蒸制和浸泡對(duì)四制益母草藥效成分的影響*

龍國(guó)斌 甘國(guó)興※ 向燕芬 朱衛(wèi)星 陳小銳 李潤(rùn)虹 陳海明

（1.清遠(yuǎn)市中醫(yī)院廣東省鮮藥民族醫(yī)藥工程技術(shù)研究中心，廣東 清遠(yuǎn) 511500；2.清遠(yuǎn)市中醫(yī)院藥學(xué)部，廣東 清遠(yuǎn) 511500；3.清遠(yuǎn)市食品藥品檢驗(yàn)所，廣東 清遠(yuǎn) 511500）

四制益母草是嶺南特色炮制中藥飲片，清代何克諫撰寫的《生草藥性備要》中記載四制益母草的炮制方法為“加童便米醋黃酒姜汁同浸也”[1]?！稄V東省中藥炮制規(guī)范》記載四制益母草炮制方法為“取凈益母草，用鹽、醋、姜和酒混合液拌勻吸盡后，蒸2 小時(shí)，曬干……”[2]。2 種炮制方法所用輔料和工藝均存在差異，工藝的差異主要是蒸制和浸泡這2 個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)。前期研究發(fā)現(xiàn)，童便、米醋、黃酒、姜汁混合液炮制的四制益母草中鹽酸益母草堿含量明顯高于鹽、米醋、黃酒、姜汁混合液炮制的四制益母草，而二者鹽酸水蘇堿含量相當(dāng)。本文以童便、米醋、黃酒、姜汁為輔料，考察蒸制和浸泡對(duì)四制益母草中藥效成分鹽酸益母草堿和鹽酸水蘇堿含量的影響，為優(yōu)化四制益母草炮制方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材與輔料 凈制益母草飲片（廣州市志寧藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)地：湖北，批號(hào)：190601）經(jīng)清遠(yuǎn)市中醫(yī)院朱衛(wèi)星主任中藥師鑒定為唇形科植物益母草Leonurusja ponicas Houtt.的干燥地上部分，黃酒（紹興吳越釀酒有限公司釀造，酒精度15%vol），9°米醋（山西老陳醋集團(tuán)有限公司生產(chǎn)），食用鹽（廣東省鹽業(yè)集團(tuán)有限公司專營(yíng)），生姜購(gòu)自清遠(yuǎn)市先鋒市場(chǎng)，童便取自一名5 歲健康男童。

1.1.2 儀器設(shè)備 2695-2489 型高效液相色譜儀（Waters公司）、WT3002 型電子天平（杭州萬特衡器有限公司監(jiān)制）、Agilent 1260 InfinityⅡ蒸發(fā)光高效液相檢測(cè)器（安捷倫公司）、XMTD-7000 型電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）、DHG-9023A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）、XS205 型十萬分之一分析天平（梅特勒-托利多公司）、DFT-100 型100 克手提式高速粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）等。

1.1.3 試劑 鹽酸益母草堿（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111823-201704）、鹽酸水蘇堿（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110712-201916）、1-辛烷黃酸鈉（河南省萬佳首化生物科技有限公司，批號(hào)：DE821040）、乙醇（廣州化學(xué)試劑廠，批號(hào)：2019030118，分析純）、磷酸（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20150804B，分析純）、乙腈（默克股份兩合公司，色譜純）、超純水等。

1.2 方法

1.2.1 輔料制備 取童便530 g，米醋530 g，黃酒530 g，生姜汁160 g（530 g 生姜榨汁所得），混勻即得。

1.2.2 炮制方法

1.2.2.1 潤(rùn)1 h 取凈制益母草飲片300 g，平均分為6份，每份50 g。取上述益母草飲片1 份，加入混合輔料16.5 g，拌勻悶潤(rùn)1 h，置電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中50 ℃干燥。

1.2.2.2 潤(rùn)1 h+蒸2 h 取上述益母草飲片1 份，加入混合輔料16.5 g，拌勻悶潤(rùn)1 h，置蒸鍋中蒸2 h，取出放涼，置電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中50 ℃干燥。

1.2.2.3 浸泡1 h 取上述益母草飲片1 份，加入混合輔料250 g（預(yù)實(shí)驗(yàn)提示5 倍量的輔料才能完全浸泡藥材）浸泡1 h，取出益母草飲片，收集浸泡液，益母草飲片置電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中50 ℃干燥。

