基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)技術(shù)

蔣 靜，趙文亮，李文越，陶大剛，潘文雅，徐兵榮，肖 簫，謝勝松，蔣 羽

（1.上海海關(guān)動(dòng)植物與食品檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，上海 200135；2.上海海關(guān)機(jī)電產(chǎn)品檢測(cè)技術(shù)中心，上海 201308；3.上海海關(guān)國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心，上海 201206；4.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)，湖北武漢 430070；5.洋山海關(guān)，上海 201308）

針對(duì)病毒性疾病頻繁發(fā)生和肆意流行，早期診斷與預(yù)防非常重要[1]。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)不斷發(fā)展，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)在病原體鑒定與檢疫檢測(cè)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[2]。然而，該技術(shù)需要體積大且價(jià)格較為昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，以及專(zhuān)用實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地和專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)人員，限制了其現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)的應(yīng)用?，F(xiàn)場(chǎng)快速檢驗(yàn)（point-of-care testing，POCT）技術(shù)以其快速、便利和成本低的優(yōu)勢(shì)脫穎而出，它不依賴專(zhuān)業(yè)實(shí)驗(yàn)室場(chǎng)地，無(wú)需借助昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器，就能快速得出結(jié)果。它主要結(jié)合核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，如重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（RPA）或環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)，而這些技術(shù)已在病原微生物核酸檢測(cè)中得到應(yīng)用[3]。

近年來(lái)發(fā)明的CRISPR/Cas 技術(shù)具有強(qiáng)大的基因編輯能力，其中Cas12a、Cas13a 和Cas14a 等蛋白被發(fā)現(xiàn)可以用于核酸檢測(cè)[4-6]。由這些Cas 蛋白與crRNA 形成的復(fù)合物在特異識(shí)別靶標(biāo)基因后，可以激活單鏈DNA 切割活性，在反應(yīng)體系中引入熒光-淬滅基團(tuán)修飾的單鏈報(bào)告DNA 分子，其被Cas 酶切割后可以通過(guò)儀器檢測(cè)到熒光信號(hào)?；谶@種原理，目前CRISPR/Cas 生物傳感系統(tǒng)大致可分為SHERLOCK 技術(shù)，其可以檢測(cè)RNA 靶標(biāo)[7]，以及HOLMES 和DETECTR 技術(shù)，其可以檢測(cè)DNA 靶標(biāo)[8-9]，并結(jié)合核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可以滿足高靈敏性、高特異的POCT 應(yīng)用場(chǎng)景，因此CRISPR/Cas 生物傳感系統(tǒng)也被評(píng)為下一代生物傳感診斷平臺(tái)[5]。

1 CRISPR/Cas 生物傳感系統(tǒng)原理和應(yīng)用

CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是原核生物中存在的一段重復(fù)序列，最初是細(xì)菌抵抗外來(lái)病原體入侵的自我防護(hù)方式。直到2012 年，通過(guò)體外試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成熟的crRNA 通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與tracrRNA 形成特殊的雙鏈RNA 結(jié)構(gòu)，可以指導(dǎo)Cas9 蛋白靶定目標(biāo)DNA 引起雙鏈斷裂[10]。由此開(kāi)發(fā)了基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的基因編輯技術(shù)。

根據(jù)CRISPR/Cas 系統(tǒng)中效應(yīng)蛋白的不同，可以將該系統(tǒng)分為兩大類(lèi)：I 類(lèi)CRISPR-Cas 系統(tǒng)，利用多蛋白效應(yīng)復(fù)合物和向?qū)NA 結(jié)合實(shí)現(xiàn)基因編輯，主要包括I、III 和 IV 型；II 類(lèi)CRISPR/Cas系統(tǒng)，僅需要單一蛋白效應(yīng)器和向?qū)NA 進(jìn)行基因編輯，主要包括Ⅱ、Ⅴ和Ⅵ型[11-12]。隨后發(fā)現(xiàn)了蛋白結(jié)構(gòu)更為單一、分子量更小的Cas12a、Cas13a和Cas14[7，9，13]，其具有在結(jié)合目標(biāo)基因后激活非特異性切割活性的特性，從而被廣泛應(yīng)用于核酸檢測(cè)。這種生物傳感核酸檢測(cè)技術(shù)和傳統(tǒng)核酸檢測(cè)技術(shù)相比，具有更高的檢測(cè)靈敏性和特異性（表1）。

