應(yīng)用鰻鱺腎臟細(xì)胞分離皰疹病毒及毒株理化性質(zhì)試驗(yàn)

李苗苗

（福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，福建福州 350002）

鰻鱺養(yǎng)殖在我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)中占有重要的地位，養(yǎng)殖品種以美洲鰻鱺、歐洲鰻鱺和日本鰻鱺為主。鰻鱺具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是重要的經(jīng)濟(jì)魚(yú)類之一，國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求量較大，出口前景廣闊[1-3]；但隨著鰻鱺養(yǎng)殖規(guī)模的擴(kuò)大，鰻鱺病害的發(fā)生率和死亡率也在逐漸升高，嚴(yán)重制約了鰻鱺養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4-5]。引起鰻鱺發(fā)生病害的病原有細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)等[6]，其中病毒性疾病對(duì)鰻鱺的危害最大[7]，目前已有多個(gè)國(guó)家和地區(qū)從病鰻上檢測(cè)出了皰疹病毒[8-11]、圓環(huán)病毒[12-14]、彈狀病毒[15-16]、雙RNA病毒[17]、小核糖核酸病毒[18]等多種病毒[19-20]。其中，鰻鱺皰疹病毒（Anguillid herpesvirus，AnHV）感染對(duì)鰻鱺養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)造成了嚴(yán)重影響，主要引起鰻鱺出現(xiàn)“脫黏敗血癥”，即病鰻體表黏液分泌增多、脫落，爛鰓，喪失食欲，胸鰭、鰓蓋和腹部充血發(fā)炎，鰓絲充血壞死，肝臟充血，腎臟腫脹等癥狀[21]。該病主要發(fā)生在苗種階段，發(fā)病率達(dá)60%，死亡率達(dá)20%，嚴(yán)重時(shí)可達(dá)60%以上[22]。對(duì)該病目前尚未有有效的治療方法，利用細(xì)胞系對(duì)病毒進(jìn)行分離純化并進(jìn)行病毒理化特性研究，有助于病毒防控新技術(shù)的開(kāi)發(fā)。

本研究首次應(yīng)用鰻鱺腎臟細(xì)胞（European eel kidney cell，EEK）從出現(xiàn)典型“脫黏敗血癥”疑似病料中分離到一株AnHV，通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)、電鏡觀察、PCR 等方法對(duì)其進(jìn)行鑒定，并開(kāi)展了該病毒株的溫度和酸堿度敏感性試驗(yàn)，以期為AnHV 感染的臨床診斷和綜合防控技術(shù)開(kāi)發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 病魚(yú)材料

從福建省某鰻鱺養(yǎng)殖場(chǎng)收集出現(xiàn)頭部和腹部紅腫、出血，體表黏液增多，肝臟腫大、失血發(fā)白，脾臟、腎臟腫大等典型“脫黏敗血癥”的疑似病料（圖1），采集鰓、肝、腎、脾等組織，于-80 ℃保存。試驗(yàn)在福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站中心實(shí)驗(yàn)室，于2018 年4—12 月進(jìn)行。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

EEK 用DMEM/F12（1:1）培養(yǎng)液（含10%FBS），在27 ℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)至細(xì)胞幾乎鋪滿培養(yǎng)瓶底部時(shí)待用。

1.3 病毒分離

將患病鰻鱺組織加入少量PBS制備成勻漿液，用于AnHV PCR 鑒定和接種EEK 細(xì)胞。將1 份鰻鱺病料組織勻漿液按1:10 最終稀釋度重懸于細(xì)胞培養(yǎng)液（含1 000 IU/mL 青霉素和1 000 μg/mL 鏈霉素）中，4 ℃孵育過(guò)夜；0.22 μm 濾膜過(guò)濾除菌后對(duì)濾液繼續(xù)作2 次1:10 梯度稀釋，將10-1、10-2、10-33 個(gè)稀釋度的病魚(yú)組織勻漿液接種至長(zhǎng)滿的EEK，于27 ℃條件下吸附1～2 h，補(bǔ)足細(xì)胞培養(yǎng)液后置于27 ℃培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞病變（cytopathic effect，CPE）情況并做好記錄，同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞作為對(duì)照。

1.4 病毒粒子電鏡觀察

1.4.1 病毒粒子負(fù)染觀察 收集病毒感染出現(xiàn)CPE 的EEK 上清液，12 000 r/min 離心40 min，取上清液于3 kD 超濾離心管中，7 000 r/min 離心40 min，棄濾液，加入等體積無(wú)菌超純水重懸，7 000 r/min 離心40 min，收集膜前液。2%磷鎢酸染色后置于電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.4.2 細(xì)胞超薄切片觀察 將凍融后的病毒感染細(xì)胞懸液繼續(xù)接種EEK，待細(xì)胞出現(xiàn)CPE 時(shí)（約第3 天）刮取細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入2.5%戊二醛固定液，4 ℃條件下固定4～12 h。洗滌、脫水、包埋后制備細(xì)胞超薄切片，經(jīng)醋酸鈾、檸檬酸鉛雙染色，干燥后置于電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.5 病毒PCR 鑒定

