非洲豬瘟疫苗研制方向及進展

張振興，曾 毅，宋建領(lǐng)

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學院，云南省熱帶亞熱帶動物病毒病重點實驗室，云南昆明 650224；2.水富市兩碗鎮(zhèn)人民政府，云南水富 657803）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的一種生豬接觸性傳染病，急性死亡率能達到100%[1]。ASFV 隸屬于非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬，而且是該科屬的唯一成員，作為一種大型囊膜DNA 病毒，擁有異常龐大的雙鏈DNA 基因組，總長度170～190 kb[2]。此外，ASFV 具有上百個能編碼完成多肽鏈的開放閱讀框（open reading frames，ORF），不僅能編碼150 多種非結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白，甚至還能編碼免疫調(diào)節(jié)蛋白，調(diào)節(jié)先天免疫及細胞凋零等信號通路。截至目前，ASFV仍有幾十種蛋白質(zhì)未被鑒定分析出來[3]。

1921 年ASF 首次暴發(fā)于非洲東部的肯尼亞，此后的30 多年間ASFV 一直在非洲范圍內(nèi)傳播和蔓延，1957 年后相繼傳播到歐洲、美洲。直到20世紀90 年代中后期，除意大利撒丁島地區(qū)以外，歐洲其他地區(qū)以及美洲地區(qū)才消除了ASFV 的感染和侵襲[4]。2007 年，ASFV 蔓延到高加索地區(qū)的格魯尼亞等國家，此后迅速傳播到俄羅斯及東歐一些國家。2018 年8 月，ASFV 首次在我國遼寧省沈陽市被發(fā)現(xiàn)[5]，到2019 年底全國共報告發(fā)生ASF疫情162 起，撲殺生豬120 萬余頭[5]。至今，ASF疫情在我國仍呈散發(fā)態(tài)勢，并且我國周邊國家包括老撾、蒙古國、越南、朝鮮、柬埔寨等[6-8]也報道發(fā)生ASF 疫情。ASFV 已經(jīng)呈現(xiàn)出全球蔓延的趨勢，給各國生豬養(yǎng)殖者造成了嚴重的損失。因此，國內(nèi)外科研人員從多個方向致力于研發(fā)可以有效利用的ASFV 疫苗來應(yīng)對ASF 疫情。本文對不同研制方向的研究進展情況及難點進行綜述，以期對ASF疫苗研發(fā)提供參考。

1 滅活疫苗

滅活疫苗作為ASFV 疫苗研制的首選策略，其原理是通過加熱或者加入相應(yīng)的化學試劑等物理/化學方法，將人工培養(yǎng)的ASFV 殺死，使ASFV喪失原本應(yīng)有的感染能力和毒性，而只保留免疫原性，滅活后再結(jié)合相應(yīng)的非特異性免疫增強劑（佐劑）制成疫苗。ASFV 滅活疫苗雖然有價格低廉、制備工藝相比其他方式更加簡單便捷的優(yōu)勢，但是因為其在化學滅活或者物理滅活的過程中會喪失ASFV 本身應(yīng)有的感染力，只能引起生豬免疫應(yīng)答中的體液免疫，而無法引起細胞免疫，導致在生豬體內(nèi)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答非常弱或者無法持久，更不能有效地對中和抗體產(chǎn)生誘導作用，從而導致滅活疫苗無法對生豬產(chǎn)生根本性的保護作用。研究人員將ASFV 感染后的豬肺泡巨噬細胞分成兩組分別進行戊二醛浸泡處理和洗滌劑浸泡處理，并將處理后的細胞再次注射入感染ASFV 的患病豬體內(nèi)進行觀察，但是免疫保護效果不甚理想[5]；隨著新技術(shù)的研發(fā)，也有通過其他方法，如通過進一步純化滅活病毒粒子，對ASFV 進行滅活加工處理，但是效果均不理想[9]；只有2014 年，Sandra 等[10]發(fā)表的論文指出，在滅活ASFV 得到的試劑中加入PolygenTM等佐劑，注入豬體內(nèi)后可應(yīng)答產(chǎn)生參與ASFV 內(nèi)化的p30 等特異性抗體，但遺憾的是加入佐劑的方法仍未誘導生豬產(chǎn)生根本有效的細胞免疫應(yīng)答。截至目前仍未發(fā)現(xiàn)ASFV 滅活疫苗研發(fā)獲得實質(zhì)性進展的報道，這可能與ASFV 復雜的免疫逃逸機制和成熟方式有關(guān)。