1.1 靶向識(shí)別DNA 分子的CRISPR/Cas 生物傳感系統(tǒng)

第II 類(lèi)CRISPR/Cas 系統(tǒng)的Ⅴ型Cas12a（又稱(chēng)Cpf1）是RNA 引導(dǎo)的特異性識(shí)別切割DNA的核酸內(nèi)切酶（圖1-A）。有研究[14]指出，Cas12a、crRNA 和靶標(biāo)DNA 形成三元復(fù)合物后，會(huì)產(chǎn)生非特異性切割熒光-淬滅單鏈DNA 報(bào)告基團(tuán)而發(fā)出熒光信號(hào)。Li 等[8]最先開(kāi)發(fā)HOLMES 技術(shù)用于快速檢測(cè)靶標(biāo)DNA 和RNA，其先以PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因，實(shí)現(xiàn)了對(duì)偽狂犬病毒（PRV）和日本乙型腦炎病毒（JEV）的核酸檢測(cè)以及PRV/JEV毒株的分型、人基因單核苷酸的多態(tài)性（SNP）分型，其檢測(cè)靈敏性可以達(dá)到單分子水平。此外，基于Cas12a 的DETECTR 核酸檢測(cè)技術(shù)與HOLMES技術(shù)不同，其結(jié)合RPA 技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，可檢測(cè)人乳頭瘤病毒（HPV），并能區(qū)分HPV16和HPV18 毒株[9]。為了能直接檢測(cè)RNA 靶標(biāo)基因，Li 等[15]利用LAMP 技術(shù)對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)合Cas12b 酶切建立了HOLMESv2 核酸檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)堿基特異性區(qū)分，其不僅可直接檢測(cè)RNA，還能定量檢測(cè)DNA 甲基化水平。同樣利用Cas12b 蛋白，Teng 等[16]建立了CDetection 檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了單分子級(jí)的高靈敏與單堿基特異檢測(cè)。研究[13]指出，同屬第II 類(lèi)CRISPR/Cas 系統(tǒng)的Ⅴ型Cas14a，在激活后也具有非特異性核酸分子切割活性（圖1-A），但與Cas12a 不同，它對(duì)目標(biāo)基因的識(shí)別不依賴前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。研究還發(fā)現(xiàn)，基于Cas14a 系統(tǒng)的DETECTR-Cas14a 技術(shù)檢測(cè)單堿基特異性更強(qiáng)，然而其僅能識(shí)別單鏈DNA 分子，因而在對(duì)目標(biāo)基因擴(kuò)增完成后，需要解開(kāi)DNA 雙鏈才能實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)。

1.2 靶向RNA 分子的CRISPR/Cas 生物傳感系統(tǒng)

