大腸桿菌及脂多糖對奶牛乳腺上皮細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)的影響

張媛媛，丁玉林，劉雅鑫，李曉華，高 瓊，王鳳龍

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

奶牛乳腺炎是乳腺組織受到病原微生物感染或理化因素刺激等發(fā)生的炎癥反應(yīng)，可導(dǎo)致奶牛泌乳量減少、奶品質(zhì)下降、生長發(fā)育減緩、繁殖力降低、產(chǎn)奶年限縮短和死淘率上升[1]。奶牛乳腺炎可導(dǎo)致乳腺纖維化，主要病理變化為乳腺組織內(nèi)纖維結(jié)締組織增多，實質(zhì)細(xì)胞減少，持續(xù)進(jìn)展可使乳腺結(jié)構(gòu)破壞和功能減退[2]。奶牛乳腺上皮細(xì)胞（bovine mammary epithelial cells，BMECs）具有天然免疫功能，在感染的早期，能夠及時識別病原并釋放細(xì)胞因子，以阻止病原侵入和增殖，并介導(dǎo)表達(dá)促炎因子誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。在炎癥后期，細(xì)胞再生與肉芽組織增生修復(fù)損傷使上皮細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)分化，形成活化的肌纖維母細(xì)胞，進(jìn)而引發(fā)纖維化[3]。細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的過度合成、分解ECM 的基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）表達(dá)受阻或是基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子（tissuse inhibitors of matrix metalloproteinases，TIMPs）的過度表達(dá)，是組織器官纖維化的主要原因[4-5]。MMPs 是一類依賴于Zn2+/Ga2+等金屬離子的內(nèi)肽酶，能夠降解ECM 的不同成分[6]。MMPs 的催化活性主要在基因表達(dá)、酶原激活和特異性抑制劑（金屬蛋白酶組織抑制劑TIMPs 和非特異性蛋白酶抑制劑）3 個方面受到調(diào)控。尿激酶型纖溶酶原激活物（uPA）系統(tǒng)主要包含uPA、uPAR和PAI-1。uPA可以催化纖溶酶原（Plg）轉(zhuǎn)化為有活性的纖溶酶，在ECM 蛋白降解過程中發(fā)揮作用[7]；PAI-1 通過調(diào)節(jié)ECM 的降解和沉積、刺激細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附作用等過程，參與組織器官纖維化等疾病的發(fā)展[8]。

大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）是引起奶牛乳腺炎的主要病原菌之一，是一種無芽孢的革蘭氏陰性短桿菌[9]。它是條件性致病菌，通常大多數(shù)作為正常菌群存在于機(jī)體胃腸道中，少部分在一定條件下引起組織器官感染[10]。由大腸桿菌導(dǎo)致的乳腺炎多表現(xiàn)為急性，多發(fā)生于產(chǎn)奶量高的奶牛[11]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）為革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分，是脂質(zhì)和多糖的復(fù)合物，可代替革蘭氏陰性菌應(yīng)用于誘導(dǎo)炎癥的動物和細(xì)胞模型[12]。本試驗通過研究大腸桿菌和LPS對BMECs MMPs/TIMPs 和uPA 系統(tǒng)表達(dá)的影響，以闡明MMPs/TIMPs 和uPA 系統(tǒng)在調(diào)控ECM 代謝中的作用，從而進(jìn)一步闡明大腸桿菌感染奶牛乳腺組織導(dǎo)致乳腺纖維化的發(fā)病機(jī)理，為研究奶牛乳腺炎和乳腺纖維化藥物提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料準(zhǔn)備

1.1.1 主要試劑 LPS，購自InvivoGen 公司；Multisource Total RNA Miniprep Kit，購自AXYGEN公司；全蛋白提取試劑盒，購自生工生物工程（上海）股份有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR 試劑盒，均購自TaKaRa 公司；DMEM/F12 培養(yǎng)基，購自Gibco 公 司；MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1兔單抗，購自Proteintech 公司；β-actin 鼠單抗、山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗鼠IgG-HRP 二抗，均購自天津三箭生物技術(shù)股份有限公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；ECL 顯色液，購自Thermo 公司；蛋白預(yù)染Marker，購自Bio-Rad 公司；MMP-2 和MMP-9 明膠酶譜法檢測試劑盒，購自上海信帆生物科技有限公司；CCK-8 試劑盒，購自Biosharp 公司。