2 減毒活疫苗

ASFV 減毒活疫苗的研制分為兩種：一是ASFV 自然致弱活疫苗的研制，二是ASFV 重組致弱活疫苗（基因工程減毒活疫苗）的研制。其原理是經(jīng)過各種處理，讓ASFV 發(fā)生變異，使其既降低自身原有的毒性，又保留其免疫原性。二者的區(qū)別在于，ASFV 自然致弱活疫苗的研制是通過常規(guī)途徑，如細胞傳代培養(yǎng)、非宿主動物連續(xù)傳代等方式獲得致弱的毒株；ASFV 重組致弱活疫苗（基因工程減毒活疫苗）的研制是通過尋找和定位ASFV中與病毒毒力相關(guān)以及引起宿主應(yīng)答的基因，如ASFV 中的NL、TK、9GL、MCF 360/55等基因，把其敲除后再經(jīng)過一系列操作獲得的基因缺失弱毒株。ASFV 減毒活疫苗的研制優(yōu)勢很多，它既能誘導體液免疫，還能誘導細胞免疫；在生豬體內(nèi)起到長時間的免疫應(yīng)答作用；可以在豬場生豬群中水平傳播，使生豬群體獲得良好的免疫屏障等。通過總結(jié)前人研究，對二者進行比較發(fā)現(xiàn)，ASFV 重組致弱活疫苗（基因工程減毒活疫苗）的研制前景要好于ASFV 自然致弱活疫苗。Leit?o 等[11]通過豬骨髓細胞傳代培養(yǎng)獲得的天然減毒株NH/P68免疫豬群后，經(jīng)測試發(fā)現(xiàn)其對親代毒株的免疫保護率最高可達100%，但是對不同基因型ASFV 的交叉保護率不甚理想，有的只有66%，而且對豬群會產(chǎn)生一定的毒副作用，甚至有毒力返強的征象。Monteagudo 等[12]將ASFV 基因Ⅰ型的CD2V/ER402R基因敲除后獲得的ASFV 基因Ⅰ型Ba71 弱毒株免疫豬群后，不僅能夠?qū)τH代毒株產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)，還能對不同基因型的ASFV，如ASFV 基因Ⅰ型E75、ASFV 基因Ⅱ型Georgia07 等ASFV 強毒株產(chǎn)生良好的免疫應(yīng)答反應(yīng)。這種交叉保護反應(yīng)是ASFV 自然致弱活疫苗所不能比擬的。

目前較有希望研制成功的ASFV 重組致弱活疫苗，是由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所以我國流行的ASFV 基因Ⅱ型HLJ/18 毒株為親本構(gòu)建的7 基因缺失重組疫苗，其在豬群中的動物試驗顯示，可以在豬群中做到100%減毒，而不會誘使產(chǎn)生ASFV 強毒株，同時能對目前存在的致死性ASFV 起到較高的保護作用[13]。此外，我國軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所扈榮良教授團隊以我國流行ASF 毒株SY18 為親本成功構(gòu)建了能100%抵抗親本毒株攻擊的MGF和CD2v雙基因缺失株[14]，這也能證明ASFV 疫苗研究成功的方向或許在于ASFV 重組致弱活疫苗。