第II 類(lèi)CRISPR/Cas 系統(tǒng)的Ⅵ型Cas13a（又稱(chēng)C2c2），是RNA 引導(dǎo)的特異性識(shí)別切割RNA的核酸內(nèi)切酶（圖1-B）。Cas13a 能在crRNA 的引導(dǎo)下特異性切割單鏈靶標(biāo)RNA，產(chǎn)生非特異性切割單鏈RNA 的活性。與Cas12a 類(lèi)似，在試驗(yàn)體系中引入熒光-淬滅報(bào)告基團(tuán)同樣可用于核酸檢測(cè)?；贑as13a 系統(tǒng)，Gootenberg 等[7]開(kāi)發(fā)出了SHERLOCK 技術(shù)來(lái)快速檢測(cè)靶標(biāo)DNA 和RNA。SHERLOCK 先通過(guò)RPA 或RT-RPA 對(duì)目標(biāo)基因擴(kuò)增，隨后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄以作為靶標(biāo)RNA 分子；檢測(cè)核酸靈敏度為單分子水平，能夠檢測(cè)出寨卡病毒（ZIKV）和登革熱病毒（DENV）的特定毒株，可對(duì)人的基因進(jìn)行SNP 分型，以及檢測(cè)腫瘤DNA 突變。在SHERLOCK 基礎(chǔ)上，Gootenberg[17]等結(jié)合Cas12a、Cas13 以 及III 型CRISPR 效應(yīng)核酸酶Csm6 開(kāi)發(fā)了SHERLOCKv2檢測(cè)技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)高靈敏、多通道的多重核酸檢測(cè)。進(jìn)一步，結(jié)合HUDSON（一種核酸粗提法）、SHERLOCKv2 和側(cè)向流試紙條檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了高靈敏、不依賴精密儀器，對(duì)ZIKV 和DENV 進(jìn)行核酸檢測(cè)[18]。

2 CRISPR/Cas 生物傳感系統(tǒng)應(yīng)用于POCT

POCT 不需要復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)儀器和專(zhuān)門(mén)的實(shí)驗(yàn)室場(chǎng)地，能在較短時(shí)間得到檢測(cè)結(jié)果[19]。隨著核酸檢測(cè)普及化以及對(duì)現(xiàn)場(chǎng)化診斷的需求日益增長(zhǎng)，POCT 技術(shù)發(fā)展迅速，不僅在疾病公共衛(wèi)生領(lǐng)域中發(fā)揮重要作用，同時(shí)相關(guān)應(yīng)用也正在向政府的進(jìn)出口貿(mào)易保護(hù)方向擴(kuò)展。目前將CRISPR/Cas 生物傳感系統(tǒng)用于現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)，主要涉及核酸快速提取、目標(biāo)基因擴(kuò)增、Cas酶切和crRNA保存等方面（圖2）。

2.1 核酸快速提取

病原體檢測(cè)第一步是樣品采集，然后是制備核酸，如DNA 或RNA。以往核酸提取主要在實(shí)驗(yàn)室通過(guò)機(jī)械裂解、酶裂解和化學(xué)裂解的方式提取，這種方法需要高速離心機(jī)等儀器設(shè)備，無(wú)法滿足現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)要求。Myhrvold 等[18]提出了一種加熱（未提?。┡R床樣本以消除核酸酶來(lái)提取核酸的新技術(shù)（HUDSON），其對(duì)樣本進(jìn)行簡(jiǎn)單的熱處理來(lái)裂解病毒，使病毒核酸釋放出來(lái)，結(jié)合SHERLOCK 技術(shù)可實(shí)現(xiàn)直接對(duì)尿液或唾液中ZIKV 和DENV 的高靈敏檢測(cè)。隨著新冠病毒肺炎的全球性暴發(fā)，Joung 等[20]也提出了一種能在5 min內(nèi)完成RNA 提取的方法，其能從鼻咽拭子樣本中提取新冠病毒（SARS-CoV-2）RNA。針對(duì)非洲豬瘟病毒（ASFV）檢測(cè)，Wang 等[21]通過(guò)室溫孵育3 min，可實(shí)現(xiàn)裂解樣品釋放血清樣本中的病毒DNA。這些核酸粗提方法非常有助于配合CRISPR/Cas 生物傳感系統(tǒng)，用于現(xiàn)場(chǎng)核酸快速檢測(cè)。

