枸杞多糖對自噬的調(diào)控作用的研究進展

＊戴芷晴 管金山 徐小媛 姚心怡 焦旭穎 王月飛

（1.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院 黑龍江 161006 2.齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院生理教研室 黑龍江 161006）

枸杞子作為傳統(tǒng)中藥材，最早的記載可見于《神農(nóng)本草經(jīng)》，距今已有2000多年的使用歷史，其主要功效包括益精明目、滋補肝腎等。其中，枸杞多糖（Lycium Barbarum Polysaccharide，LBP）是其主要功效成分。枸杞多糖由葡萄糖醛酸、阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、木糖組成，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、抗衰老和保護神經(jīng)等多種生物活性。

自噬（autophagy）是一種細(xì)胞自食（self-eating）現(xiàn)象，包括三種形式：大自噬（macro-autophagy）、小自噬（micro-autophagy）和分子伴侶介導(dǎo)的自噬（Chaperon-Mediated Autophagy，CMA）。自噬能夠進溶酶體降解細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)成分，平衡在細(xì)胞生長發(fā)育或應(yīng)激條件下的細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。細(xì)胞內(nèi)的自噬失調(diào)被證明參與了各種疾病的進展，是近年來的熱點話題。枸杞對許多疾病具有雙向調(diào)控作用，和自噬在疾病中的表現(xiàn)相似，因此不少研究者將目光集中在枸杞與自噬的關(guān)系。近年來，許多研究也證明，枸杞多糖的細(xì)胞保護作用由自噬介導(dǎo)，但是其實驗對象、使用劑量、藥品濃度、作用靶點、調(diào)控效果各不相同。為了深入探究LBP對自噬的調(diào)控影響，闡明LBP防治疾病的機制及其通路，本文將整合國內(nèi)外最新研究，從動物模型到細(xì)胞，從調(diào)控效果到機制對LBP進行綜述。

1.枸杞多糖對細(xì)胞自噬的影響

(1)抑制自噬

生精功能障礙是糖尿病的第二大并發(fā)癥，研究表明，其與細(xì)胞自噬的過度激活有關(guān)，降低自噬水平能夠保護睪丸組織。Shi G J等人建立STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型，結(jié)果顯示LBP顯著減輕了STZ引起的睪丸損傷。通過q-PCR檢測小鼠的睪丸組織，與空白組相比，糖尿病組的LC3I和Beclin 1的基因表達水平上升，提示在受損的睪丸組織中自噬被過度激活，LBP組則顯著緩解了這一現(xiàn)象。Beclin-1是酵母自噬相關(guān)基因8（ATG8）的同系物，其編碼蛋白通過與Vps34結(jié)合參與自噬體的形成，促進自噬體成熟；LC3基因編碼的微管相關(guān)蛋白LC3（microtubule-associated protein 1 light chain 3）參與自噬小體的形成，兩種基因的表達水平下降證明枸杞多糖通過減少睪丸組織細(xì)胞的過度自噬，保護生殖功能。

(2)促進自噬

糖尿病周圍神經(jīng)病變（Diabetic Peripheral Neuropathy，DPN）是糖尿病常見的并發(fā)癥，在糖尿病大鼠模型中，脊髓損傷及功能障礙是DPN發(fā)生的重要病因，提高自噬通量可促進其功能恢復(fù)。劉思陽等人在STZ（Streptozotocin）誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，與糖尿病組大鼠相比，LBP組的痛覺超敏被改善；并且LBP組細(xì)胞中HSPB8、BAG3、LC3-Ⅱ蛋白表達量升高，P62蛋白表達量降低。p62，又稱SQSTM1，能夠?qū)⒌孜锇邢騻鬟f到溶酶體中進行降解，與LC3相互作用參與自噬形成。在自噬增加時，p62隨著底物被降解，其蛋白表達水平會下降，因此p62能夠負(fù)向反映自噬活性。HSPB8是小熱休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP）家族的一員，可以與BAG3蛋白形成HSPB8-BAG3復(fù)合體，該復(fù)合體能夠促進自噬體和溶酶體間的融合，參與自噬進程，該實驗結(jié)果提示LBP能夠促進自噬，緩解脊髓損傷。

通過比較上述兩個實驗，兩者共同采用STZ誘導(dǎo)建立的糖尿病模型，Shi GJ等人證明LBP能夠緩解睪丸組織的過度自噬，劉思洋等人證明LBP能夠促進腰段脊髓神經(jīng)組織自噬，緩解神經(jīng)損傷。這表明枸杞多糖能夠通過雙向調(diào)控自噬，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，然而其具體機制仍需進一步研究。

