胞中SBE的轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定

采用熒光素酶報(bào)告基因法進(jìn)行測(cè)定。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞，按4×104個(gè)/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞融合度超過(guò) 80%時(shí)，將SBE質(zhì)粒用PolyJetTM DNA體外轉(zhuǎn)染試劑瞬時(shí)轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，6 h后更換DMEM高糖培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。將細(xì)胞分為對(duì)照組（含1‰二甲基亞砜的DME/F-12培養(yǎng)基）、TGF-β1組（10 ng/mL TGF-β1）、SIS3 組（10 nmol/L陽(yáng)性對(duì)照藥 SIS3+10 ng/mL TGF-β1）和不同濃度G-Rb1組（1.0、2.5、5.0、10、20、30 μmol/L G-Rb1+10 ng/mL TGF-β1），每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔;并另設(shè)空白對(duì)照組（該組無(wú)細(xì)胞只有DMEM高糖培養(yǎng)基）。加入相應(yīng)的培養(yǎng)液處理細(xì)胞24 h后，按照熒光素酶報(bào)告基因試劑盒方法進(jìn)行操作，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的熒光強(qiáng)度值，并計(jì)算相對(duì)熒光素酶活力：相對(duì)熒光素酶活力=（實(shí)驗(yàn)組熒光強(qiáng)度值-空白對(duì)照組熒光強(qiáng)度值）/（對(duì)照組熒光強(qiáng)度值-空白對(duì)照組熒光強(qiáng)度值）。相對(duì)熒光素酶活力越高，表示SBE的轉(zhuǎn)錄活性越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 HK-2細(xì)胞的相對(duì)活力測(cè)定

采用MTT法進(jìn)行測(cè)定。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞，按1×104個(gè)/孔接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按“2.3”項(xiàng)下方法分組（不設(shè)陽(yáng)性對(duì)照藥組;給藥組擴(kuò)大濃度范圍，加設(shè)1個(gè) 40 μmol/L G-Rb1組）及造模、給藥、培養(yǎng)，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。加入相應(yīng)培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后，每孔避光加入終質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h;棄去培養(yǎng)基，每孔加入二甲基亞砜 150? ? ?μL，振搖10 min。使用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔光密度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞的相對(duì)活力：細(xì)胞相對(duì)活力（%）=[（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）]×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 HK-2細(xì)胞中α-SMA、COL-Ⅰ、FN mRNA表達(dá)測(cè)定

采用RT-qPCR法進(jìn)行測(cè)定。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞，按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥、培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。采用Trizol 法抽提細(xì)胞中總RNA，驗(yàn)證總RNA純度后，按BeyoRTM Ⅲ cDNA試劑盒方法將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再按照Power UpTM SYBRTM Green PCR Master Mix試劑盒方法進(jìn)行RT-qPCR分析。反應(yīng)條件：50 ℃加熱 2 min，95 ℃預(yù)變性2 min;95 ℃ 變性15 s，60 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法分析各目標(biāo)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。引物序列由武漢淼靈生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小見(jiàn)表1。

2.6 HK-2細(xì)胞中α-SMA、E-cadherin、p-Smad3、Smad3、COL-Ⅰ、FN蛋白表達(dá)測(cè)定

2.6.1 Western blot法測(cè)定HK-2細(xì)胞中α-SMA、E-cadherin、p-Smad3、Smad3、COL-Ⅰ、FN蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞，按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥、培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將處理后的HK-2細(xì)胞用PBS清洗3遍，收集細(xì)胞，根據(jù)RIPA試劑盒說(shuō)明書方法提取細(xì)胞中總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量。將蛋白高溫變性后，進(jìn)行SDS凝膠電泳（55 V，30 min;120 V，60 min）分離，然后電轉(zhuǎn)至PVDF膜（電流350 mA），5%脫脂奶粉封閉2 h;加入一抗（β-actin、α-SMA、FN、p-Smad3一抗的稀釋比例均為1 ∶ 1 000，Smad3一抗的稀釋比例為 1 ∶ 3 000，COL-Ⅰ一抗的稀釋比例為1 ∶ 5 000，E-cadherin一抗的稀釋比例為 1 ∶ 10 000），4 ℃孵育過(guò)夜;TBST洗膜10 min×3 次，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例均為1 ∶ 10 000），室溫孵育2 h;TBST洗膜 10 min×4次，在自動(dòng)凝膠成像儀上顯影。使用Image J V1.8.0軟件測(cè)定各條帶的灰度值，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白（β-actin）條帶灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6.2 免疫熒光法測(cè)定HK-2細(xì)胞中α-SMA、E-cadherin、FN蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2細(xì)胞，按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，按“2.2”項(xiàng)下方法分組、造模、給藥、培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將處理后的HK-2細(xì)胞用PBS清洗3遍，于冰上使用4%多聚甲醛固定1 h，PBS洗去殘留的多聚甲醛;在室溫下使用0.3% TritonX-100透化30 min，使用山羊血清封閉2 h，加入α-SMA、FN、E-cadherin一抗（稀釋比例均為1 ∶ 250），4 ℃孵育過(guò)夜;除去一抗，PBS搖洗5 min×3次，加入相應(yīng)二抗（稀釋比例均為1 ∶ 300），避光孵育 1 h;除去二抗，PBS搖洗5 min×3次，避光加入DAPI 復(fù)染30 min;PBS搖洗后，加入熒光抗猝滅劑。在暗室中使用熒光倒置顯微鏡采集圖像，并使用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)定蛋白的熒光強(qiáng)度值，該值越大，表示目標(biāo)蛋白陽(yáng)性表達(dá)越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 6.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Dunnett法。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 HK-2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