2.2 核酸等溫?cái)U(kuò)增

核酸的高靈敏檢測(cè)僅依賴Cas 蛋白難以實(shí)現(xiàn)，還需結(jié)合核酸擴(kuò)增方法，如PCR 技術(shù)[22]。該技術(shù)利用PCR 儀，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟實(shí)現(xiàn)基因擴(kuò)增。但其需要體積較大的儀器，因而難以用于現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)，需要借助RPA 或LAMP 等等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)[7，9，23]。LAMP 技術(shù)的特點(diǎn)是針對(duì)靶基因區(qū)域設(shè)計(jì)4 種或6 種特異引物，在鏈置換DNA 聚合酶的作用下進(jìn)行恒溫反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增[24]，如HOLMESv2 檢測(cè)技術(shù)[15]。與RPA 技術(shù)相比，LAMP 技術(shù)更顯優(yōu)勢(shì)，其中置換DNA 聚合酶（Bst3.0）可同時(shí)以DNA 或RNA 為模板直接進(jìn)行擴(kuò)增，更易于直接檢測(cè)RNA[25]?；诖耍肈ETECTR 技術(shù)檢測(cè)SARS-CoV-2 僅需RT-LAMP一步法進(jìn)行核酸擴(kuò)增，進(jìn)而采用Cas 酶切來(lái)檢測(cè)熒光信號(hào)[26]。

2.3 Cas 蛋白與crRNA 凍干保存

由于蛋白變性或RNA 容易被外源核酸酶降解，通常他們需要保存在-20 ℃以避免失活，這可能阻礙了其用于現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)。因而，如何長(zhǎng)期穩(wěn)定保存Cas 蛋白和crRNA 是一個(gè)值得研究的問(wèn)題。Kellner 等[27]利用真空冷凍干燥機(jī)，將Cas13a蛋白和crRNA 等反應(yīng)試劑混合制作為凍干粉，以實(shí)現(xiàn)冷凍長(zhǎng)期保存。Qian 等[28]將Cas12a 蛋白和crRNA 等反應(yīng)試劑混合后，利用同樣策略制作為凍干粉，發(fā)現(xiàn)其可在室溫下保存1 個(gè)月左右。由此可見(jiàn)，將Cas 蛋白和crRNA 凍干的策略可解決長(zhǎng)期保存的問(wèn)題，但還有待深入研究。

2.4 檢測(cè)結(jié)果判讀方法

CRISPR/Cas 生物傳感系統(tǒng)識(shí)別靶向目標(biāo)基因后，具有非特異性切割報(bào)告基因的特性。為了實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)核酸可視化檢測(cè)，目前主要結(jié)合側(cè)向流試紙條和熒光可視化檢測(cè)技術(shù)。側(cè)向流試紙條檢測(cè)的原理是，在反應(yīng)體系中使用末端帶有熒光素和生物素標(biāo)記的DNA 或RNA 報(bào)告基因（FAM-ssDNA/ssRNABiotin）[29]。在試紙條的一端帶有能夠與生物素結(jié)合的鏈霉親和素，在另一端帶有與報(bào)告基因熒光素結(jié)合的金納米顆粒標(biāo)記的抗熒光素抗體。當(dāng)Cas 蛋白和crRNA 識(shí)別目標(biāo)基因后，會(huì)切割報(bào)告基因，使熒光素釋放出來(lái)，沿著試紙條向另一端移動(dòng)，在試紙條上出現(xiàn)樣本線來(lái)指示檢測(cè)到的靶分子，就像“驗(yàn)孕棒”一樣可直接根據(jù)試紙條上的條帶，判斷檢測(cè)樣本是否為陽(yáng)性[28]。Gootenberg 等[7]及Joung等[20]利用SHERLOCK 技術(shù)建立了檢測(cè)SARSCoV-2、ZIKV 和DENV 等多種病毒的檢測(cè)方法。此外，Wang 等[21]在CRISPR/Cas12a-LFD 中實(shí)現(xiàn)了對(duì)ASFV 的高靈敏度檢測(cè)，Broughton 等[26]利用DETECTR 技術(shù)實(shí)現(xiàn)了45 min 檢測(cè)SARS-CoV-2。