1.2.2.4 浸泡1 h+蒸2 h 取上述益母草飲片1 份，加入混合輔料250 g 浸泡1 h，取出益母草飲片，收集浸泡液，益母草飲片置蒸鍋中蒸2 h，取出放涼，置電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中50 ℃干燥。

1.2.2.5 浸泡3 h 取上述益母草飲片1 份，加入混合輔料250 g 浸泡3 h，取出益母草飲片，收集浸泡液，益母草飲片置電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中50 ℃干燥。

1.2.2.6 浸泡3 h+蒸2 h 取上述益母草飲片1 份，加入混合輔料250 g 浸泡3 h，取出益母草飲片，收集浸泡液。益母草飲片置蒸鍋中蒸2 h，取出放涼，置電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中50 ℃干燥。

1.2.3 水分測(cè)定 分別取1.2.2 項(xiàng)下益母草炮制品和凈制益母草飲片粉碎，按照《中華人民共和國(guó)藥典》（以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》）[3]2015 年版四部水分測(cè)定法第二法（烘干法）測(cè)定其水分。

1.2.4 水溶性浸出物測(cè)定 分別取1.2.2 項(xiàng)下益母草炮制品和凈制益母草飲片粉碎，按照《中國(guó)藥典》[3]2015 年版四部浸出物測(cè)定法（通則2201）項(xiàng)下熱浸法測(cè)定不同益母草炮制品水溶性浸出物含量：取藥材粉末約2 g，置100 mL 錐形瓶中，精密加水50 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1 h，放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用水補(bǔ)足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 mL，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻30 min，迅速精密稱定重量，以干燥品計(jì)算供試品中水溶性浸出物含量（%）。

1.2.5 鹽酸水蘇堿測(cè)定

1.2.5.1 供試品溶液的制備 按照《中國(guó)藥典》[4]2015 年版中的方法，分別取1.2.2 項(xiàng)下益母草炮制品20 g，用手提式高速粉碎機(jī)粉碎，過3 號(hào)篩，取粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70 %乙醇25 mL，稱定重量，加熱回流2 h，放冷，再稱定重量，用70 %乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.2.5.2 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸水蘇堿對(duì)照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，即得。

1.2.5.3 含量測(cè)定 按照《中國(guó)藥典》[4]2015 年版中高效液相色譜法（通則0512）測(cè)定。以丙基酰胺鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-0.2%冰醋酸溶液（80∶20）為流動(dòng)相，用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器檢測(cè)，理論塔板數(shù)按鹽酸水蘇堿峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。分別取對(duì)照品溶液5、10 μL，供試品溶液20 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，用外標(biāo)兩點(diǎn)法對(duì)數(shù)方程計(jì)算，即得。

1.2.6 鹽酸益母草堿含量測(cè)定

1.2.6.1 對(duì)照品溶液的制備 取鹽酸益母草堿對(duì)照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1 mL 含30 μg 的溶液，即得。

1.2.6.2 含量測(cè)定 按照《中國(guó)藥典》[4]2015 年版中高效液相色譜法（通則0512）測(cè)定。以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，以乙腈-0.4%辛烷磺酸鈉的0.1% 磷酸溶液（24∶76）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為277 nm，理論塔板數(shù)按鹽酸益母草堿峰計(jì)算應(yīng)不低于6000。分別精密吸取鹽酸益母草堿對(duì)照品溶液和1.2.5.1 項(xiàng)下供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2 結(jié)果

2.1 四制益母草水分及水溶性浸出物含量 益母草水分含量為10.46%，符合2015 年版《中國(guó)藥典》的要求，不同炮制方法制備的四制益母草水分含量在5.96%～7.63%。益母草的水溶性浸出物含量為24.93%，符合2015 年版《中國(guó)藥典》的要求，不同炮制方法制備的四制益母草的水溶性浸出物含量在23.50%～26.70%，最高的是浸泡1 h+蒸制2 h 的四制益母草，最低的是浸泡3 h的四制益母草。浸泡后蒸制的四制益母草水溶性浸出物含量增加。結(jié)果見表1。

表1 四制益母草水分及水溶性浸出物含量 （n=3）

2.2 不同炮制方法對(duì)四制益母草中鹽酸水蘇堿含量的影響 益母草中鹽酸水蘇堿含量為0.980%，符合2015 年版《中國(guó)藥典》的要求。不同炮制方法制備的四制益母草中鹽酸水蘇堿含量在0.367%～0.933%，最高的是潤(rùn)1 h 的四制益母草，最低的是浸泡3 h+蒸制2 h 的四制益母草。蒸制會(huì)導(dǎo)致四制益母草中鹽酸水蘇堿含量減少，浸泡會(huì)導(dǎo)致四制益母草中鹽酸水蘇堿含量明顯減少。結(jié)果見表2，圖1。