提取鰻鱺病料組織DNA 和感染病毒的EEK培養(yǎng)物DNA，用AnHV DNA 聚合酶基因特異性引物（表1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，并將PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，獲得的序列通過(guò)NCBI blast 進(jìn)行比對(duì)分析。

表1 AnHV PCR 檢測(cè)引物序列

1.6 病毒滴度測(cè)定

將病毒懸液作連續(xù)10 倍稀釋至10-10，將10-1～10-10梯度的病毒懸液接種至長(zhǎng)滿EEK 的96孔培養(yǎng)板，每孔接種100 μL，每個(gè)稀釋度接種8孔，培養(yǎng)板的最后一列設(shè)置為細(xì)胞空白對(duì)照，置于27 ℃條件下吸附1～2 h，每孔補(bǔ)加培養(yǎng)液至200 μL，27 ℃培養(yǎng)，逐日觀察CPE 并做好記錄，根據(jù)Reed-Muench兩氏法進(jìn)行病毒滴度TCID50測(cè)定。

1.7 溫度敏感性試驗(yàn)

將病毒懸液置于30、40、50、60 ℃條件下分別處理30 min 后接種EEK，同時(shí)設(shè)立細(xì)胞空白對(duì)照，按照病毒滴度測(cè)定方法計(jì)算其TCID50。

1.8 酸堿度敏感性試驗(yàn)

配制0.1 mol/L HCl 和0.1 mol/L NaOH，分別用0.1 mol/L HCl 和0.1 mol/L NaOH 將病毒懸液酸堿度調(diào)至pH3 和pH11，置于27 ℃處理30 min 后接種EEK，設(shè)立細(xì)胞空白對(duì)照，按照病毒滴度測(cè)定方法計(jì)算其TCID50。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒細(xì)胞分離

將病鰻組織勻漿液接種EEK，置于27 ℃培養(yǎng)，EEK 在接種10-1、10-2、10-33 個(gè)稀釋度病毒組織懸液后第4 天均出現(xiàn)明顯CPE（圖2-A、B、C），主要表現(xiàn)為細(xì)胞收縮、變圓，細(xì)胞脫壁懸浮，逐漸裂解死亡，而對(duì)照組細(xì)胞正常生長(zhǎng)（圖2-D），表明EEK 對(duì)AnHV 敏感，可用于該病毒的分離。

2.2 病毒電鏡觀察

將病毒液濃縮，經(jīng)磷鎢酸負(fù)染色，干燥后在電鏡下觀察，可見(jiàn)直徑近200 nm 的病毒顆粒（圖3-A）。收集病毒感染出現(xiàn)CPE 的EEK，制作超薄切片，在電子顯微鏡下觀察，可觀察到細(xì)胞核內(nèi)有大量六角形的病毒粒子（圖3-B）。因典型的皰疹病毒大小為180～200 nm，二十面體結(jié)構(gòu)，本試驗(yàn)中感染EEK 的病毒很可能為AnHV。

2.3 病毒PCR 鑒定

用AnHV DNA 聚合酶基因特異性引物對(duì)患病鰻鱺組織DNA 和感染病毒的EEK 培養(yǎng)物DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得特異性單一條帶，大小約394 bp（圖4）。測(cè)序后的序列比對(duì)分析結(jié)果（圖5）顯示，其與GenBank 所公布AnHV 毒株基因序列相似性均在99%以上，表明該病毒確實(shí)為AnHV。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果見(jiàn)圖6。

2.4 病毒滴度測(cè)定

將10-1～10-10梯度的病毒懸液接種EEK，置于27 ℃培養(yǎng)，逐日觀察細(xì)胞變化并記錄CPE，按照Reed-Muench 法計(jì)算得到病毒滴度TCID50=10-6.8/0.1 mL。

2.5 溫度敏感性試驗(yàn)

病毒懸液經(jīng)30、40、50、60 ℃處理30 min 后接種EEK，病毒滴度測(cè)定結(jié)果（TCID50）分別為10-6.1/0.1 mL、10-4.6/0.1 mL、10-3.6/0.1 mL、0，空白對(duì)照組為TCID50=10-6.8/0.1 mL，表明該病毒株對(duì)溫度較敏感，60 ℃處理30 min 可使其滅活。

2.6 酸堿度敏感性試驗(yàn)