在肝癌細(xì)胞中，張多強等人研究發(fā)現(xiàn)，LBP抑制腫瘤細(xì)胞增殖，提高腫瘤細(xì)胞凋亡率，LBP與自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methy-ladenine）聯(lián)合應(yīng)用進一步提升了肝癌細(xì)胞的凋亡率。上述實驗證明了：①LBP能提升自噬小體含量，上升LC3-II/LC3-I比值。②LBP誘導(dǎo)的自噬作用可能為腫瘤細(xì)胞提供能量和營養(yǎng)，促進腫瘤生長，而使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-methy-ladenine）抑制了自噬小體的含量。自噬在腫瘤發(fā)生發(fā)展中具有雙面性：一方面，自噬能夠通過降解、清除功能紊亂的細(xì)胞器，誘導(dǎo)非凋亡性細(xì)胞死亡和凋亡，以及抑制炎癥反應(yīng)等途徑阻止癌癥的發(fā)生；另一方面，自噬能夠為癌細(xì)胞補充能量，使癌細(xì)胞存活。這提示枸杞多糖聯(lián)合自噬抑制劑或許能成為治療肝癌的一種新途徑。LBP對于自噬的調(diào)控在疾病進程中是否起到保護機體的作用需要更謹(jǐn)慎的研究，自噬抑制劑或自噬誘導(dǎo)劑是檢驗藥物是否通過調(diào)控自噬達到保護作用的重要方式。

2.枸杞多糖調(diào)節(jié)信號通路調(diào)控自噬

(1)PI3K/AKT/mTOR信號通路

雷帕霉素靶蛋白（mTOR）屬于磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）蛋白激酶類家族，與蛋白結(jié)合形成mTORC1復(fù)合物。PI3K/AKT是mTORC1的上游調(diào)控通路，活化的AKT能夠使mTORC1磷酸化，直接抑制自噬。

參考文獻中的研究證明，對于海馬神經(jīng)元的氧葡萄糖剝奪/再灌注損傷（OGD/R）模型，使用枸杞多糖后，細(xì)胞內(nèi)的LC3和Beclin 1的mRNA下降，導(dǎo)致自噬小體減少，p62蛋白水平上升；同時發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)蛋白AKT、mTOR、PI3K含量增加，聯(lián)用PI3K特異性抑制劑LY294002能夠減弱枸杞多糖的保護作用，證明LBP能特異性激活PI3K/AKT/mTOR通路，抑制神經(jīng)細(xì)胞的過度自噬，對細(xì)胞起保護作用。

p70S6K是mTOR信號通路的作用底物，被mTOR磷酸化后抑制自噬。Liu SY等證實了在糖尿病大鼠中使用枸杞多糖能夠下調(diào)mTOR含量，進而減少p70S6K，從而提示枸杞多糖可能通過抑制mTOR/P70S6K激活自噬。

(2)MAPK/JNK信號通路

絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated Protein Kinase，MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的各種生理活動，包括炎癥、炎癥反應(yīng)、應(yīng)激、細(xì)胞生長、分化和死亡等，其亞家族包括JNK1/2/3、ERK1/2、p38MAPK（p38α/β/γ/δ）、ERK7/8、ERK3/4和ERK5/BMK1（big MAP kinase 1）。其中，c-Jun氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK)主要通過調(diào)控自噬相關(guān)基因Beclin1影響自噬：在饑餓等應(yīng)激條件下，JNK能夠磷酸化Bcl-2蛋白，促進Bcl-2/Beclin1復(fù)合體解離，誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（Extracellular Signal-regulated Kinase，ERK）能通過上調(diào)LC3、p62等自噬相關(guān)蛋白誘導(dǎo)自噬，也能下調(diào)溶酶體相關(guān)膜蛋白1（lysosomal-associated membrane protein Lamp 1）的表達，阻止自噬體降解。

Zeng MH等通過用枸杞多糖干預(yù)人皮膚鱗癌細(xì)胞A431后，發(fā)現(xiàn)LBP能夠降低腫瘤的增殖率，提高凋亡率。將腫瘤細(xì)胞移植到小鼠后，經(jīng)LBP處理后的小鼠生存率顯著提升。檢查發(fā)現(xiàn)，LBP組細(xì)胞內(nèi)LC3II和p-ERK1/2/ERK1/2蛋白表達水平下降，p-JNK/JNK蛋白水平上升，提示LBP抑制癌細(xì)胞的自噬。聯(lián)用JNK抑制劑SP600125后，自噬相關(guān)蛋白水平顯著上調(diào)，提示枸杞多糖通過MAPK/JNK信號通路調(diào)節(jié)自噬。