1.1.2 菌種及細(xì)胞 大腸桿菌菌種，由本實驗室分離、鑒定并保存，BMECs 由本實驗室保存?zhèn)溆肹13]。

1.1.3 熱滅活菌液制備 參考趙楠[14]的試驗方法，制備熱滅活的大腸桿菌菌液。

1.1.4 BMECs 復(fù)蘇及培養(yǎng) 將實驗室凍存的第3代BMECs 復(fù)蘇培養(yǎng)，按1×105個/mL 接種于細(xì)胞瓶，傳代后使用無胎牛血清（FBS）DMEM/F12培養(yǎng)液饑餓處理24 h 進(jìn)行后續(xù)試驗。

1.1.5 刺激BMECs 的LPS 最佳質(zhì)量濃度篩選收集對數(shù)生長期BMECs 接種于96 孔板，設(shè)置對照組（不添加LPS）以及4 個LPS 刺激組（分別添加LPS，使其最終質(zhì)量濃度分別為2.5、5.0、7.5、10.0 μg/mL），每組3 個重復(fù)，同時空白對照僅添加基礎(chǔ)培養(yǎng)基；將96 孔板置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育6 h 后，每孔加入10 μL CCK8 溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定OD600nm，以細(xì)胞抑制率（IR）≤10%為判斷標(biāo)準(zhǔn)，確定LPS最佳刺激濃度。IR=（LPS 刺激組OD600nm-空白組OD600nm）/（對照組OD600nm-空白組OD600nm）×100%。經(jīng)計算，7.5 μg/mL LPS 為刺激BMECs 的最佳劑量。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌液和LPS 處理細(xì)胞 待BMECs 生長至第7 代并鋪滿細(xì)胞瓶時，用無FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基饑餓處理細(xì)胞24 h。對照組為無FBS 培養(yǎng)基；試驗組分為熱滅活大腸桿菌菌液（106CFU/mL）處理組，LPS（7.5 μg/mL）處理組，以及大腸桿菌、LPS 聯(lián)合作用組（簡稱聯(lián)合作用組）。將大腸桿菌菌液及LPS 加入細(xì)胞瓶中作用6、12、24、48 h后，收集細(xì)胞上清用于明膠酶譜檢測，提取細(xì)胞總RNA 用于RT-qPCR 檢測，提取細(xì)胞總蛋白用于Western blot 試驗。

1.2.2 實時熒光定量PCR 檢測 提取各組細(xì)胞的總RNA，通過酶標(biāo)儀測得各組RNA 濃度和純度，參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行cDNA 制備。qPCR反應(yīng)體系參考TB?Premix ExTaq? II 說明書，并于Quant StudioTM7 Flex Real-Time PCR System 儀器進(jìn)行試驗。設(shè)計β-actin、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1基 因引物序列（表1）。以β-actin作為內(nèi)參基因，檢測MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1mRNA 轉(zhuǎn)錄水平，并重復(fù)3 次試驗。結(jié)果采用2-ΔCT法分析，所得數(shù)據(jù)用Graph Pad Prism 5 作圖，并進(jìn)行雙因素方差分析，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 及P＜0.001 均為差異極顯著。

表1 BMECs 目的基因引物信息

1.2.3 Western blot 檢測 提取各組細(xì)胞總蛋白，BCA 法測定各組蛋白樣品濃度；設(shè)定蛋白的統(tǒng)一上樣量為20 μg，加入蛋白上樣緩沖液，經(jīng)金屬浴100 ℃變性5 min 后，置于-80 ℃保存；參考Solarbio 蛋白凝膠試劑盒說明書操作，配制SDSPAGE 凝膠進(jìn)行試驗，使用對應(yīng)的抗體孵育，采用ECL 顯色試劑盒顯影拍照，檢測MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、uPA、uPAR、PAI-1 蛋白表達(dá)情況。結(jié)果利用Image J 進(jìn)行灰度分析，所得數(shù)據(jù)用Graph Pad Prism 5 作圖，并進(jìn)行雙因素方差分析，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01及P＜0.001均為差異極顯著。