對(duì)照組HK-2細(xì)胞具有典型的上皮細(xì)胞鋪路石樣形態(tài)特征，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，形成融合的單層細(xì)胞;TGF-β1組HK-2細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變，細(xì)胞拉長(zhǎng)且呈梭形、間隙增大，形態(tài)上趨向于成纖維細(xì)胞樣改變，具有EMT的典型特征;SIS3組和10、20、30 μmol/L G-Rb1組大多數(shù)HK-2細(xì)胞均保有典型的上皮細(xì)胞鋪路石樣形態(tài)特征。結(jié)果表明，G-Rb1能夠在一定程度上抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT。各組HK-2細(xì)胞的顯微圖見(jiàn)圖1。

3.2 HEK293細(xì)胞中SBE的轉(zhuǎn)錄活性測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組比較，TGF-β1組HEK293細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活力顯著升高（P<0.05）;與TGF-β1組比較，各給藥組HEK293細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活力均顯著降低（P<0.05），且G-Rb1的作用具有一定的濃度依賴趨勢(shì)。這說(shuō)明G-Rb1可抑制SBE的轉(zhuǎn)錄活性，也提示G-Rb1對(duì)TGF-β1/ Smad3通路的激活可能具有抑制作用。結(jié)果見(jiàn)表2。

3.3 HK-2細(xì)胞的相對(duì)活力測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組比較，TGF-β1組HK-2細(xì)胞的相對(duì)活力顯著降低（P<0.05）;與TGF-β1組比較，1.0～30 μmol/L G-Rb1組HK-2細(xì)胞的相對(duì)活力差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），說(shuō)明1.0～30 μmol/L G-Rb1對(duì)TGF-β1/Smad3通路激活的抑制不是由于影響了細(xì)胞活力導(dǎo)致的。結(jié)果見(jiàn)表3。

3.4 HK-2細(xì)胞中α-SMA、COL-Ⅰ、FN mRNA表達(dá)的測(cè)定結(jié)果

與對(duì)照組比較，TGF-β1組HK-2細(xì)胞中α-SMA、COL-Ⅰ、FN mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著升高（P<0.05）;與TGF-β1組比較，SIS3組、30 μmol/L G-Rb1組HK-2細(xì)胞中α-SMA、COL-Ⅰ、FN mRNA的相對(duì)表達(dá)量，20 μmol/L G-Rb1組HK-2細(xì)胞中COL-Ⅰ、FN mRNA的相對(duì)表達(dá)量和10 μmol/L G-Rb1組HK-2細(xì)胞中FN mRNA的相對(duì)表達(dá)量均顯著降低（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)表4。

a：與對(duì)照組比較，P<0.05 ;b：與TGF-β1組比較，P<0.05

3.5 HK-2細(xì)胞中α-SMA、E-cadherin、p-Smad3、Smad3、COL-Ⅰ、FN蛋白表達(dá)的測(cè)定結(jié)果

3.5.1 Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與對(duì)照組比較，TGF-β1組HK-2細(xì)胞中α-SMA、p-Smad3、Smad3、COL-Ⅰ、FN蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。與TGF-β1組比較，SIS3組和20、30 μmol/L G-Rb1組HK-2細(xì)胞中α-SMA、p-Smad3、Smad3、COL-Ⅰ、FN蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），E-cadherin蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）;10 μmol/L G-Rb1組HK-2細(xì)胞中p-Smad3、FN蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），E-cadherin蛋白的表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2和表5。