此外，基于熒光信號(hào)也可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)。He 等[30]通過(guò)研發(fā)便攜式熒光信號(hào)采集儀器，結(jié)合Cas12a 技術(shù)可高通量檢測(cè)ASFV。Wang 等[31]通過(guò)開(kāi)發(fā)Cas12aVDe 技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了只需藍(lán)光就可檢測(cè)支原體。特別是華中農(nóng)業(yè)大學(xué)研究團(tuán)隊(duì)對(duì)多種熒光-淬滅報(bào)告基因進(jìn)行篩選和比較，成功建立了增強(qiáng)熒光可視化核酸檢測(cè)新技術(shù)，成功實(shí)現(xiàn)了熒光可視化檢測(cè)ASFV[32]，后續(xù)還報(bào)道了無(wú)需借助熒光儀器，直接裸眼可視化檢測(cè)溶液顏色變化的核酸檢測(cè)方法[33]。Li 等[34]采用離子體金納米（AuNPs）對(duì)報(bào)告基團(tuán)進(jìn)行改造，同樣建立了直接裸眼觀察反應(yīng)溶液顏色變化即可檢測(cè)葡萄藤紅斑病毒的核酸檢測(cè)技術(shù)。這些對(duì)結(jié)果判讀方法的優(yōu)化，極大促進(jìn)了CRISPR/Cas 生物傳感系統(tǒng)應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)。

3 展望

基于CRISPR/Cas 系統(tǒng)的核酸檢測(cè)技術(shù)被認(rèn)為是下一代生物傳感診斷平臺(tái)，其應(yīng)用于現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)主要為兩大類(lèi)：以DNA 作為靶向識(shí)別分子（HOLMES、DETECTR、Cas12aVDet）[8-9，31]和以RNA 作為靶向識(shí)別分子（HUDSON、SHERLOCK等）[7，27]。為了實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)，還需要解決一些關(guān)鍵的問(wèn)題，如：為了提高Cas 蛋白對(duì)靶標(biāo)基因識(shí)別的靈敏度和特異性，有必要開(kāi)發(fā)和改造出新型Cas 蛋白[35-36]；野生型Cas12 蛋白需要識(shí)別PAM才能發(fā)揮活性，有必要開(kāi)發(fā)不限PAM 的Cas12 蛋白，以擴(kuò)大靶標(biāo)檢測(cè)范圍[37]。盡管等溫?cái)U(kuò)增能實(shí)現(xiàn)超高靈敏檢測(cè)，但容易受氣溶膠污染，導(dǎo)致假陽(yáng)性判讀[38]，因而可采用不開(kāi)蓋的一管法，降低假陽(yáng)性。此外，側(cè)向流試紙條或便攜式熒光檢測(cè)僅能實(shí)現(xiàn)定性核酸檢測(cè)，在滿足便攜式檢測(cè)需求的前提下如何實(shí)現(xiàn)定量核酸檢測(cè)，也將是未來(lái)值得研究的方向[39]。

為了更大范圍地推廣應(yīng)用此技術(shù)，應(yīng)該進(jìn)一步評(píng)估現(xiàn)場(chǎng)化的臨床檢測(cè)效果，同時(shí)還需要更多的研發(fā)投入，以降低檢測(cè)成本，確保試劑能穩(wěn)定長(zhǎng)期保存。除了對(duì)病原微生物進(jìn)行檢測(cè)外，在政府的貿(mào)易保護(hù)方面，對(duì)于進(jìn)出口動(dòng)物源性產(chǎn)品成分鑒定的檢測(cè)需求也被提上日程。CRISPR/Cas 技術(shù)已被證明是非常適合現(xiàn)場(chǎng)核酸檢測(cè)的新技術(shù)，相信未來(lái)該技術(shù)將在核酸檢測(cè)領(lǐng)域得到更廣泛應(yīng)用。