1.2.4 明膠酶譜檢測 制備含MMP 底物蛋白的SDS-PAGE 凝膠，用收集的各組細(xì)胞上清與2×SDS-PAGE nonreducing buffer 按照體積比1:1混合，上樣，在110 V 電壓下進(jìn)行凝膠電泳；分別用明膠酶譜檢測試劑盒1×Buffer A、1×Buffer B孵育凝膠，考馬斯亮藍(lán)染色液染色后，再用脫色液脫去浮色；將凝膠放在掃描儀上掃描，透亮區(qū)域即為MMP-2、MMP-9 的活性位置。結(jié)果利用Image J 進(jìn)行灰度分析，所得數(shù)據(jù)用Graph Pad Prism 5 作圖，并進(jìn)行雙因素方差分析，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 及P＜0.001 均為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 MMP-2、MMP-9 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平、相應(yīng)蛋白表達(dá)水平及明膠酶譜分析

2.1.1MMP-2、MMP-9mRNA 轉(zhuǎn)錄水平 作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組MMP-2mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在6 h 時顯著上升，在12 h 時極顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-2mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在6 h 時顯著下降；聯(lián)合作用組MMP-2mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在6 h 時顯著下降（圖1-A）。作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組MMP-9mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在6 h 時極顯著上升，在24、48 h 時顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-9mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在48 h 時極顯著上升；聯(lián)合作用組MMP-9mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在12、48 h 時極顯著上升（圖1-B）。

2.1.2 MMP-2、MMP-9 蛋白表達(dá)水平 作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組、7.5 μg/mL LPS 處理組以及聯(lián)合作用組MMP-2 蛋白表達(dá)水平在6、12、24、48 h 時均極顯著上升（圖2-A）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組MMP-9 蛋白表達(dá)水平在6、12、24、48 h 時均極顯著下降；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-9 蛋白表達(dá)水平在12 h 時顯著上升，24、48 h 時均極顯著上升；聯(lián)合作用組MMP-9 蛋白表達(dá)水平在6 h 時極顯著下降，24、48 h 時均呈極顯著上升（圖2-B）。

2.1.3 MMP-2、MMP-9 蛋白明膠酶譜分析作用6、12、24、48 h 后，利用明膠酶譜法檢測MMP-2 和MMP-9 蛋白活性。結(jié)果顯示，可在72 和92 kDa 位置處發(fā)現(xiàn)清晰、活化的MMP-2 和MMP-9 蛋白條帶。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組MMP-2 活性在6、12、24 h 時均呈極顯著上升，48 h 時極顯著下降；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-2 活性12、24 h 均呈極顯著上升，48 h 時極顯著下降；聯(lián)合作用組MMP-2 活性在6、12、24、48 h 時均極顯著上升（圖3-A）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組MMP-9 活性在12 h時顯著上升，24、48 h 時極顯著下降；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-9 活性在12、24、48 h 時極顯著下降；聯(lián)合作用組MMP-9 活性在24、48 h 時極顯著下降（圖3-B）。

2.2 MMP-1、MMP-3、MMP-13 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和相應(yīng)蛋白表達(dá)水平

2.2.1MMP-1、MMP-3、MMP-13mRNA 轉(zhuǎn)錄水平 作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL菌液處理組MMP-1mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在6 h 時極顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-1mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在各時間點轉(zhuǎn)錄水平差異均不顯著；聯(lián)合作用組MMP-1mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在12 h 時極顯著上升（圖4-A）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組、7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-3mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在各時間點的差異均不顯著；聯(lián)合作用組MMP-3mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在12 h 時極顯著上升（圖4-B）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組MMP-13mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在12 h 時顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-13mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在12 h 時極顯著上升；聯(lián)合作用組MMP-13mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12 h 時極顯著上升（圖4-C）。