3.5.2 免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與對(duì)照組比較，TGF-β1組HK-2細(xì)胞中α-SMA、FN蛋白的熒光強(qiáng)度值均顯著升高（P<0.05），E-cadherin蛋白的熒光強(qiáng)度值顯著降低（P<0.05）。與TGF-β1組比較，SIS3組和10、20、30 μmol/L G-Rb1組HK-2細(xì)胞中α-SMA、FN蛋白的熒光強(qiáng)度值均顯著降低（P<0.05），E-cadherin蛋白的熒光強(qiáng)度值均顯著升高（P<0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖3（以E-cadherin蛋白的免疫熒光圖為例進(jìn)行展示，其余圖略）和表6。

4 討論

隨著人們生活水平的提高，DKD的患病率也呈升高趨勢(shì)，而目前臨床上尚無(wú)特效藥物治療DKD。DKD又被稱為腎小球硬化癥，主要病理表現(xiàn)為RIF，而腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT是RIF發(fā)生發(fā)展的主要環(huán)節(jié)[5-6]。Smad3是TGF-β1/Smad信號(hào)通路的關(guān)鍵因子，TGF-β1可通過(guò)下游的Smad3通路調(diào)控相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，參與EMT的進(jìn)程[9]。研究表明，TGF-β1/Smad3通路是EMT的主要通路之一[17-18]。α-SMA作為肌成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白，其在腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)水平的高低可間接反映腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的程度[19]。E-cadherin作為上皮細(xì)胞膜上的一種鈣依賴性黏附蛋白，對(duì)維持細(xì)胞間緊密連接、保持上皮細(xì)胞極性具有十分重要的作用，所以其也作為腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的一個(gè)重要指標(biāo)[19]。伴隨著腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，ECM成分（如COL-Ⅰ、FN蛋白）大量表達(dá)[6，19]，促進(jìn)RIF的發(fā)生發(fā)展。G-Rb1作為人參的主要成分，能夠有效改善DKD，但其對(duì)腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT的影響及機(jī)制尚未闡明。

本研究先使用TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT，以此來(lái)研究G-Rb1能否通過(guò)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3通路，從而抑制腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。結(jié)果顯示，TGF-β1作用于HK-2細(xì)胞48 h后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了EMT樣改變;細(xì)胞中α-SMA、COL-Ⅰ、FN蛋白及其mRNA的表達(dá)上調(diào)，E-cadherin蛋白的表達(dá)下調(diào)。而聯(lián)合給予不同濃度G-Rb1后，HK-2細(xì)胞中α-SMA、COL-Ⅰ、FN蛋白及其mRNA的表達(dá)不同程度下調(diào)，E-cadherin蛋白的表達(dá)不同程度上調(diào)。該結(jié)果提示，G-Rb1能夠在一定程度上抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT。

為了探究G-Rb1抑制TGF-β1誘導(dǎo)HK-2細(xì)胞發(fā)生EMT的機(jī)制，本研究使用HEK293細(xì)胞（轉(zhuǎn)染時(shí)的工具細(xì)胞），通過(guò)熒光素酶報(bào)告基因法探究G-Rb1對(duì)TGF-β1/Smad3通路激活的影響（SBE是TGF-β1/Smad信號(hào)通路激活報(bào)告基因載體，可利用SBE熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)評(píng)估G-Rb1對(duì)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的影響）。此外，為了排除基因轉(zhuǎn)錄活性下降是由于影響了細(xì)胞活力導(dǎo)致的，本研究設(shè)計(jì)了MTT實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)HK-2細(xì)胞的相對(duì)活力。結(jié)果顯示，與TGF-β1組比較，不同濃度G-Rb1組HK-2細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活力均顯著降低，且1.0～30 μmol/L G-Rb1對(duì)細(xì)胞的相對(duì)活力無(wú)顯著影響。該結(jié)果說(shuō)明，G-Rb1對(duì)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活具有抑制作用，且該作用不是因?yàn)橐种屏思?xì)胞活力引起的。并且，通過(guò)Western blot實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，給予不同濃度G-Rb1后，HK-2細(xì)胞中Smad3、p-Smad3蛋白表達(dá)也不同程度下調(diào)，這也進(jìn)一步證實(shí)了G-Rb1對(duì)TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活具有抑制作用。

綜上所述，本研究證實(shí)G-Rb1可在一定程度上保護(hù)腎小管上皮細(xì)胞免受TGF-β1誘導(dǎo)引起的EMT，這可能與其抑制了TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的激活有關(guān)。本研究初步解釋了G-Rb1在臨床上防治DKD的可能作用機(jī)制，但因研究對(duì)象為細(xì)胞，并不能完全模擬G-Rb1在人體內(nèi)的作用機(jī)制，故本研究仍存在一定的局限性，需進(jìn)一步驗(yàn)證。

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（收稿日期：2021-11-18 修回日期：2022-01-17）

（編輯：林 靜）

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