在雙極脈沖電流誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞建立視神經(jīng)損傷模型中，LBP緩解了電刺激對自噬的抑制，減少了細(xì)胞凋亡率和氧化應(yīng)激水平。自噬抑制劑3-MA逆轉(zhuǎn)了LBP的細(xì)胞保護作用，自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素則強化了LBP的抗氧化應(yīng)激能力，證明LBP誘導(dǎo)的自噬在細(xì)胞保護中起重要作用。此外，該實驗還發(fā)現(xiàn)LBP能夠促進ERK磷酸化、抑制p38 MAPK磷酸化，證明LBP對MAPK通路具有調(diào)控作用。

3.枸杞多糖在細(xì)胞器層面影響自噬

(1)線粒體

線粒體在有氧代謝過程中產(chǎn)生了活性氧簇（Reactive Oxygen Species，ROS），線粒體受損導(dǎo)致ROS水平增加，高濃度的ROS激活細(xì)胞自噬清理受損線粒體和ROS，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。

嚴(yán)文英等研究表明，枸杞多糖一方面可以減少ROS及Ca2+含量，升高線粒體膜電位，減少凋亡蛋白的釋放；另一方面能夠提高p62的表達，減少LC3 II，終止自噬通量，提示枸杞多糖可能通過減少線粒體損傷，降低自噬水平。

(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)組裝和修飾蛋白質(zhì)的主要場所。當(dāng)細(xì)胞受到刺激后，錯誤折疊的蛋白蓄積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)將引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic Reticulum Stress），內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過激活PERK/ATF4、IRE1α、ATF6和Ca2+等信號通路激活自噬，清除蓄積蛋白，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷。Yang F等運用順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和自噬和沒有采用藥物干預(yù)的順鉑組相比，枸杞多糖能夠下調(diào)p-PERK、p-elF2α、ATF4等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的相關(guān)蛋白水平，減少LC3II含量，提示LBP能夠減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，逆轉(zhuǎn)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬，保護細(xì)胞的生存。

4.總結(jié)與展望

自噬廣泛存在于真核細(xì)胞中，在細(xì)胞生長發(fā)育和能量代謝中起關(guān)鍵作用，是維護細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要機制。近年來研究表明，枸杞多糖作為枸杞的主要活性成分，對腫瘤細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞等多種靶細(xì)胞的自噬具有雙向調(diào)控作用，其機制包括：改善線粒體損傷，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，調(diào)控自噬相關(guān)蛋白，調(diào)控mTOR、MAPK等信號通路。這些研究揭示了枸杞多糖參與自噬的作用靶點、信號通路、途徑等。

展望1：研究枸杞多糖調(diào)節(jié)自噬的信號通路。枸杞多糖調(diào)控自噬的研究仍不夠全面。自噬失調(diào)參與諸多疾病的進程，其上下游通路錯綜復(fù)雜，并與細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激等具有交叉信號通路，枸杞多糖參與自噬的調(diào)節(jié)機制仍需大量的基礎(chǔ)研究。

展望2：研究枸杞多糖調(diào)節(jié)自噬的效應(yīng)。如表1所示，和現(xiàn)有的自噬抑制劑或誘導(dǎo)劑不同，枸杞多糖既能通過激活自噬，調(diào)節(jié)細(xì)胞的能量水平，清除受損的細(xì)胞器，誘導(dǎo)癌細(xì)胞程序性死亡；也能抑制自噬，減少過度自噬對細(xì)胞的損傷。在不同研究中，枸杞多糖表現(xiàn)出不同的調(diào)控效果，其作用機制值得探究。現(xiàn)有研究中，杞多糖采用的劑量差異較大，調(diào)控效果和靶細(xì)胞的不同是否與劑量相關(guān)，枸杞多糖是否有最佳使用劑量，這些都值得進一步探索。

表1 枸杞多糖對自噬的調(diào)控作用

續(xù)表

綜上所述，枸杞多糖能夠調(diào)控自噬對機體起保護作用。研究枸杞多糖對自噬的調(diào)控效果和信號通路，能夠為中草藥提取物的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)，同時也為中藥探索自噬的作用靶點提供研究基礎(chǔ)，為精細(xì)化、現(xiàn)代化治療提供研究方向。本文期待為枸杞多糖乃至中藥提取物通過調(diào)節(jié)自噬治療疾病提供思路，為將來的藥物研發(fā)和臨床應(yīng)用提供研究方向。