2.2.2 MMP-1、MMP-3、MMP-13 蛋白表達(dá)水平 作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組MMP-1 蛋白表達(dá)水平在6、12 h 時極顯著下降，24、48 h 時極顯著上升；7.5 μg/mL LPS處理組、聯(lián)合作用組MMP-1 蛋白表達(dá)水平在6、12、24、48 h 時均極顯著下降（圖5-A）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組MMP-3 蛋白表達(dá)水平在6 h 時極顯著上升，24、48 h 時極顯著下降；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-3 蛋白表達(dá)水平在6、12 h 時極顯著上升，48 h 時極顯著下降；聯(lián)合作用組MMP-3 蛋白表達(dá)水平在6 h 時顯著上升，12、24 h 時極顯著下降（圖5-B）。106CFU/mL菌液處理組MMP-13 蛋白表達(dá)水平在6、12、24、48 h 時均極顯著下降；7.5 μg/mL LPS 處理組MMP-13 蛋白表達(dá)水平在12 h 時極顯著下降，在24、48 h 時極顯著上升；聯(lián)合作用組MMP-13蛋白表達(dá)水平在12、24、48 h 時均極顯著上升（圖5-C）。

2.3 TIMP-1、TIMP-2 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和相應(yīng)蛋白表達(dá)水平

2.3.1TIMP-1、TIMP-2mRNA 轉(zhuǎn)錄水平 作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組TIMP-1mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在6 h 時顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組、聯(lián)合作用組TIMP-1mRNA轉(zhuǎn)錄水平均在6 h 時極顯著下降；（圖6-A）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組、7.5 μg/mL LPS 處理組TIMP-2mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在各時間點轉(zhuǎn)錄水平差異均不顯著；聯(lián)合作用組TIMP-2mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12 h 時極顯著上升，24 h 時顯著上升（圖6-B）。

2.3.2 TIMP-1、TIMP-2 蛋白表達(dá)水平 作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組TIMP-1 蛋白表達(dá)水平在在6 h 時極顯著上升，24 h 時顯著下降，48 h 時極顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組TIMP-1 蛋白表達(dá)水平在6、12、24、48 h 時極顯著下降；聯(lián)合作用組TIMP-1蛋白表達(dá)水平在12、24、48 h 時極顯著下降（圖7-A）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組TIMP-2 蛋白表達(dá)水平在6、12、24、48 h 時極顯著下降；7.5 μg/mL LPS 處理組TIMP-2 蛋白表達(dá)水平在6 h 時極顯著上升，12、24、48 h 時極顯著下降；聯(lián)合作用組TIMP-2 蛋白表達(dá)水平在6、12、48 h 時極顯著下降（圖7-B）。

2.4 uPA、uPAR、PAI-1 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平和相應(yīng)蛋白表達(dá)水平

2.4.1uPA、uPAR、PAI-1mRNA 轉(zhuǎn)錄水平 作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL菌液處理組uPAmRNA 轉(zhuǎn)錄水平在6、12、24、48 h 時極顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組uPAmRNA 轉(zhuǎn)錄水平在12 h 時顯著上升；聯(lián)合作用組uPAmRNA 轉(zhuǎn)錄水平在12 h 時極顯著上升（圖8-A）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組uPARmRNA 轉(zhuǎn)錄水平在6、12 h 時極顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組uPARmRNA 轉(zhuǎn)錄水平在各時間點轉(zhuǎn)錄水平差異均不顯著；聯(lián)合作用組uPARmRNA 轉(zhuǎn)錄水平在12 h 時極顯著上升，24 h 時顯著上升（圖8-B）。106CFU/mL 菌液處理組PAI-1mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在6 h 時極顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組PAI-1mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在6 h 時極顯著下降；聯(lián)合作用組PAI-1mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在6 h 時極顯著下降（圖8-C）。