3 亞單位疫苗

ASFV 亞單位疫苗也被稱為ASFV 組分疫苗，即利用ASFV 上某種表面結(jié)構(gòu)成分，通過合成加工（化學分解、選擇性控制水解相關(guān)蛋白等方式），提取ASFV 特定的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，通過篩選獲得具有免疫原性的蛋白組分，研制成的一種本身不含有ASFV 核酸，但卻能誘發(fā)生豬產(chǎn)生免疫保護的一種疫苗。ASFV 亞單位疫苗和ASFV 重組致弱活疫苗一樣，也是利用基因工程方式，只是選取的基因相對會小很多，因而具有更高的生物安全性，但面臨的問題也有很多，如只能提供部分免疫保護、交叉保護效率低、無法產(chǎn)生中和抗體等。與ASFV內(nèi)化相關(guān)的蛋白p30，作為ASFV 最具有抗原性結(jié)構(gòu)蛋白之一，目前被廣泛應(yīng)用于各實驗室的ASFV血清學檢測中。但是單獨作為ASFV 亞單位疫苗的研究對象，即使可以在免疫豬群中產(chǎn)生中和抗體，也無力抵御ASFV 強毒株的攻擊，還可能造成免疫豬群出現(xiàn)強烈的病毒血癥甚至死亡；單獨利用在ASFV 附著中發(fā)揮重要作用的p54 蛋白研制ASFV亞單位疫苗，也遇到與p30 類似的問題，免疫保護率基本為0[15]。相關(guān)試驗結(jié)果見表1。

4 DNA 疫苗

DNA 疫苗又被稱為核酸疫苗，是指將編碼ASFV 特異性蛋白質(zhì)抗原的重組真核表達載體直接注射到生豬體內(nèi)，使編碼后的ASFV 蛋白質(zhì)抗原基因能夠在生豬體內(nèi)表達并使生豬產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫應(yīng)答，從而對生豬起到免疫保護作用。目前DNA 疫苗已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到防控豬偽狂犬病、豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟等多種生豬病毒性疾病當中，具有可消除疫苗毒性、能同時誘導產(chǎn)生細胞免疫和體液免疫、保存制作更加適應(yīng)需求等特點，也被稱為第三代疫苗（前兩代疫苗按時間順序是滅活疫苗、減毒活疫苗）。但是在研制ASFV DNA 疫苗中，也同樣遇到不少問題和難點，比如使用p54/p30 作為靶抗原制作的DNA 疫苗在生豬體內(nèi)無法產(chǎn)生中和抗體，也不能誘導產(chǎn)生細胞免疫[18]，p54/p30/sHA 融合制成的DNA 疫苗對生豬的保護效率幾乎為0[19]。

5 病毒載體疫苗

病毒載體疫苗是使用病毒載體誘導特異性免疫及非特異性免疫的疫苗，是通過去除或使用免疫原替換病毒毒力基因，或使病毒載體無法復制來保障疫苗安全性的一種手段。但是迄今為止，對研制ASFV 載體疫苗的相關(guān)文獻甚少，而且均缺少對ASFV 強毒株攻擊的免疫評價和動物性試驗，因而需要對其進行進一步探究和分析[5]。

6 結(jié)語

ASFV 疫苗研制至今已經(jīng)有長達幾十年的歷史，但是由于ASFV 具有比尋常病毒更加巨大的基因組、多達24 種的基因型、迅速的變異能力、復雜多變的免疫逃逸機制等特點，現(xiàn)在仍然沒有研制成功可以在生豬體內(nèi)能起到有效作用的疫苗。滅活疫苗相對安全，但是提供的保護力偏低；DNA疫苗還無法誘導產(chǎn)生細胞和體液免疫應(yīng)答；病毒載體疫苗需要精準定位ASFV 免疫原基因；減毒活疫苗可以提供同源保護，是目前比較理想的ASFV疫苗研制途徑，但是存在較大的生物安全隱患。ASFV 疫苗的研制仍然需要加深對ASFV 致病機理的研究，準確定位致病基因，努力探索ASFV 疫苗與宿主細胞的相互作用機理，同時要加強國內(nèi)外生物安全性級別高的實驗室的合作研究，只有這樣才能加快ASFV 疫苗研制成功的步伐。