圖1 鹽酸水蘇堿高效液相色譜圖

表2 不同炮制方法對(duì)四制益母草中鹽酸水蘇堿含量的影響（n=3）

2.3 不同炮制方法對(duì)四制益母草中鹽酸益母草堿含量的影響 益母草中鹽酸益母草堿含量為0.139%，符合2015年版《中國(guó)藥典》的要求。不同炮制方法制備的四制益母草中鹽酸益母草堿含量在0.070%～0.120%，最高的是潤(rùn)1 h 的四制益母草，最低的是浸泡3 h+蒸制2 h 的四制益母草。蒸制會(huì)導(dǎo)致四制益母草中鹽酸益母草堿含量減少，浸泡會(huì)導(dǎo)致四制益母草中鹽酸益母草堿含量明顯減少。結(jié)果見表3，圖2。

圖2 鹽酸益母草堿高效液相色譜圖

表3 不同炮制方法對(duì)四制益母草中鹽酸益母草堿含量的影響（n=3）

3 討論

中藥炮制與其臨床療效密切相關(guān)。宋代《太平圣惠方》就提出：“炮制失其體性，篩羅粗惡，分劑差殊，雖有療疾之名，永無必愈之效，是以醫(yī)者必須殷勤注意”。明代《本草蒙筌》又載：“凡藥制造，貴在適中，不及則功效難求，太過則氣味反失……”。清代《修事指南》又載：“炮制不明，藥性不確，則湯方無準(zhǔn)，而病癥不驗(yàn)也”。益母草始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有活血調(diào)經(jīng)，利尿消腫，清熱解毒等作用，用于月經(jīng)不調(diào)，痛經(jīng)經(jīng)閉，惡露不盡，水腫尿少，瘡瘍腫毒。歷代醫(yī)方本草對(duì)益母草炮制方法記載頗多，包括炒制、制炭、酒制、醋制、蜜制和四制等。

四制益母草是嶺南特色炮制中藥飲片，四制能夠增強(qiáng)祛瘀生新作用。藥理研究表明，益母草活血化瘀的主要成分是鹽酸益母草堿和鹽酸水蘇堿。本研究中，潤(rùn)法炮制的四制益母草，蒸制與未蒸制對(duì)水溶性浸出物基本無影響，蒸制后鹽酸水蘇堿含量略微減少，鹽酸益母草堿含量明顯減少。浸泡炮制的四制益母草，蒸制后水溶性浸出物增加，鹽酸水蘇堿含量和鹽酸益母草堿含量均減少。與潤(rùn)法相比，浸泡炮制的四制益母草鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿含量均明顯減少。研究結(jié)果表明，蒸制對(duì)鹽酸益母草堿影響較大，浸泡會(huì)造成鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿明顯減少。

《生草藥性備要》中記載四制益母草的炮制方法為“加童便米醋黃酒姜汁同浸也”。本研究結(jié)果表明，浸泡會(huì)造成益母草主要藥效成分鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿明顯減少，因此認(rèn)為浸泡法炮制四制益母草是不合理的?！稄V東中藥炮制規(guī)范》記載四制益母草炮制方法為“取凈益母草，用鹽、醋、姜和酒混合液拌勻吸盡后，蒸2 小時(shí)，曬干……”。本研究結(jié)果提示，蒸制對(duì)鹽酸益母草堿影響較大，蒸制后鹽酸益母草堿含量明顯減少，馬恩耀[5]研究發(fā)現(xiàn)蒸制超過1 h 的四制益母草中鹽酸水蘇堿和鹽酸益母草堿均減少，因此認(rèn)為蒸制2 h 是不合理的。本研究只是初步探討蒸制和浸泡對(duì)四制益母草鹽酸水蘇堿、鹽酸益母草堿和水溶性浸出物的影響，研究結(jié)果可能沒有全面系統(tǒng)地反映蒸制和浸泡對(duì)四制益母草質(zhì)量的影響，今后將進(jìn)一步深入研究闡明蒸制和浸泡對(duì)四制益母草質(zhì)量的影響，為優(yōu)化四制益母草炮制方法提供參考。