2.4.2 uPA、uPAR、PAI-1 蛋白表達(dá)水平 作用6、12、24、48 h 后，與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組uPA 蛋白表達(dá)水平在6、12、24、48 h 時均極顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組uPA 蛋白表達(dá)水平在6 h 時顯著上升，12、24、48 h 時均極顯著下降；聯(lián)合作用組uPA 蛋白表達(dá)水平在6、24 h時極顯著下降，48 h 時極顯著上升（圖9-A）。與對照組相比，106CFU/mL 菌液處理組uPAR 蛋白表達(dá)水平在12、24 h 時極顯著下降，48 h 時極顯著上升；7.5 μg/mL LPS 處理組uPAR 蛋白表達(dá)水平在6、24、48 h 時極顯著上升，12 h 時極顯著下降；聯(lián)合作用組uPAR 蛋白表達(dá)水平在6、12、48 h時極顯著上升（圖9-B）。106CFU/mL 菌液處理組PAI-1 蛋白表達(dá)水平在6、12、24、48 h 時極顯著下降；7.5 μg/mL LPS 處理組、聯(lián)合作用組PAI-1蛋白表達(dá)水平在6、12、24、48 h 時均極顯著上升（圖9-C）。

3 討論

當(dāng)奶牛乳頭、乳房通過創(chuàng)口或擠乳器被大腸桿菌污染，可引起乳腺感染[15]。LPS 的分子結(jié)構(gòu)特殊，為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的最外層結(jié)構(gòu)，具有抗原性與毒性[16]。在正常機(jī)體內(nèi)，MMPs 可通過分解ECM 來控制其數(shù)量，當(dāng)炎性作用刺激ECM過度表達(dá)時，亦會誘導(dǎo)MMPs、TIMPs 表達(dá)增多[17]。

有研究[18]發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌感染絨毛膜后，MMP-2 和MMP-9 活性形態(tài)的分泌增加，并與ECM 相 關(guān)，而TIMP-1、TIMP-2 和TIMP-4 沒 有變化。牙齦桿菌LPS 和大腸桿菌LPS 處理的細(xì)胞中MMP-3mRNA 和蛋白表達(dá)顯著上調(diào)[19]。以LPS誘導(dǎo)成骨樣細(xì)胞MC3T3-E1 模擬牙周炎患者的病理特征，結(jié)果證明LPS 能夠誘導(dǎo)MMP-13 表達(dá)[20]，說明大腸桿菌和LPS 均可引起組織器官炎癥甚至纖維化。本試驗研究結(jié)果顯示，熱滅活的大腸桿菌菌液誘導(dǎo)后，BMECs 中MMP-2、TIMP-1 表達(dá)出現(xiàn)不同程度上調(diào)，LPS 誘導(dǎo)后BMECs 中也可檢測出MMP-2。該結(jié)果與上述文獻(xiàn)的結(jié)果相似，但MMP-2、TIMP-1mRNA表達(dá)到達(dá)峰值的時間不一致。

據(jù)文獻(xiàn)[21-22]報道，LPS 刺激系膜細(xì)胞后，系膜細(xì)胞TIMP-1、TIMP-2mRNA 表達(dá)增高，而MMP-2、MMP-9mRNA 表達(dá)降低。本試驗研究結(jié)果顯示，熱滅活的大腸桿菌菌液誘導(dǎo)后，BMECs中的TIMP-1 表達(dá)出現(xiàn)上調(diào)，LPS 誘導(dǎo)后BMECs中的TIMP-2 表達(dá)量先極顯著上升后極顯著下降。在路軍[23]的研究中，LPS 對TIMP-2 的表達(dá)具有抑制作用，LPS 在誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞MMP-9、TIMP-1 表達(dá)的同時可降低TIMP-2 表達(dá)，其作用呈濃度時間依賴性。這與本試驗結(jié)果相似，TIMP是MMPs 的內(nèi)源性抑制劑，特異性抑制MMP 的表達(dá)與活性，TIMP-2 表達(dá)量下降可能與誘導(dǎo)后期MMPs 表達(dá)量下降有關(guān)。