分別用0.1 mol/L HCl 和0.1 mol/L NaOH 將病毒懸液酸堿度調(diào)至pH3 和pH11，置于27 ℃處理30 min 后接種EEK，病毒滴度測(cè)定結(jié)果為，pH3處理組TCID50=10-3.4/0.1 mL，pH11 處理組TCID50=10-2.1/0.1 mL，空白對(duì)照組TCID50=10-6.8/0.1 mL，表明該病毒株對(duì)酸堿均較敏感，強(qiáng)酸和強(qiáng)堿均可使其滴度明顯下降。

3 討論

皰疹病毒是有囊膜的雙鏈DNA 病毒，在哺乳類、兩棲類和魚(yú)類中廣泛存在[23]。“脫黏敗血癥”在鰻鱺養(yǎng)殖中廣泛發(fā)生，流行水溫為24～32 ℃，主要發(fā)生于黑仔和幼鰻期，傳染性強(qiáng)，并可導(dǎo)致鰻鱺在養(yǎng)殖過(guò)程中出現(xiàn)大量死亡。研究[8，21，24]表明，該病主要由AnHV 感染引起，感染鰻鱺后可導(dǎo)致鰻鱺出現(xiàn)黏液分泌增多，活力下降，肝臟發(fā)白，腎臟、膽囊腫大等多種癥狀。所以，要有效防控鰻鱺“脫黏敗血癥”的發(fā)生，首先需要將AnHV 從病料中分離出來(lái)，并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)性質(zhì)研究，然后利用其理化特性探索建立該病的防控方法。

魚(yú)類細(xì)胞系的建立為分離、培養(yǎng)和鑒定魚(yú)類病毒提供了重要的載體。不同的細(xì)胞系對(duì)不同病毒的敏感性有很大差異[7，25-26]。魚(yú)類皰疹病毒有很強(qiáng)的宿主專一性[10，27]，分離培養(yǎng)時(shí)最好選用同一魚(yú)類品種來(lái)源的細(xì)胞系[7，28]。利用常見(jiàn)魚(yú)類細(xì)胞系如鯉上皮細(xì)胞（EPC）、草魚(yú)卵巢細(xì)胞（CO）、胖頭鱥肌肉細(xì)胞（FHM）等分離AnHV 尚未見(jiàn)有成功的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)室前期建立了鰻鱺腎臟細(xì)胞系EEK，并初步開(kāi)展了EEK 對(duì)AnHV 的敏感性試驗(yàn)，確定該細(xì)胞對(duì)AnHV 敏感[7]，可用于AnHV 的分離。

本試驗(yàn)從鰻鱺養(yǎng)殖過(guò)程中經(jīng)常出現(xiàn)的“脫黏敗血癥”病料組織，首次應(yīng)用EEK 成功分離鑒定到一株AnHV。該病毒可引起鰻鱺腎臟細(xì)胞收縮變圓，逐漸脫壁懸浮死亡。病毒測(cè)序結(jié)果顯示，其與已公布的AnHV 序列具有高度的同源性。該AnHV毒株的溫度和酸堿度敏感性試驗(yàn)顯示，30 ℃處理30 min 后AnHV 滴度下降不顯著，40 ℃、50 ℃處理30 min 后滴度明顯下降，60 ℃處理30 min 可完全滅活；AnHV 對(duì)酸堿都比較敏感，在pH3 和pH11處理后滴度均明顯下降。這與葛均青等[21]的研究結(jié)果較一致。

病毒作為一種非細(xì)胞生命形態(tài)，由蛋白質(zhì)外殼和內(nèi)部的遺傳物質(zhì)組成，其致病性與溫度、pH等理化因子密切相關(guān)。大多數(shù)病毒耐冷不耐熱，且對(duì)酸堿較敏感，熱、強(qiáng)酸和強(qiáng)堿等可使病毒蛋白發(fā)生變性，從而阻止病毒吸附于宿主細(xì)胞，也能破壞病毒復(fù)制所需的酶類，使病毒不能脫殼。所以在鰻鱺養(yǎng)殖過(guò)程中，可根據(jù)AnHV 對(duì)溫度和酸堿的敏感性，通過(guò)調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體溫度，使用酸性或堿性消毒劑對(duì)養(yǎng)殖工具和養(yǎng)殖環(huán)境進(jìn)行定期消毒以預(yù)防和控制鰻鱺皰疹病毒病的發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究應(yīng)用EEK 成功從“脫黏敗血病”鰻鱺內(nèi)臟組織中分離到一株AnHV，進(jìn)一步證實(shí)了同源的細(xì)胞系分離同一魚(yú)類病毒的有效性。該AnHV毒株對(duì)溫度和酸堿度均比較敏感，因而可利用該理化性質(zhì)防控鰻鱺皰疹病毒病的發(fā)生。