LPS 能夠促進(jìn)牙齦成纖維細(xì)胞表達(dá)uPA，參與牙周組織的破壞[24]。本試驗結(jié)果顯示，LPS 作用組和聯(lián)合作用組誘導(dǎo)后，BMECs 中PAI-1 的表達(dá)出現(xiàn)不同程度上調(diào)，并且隨誘導(dǎo)時間延長，MMP-1、MMP-3、MMP-9、MMP-13 表達(dá)量出現(xiàn)下降。uPA與細(xì)胞表面受體uPAR 結(jié)合，使uPA 濃集于細(xì)胞表面，活性形式的uPA 絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域可水解激活纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，纖溶酶可直接降解基質(zhì)組分或進(jìn)一步激活金屬蛋白酶降解基質(zhì)[25]。uPA一方面激活MMPs，引起ECM 降解，另一方面又誘導(dǎo)產(chǎn)生PAI-1，使MMPs 的產(chǎn)生受限。PAI-1 通過調(diào)節(jié)ECM 的降解和沉積、刺激細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附作用等過程，參與纖維化、腫瘤和心血管疾病等[26-27]的發(fā)展。

在大腸桿菌誘導(dǎo)的大鼠肺損傷試驗[28]中，MMP-9mRNA 和蛋白表達(dá)均升高；在LPS 誘導(dǎo)小鼠肺損傷試驗[29]中，MMP-2、MMP-9mRNA 和蛋白表達(dá)均升高。在轉(zhuǎn)基因小鼠肺組織中TIMP-1/-2/-3 表達(dá)上調(diào)，MMP-9 活性降低，從而可能減少ECM 降解，導(dǎo)致肺纖維化[30]。有研究[31]表明，MMP-13 由促炎細(xì)胞因子誘導(dǎo)，其表達(dá)增加與腫瘤、骨關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和牙周病等疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)。MMP-2 和MMP-9 在炎癥早期是具有抗纖維化功能的酶，降解部分過多的ECM，減緩纖維化進(jìn)程，在炎癥后期又可作為炎癥前介質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞增生，啟動并加速纖維化進(jìn)程[32]。

大腸桿菌抗原成分復(fù)雜，可分為菌體抗原、鞭毛抗原和表面抗原，后者有抗吞噬和抗補(bǔ)體能力[33]。LPS 是大腸桿菌細(xì)胞壁的重要組成部分，是革蘭氏陰性菌重要的毒力因子[34]。本試驗中大腸桿菌作用組MMP-2、MMP-3、TIMP-2和PAI-1mRNA 和蛋白表達(dá)量高于LPS 作用組，可能與大腸桿菌其他毒力因子作用有關(guān)。LPS 可以通過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑引起動物體內(nèi)炎癥反應(yīng)[35]。本試驗中，聯(lián)合作用組MMP-1、MMP-9、MMP-13和uPARmRNA 表達(dá)量低于菌液作用組和LPS 作用組，可能與BMECs 對LPS 的耐受量有關(guān)。據(jù)文獻(xiàn)[36]報道，20 μg/mL LPS 在體外直接作用可誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞發(fā)生凋亡。在篩選LPS 刺激BMECs 最佳質(zhì)量濃度試驗中，10 μg/mL LPS 作用后BMECs 的細(xì)胞抑制率下降，說明更高質(zhì)量濃度的LPS 可能會導(dǎo)致BMECs 損傷。本試驗研究表明，大腸桿菌和LPS 誘導(dǎo)BMECs 的早期，uPA 系統(tǒng)被激活表達(dá)，參與了MMPs/TIMPs 的激活與調(diào)控，促進(jìn)了ECM代謝，隨著誘導(dǎo)時間延長，uPA 和uPAR 的表達(dá)下降，這可能是因為PAI-1 的顯著升高抑制了uPA 和uPAR 表達(dá)，進(jìn)而抑制了其對MMPs/TIMPs 活化的促進(jìn)作用，加快纖維化進(jìn)程，也可能是MMPs/TIMPs 和uPA 系統(tǒng)在奶牛乳腺纖維化中的潛在機(jī)制。本試驗為明確大腸桿菌及LPS 誘導(dǎo)的BMECs中MMPs/TIMPs 及uPA 系統(tǒng)對奶牛乳腺纖維化的影響奠定了基礎(chǔ)。