鴨源多重耐藥鼠鼻羅氏菌的分離鑒定、耐藥性及耐藥基因檢測

李旭妮，張寧寧，羅玉峰，馮 妍，朱良全，彭小兵，王 楠

（1.中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081；2.中國動物疫病預防控制中心，北京 100125）

鼠鼻羅氏菌（Rothia nasimurium）為兼性厭氧的革蘭氏陽性球菌，屬于放線菌屬微球菌科，為條件致病菌[1]。該菌在首次報道時分離自鼠的鼻腔[2]，并因此得名。近年來，研究人員相繼在狗[3]和鵝[4]的臨床病料中分離到鼠鼻羅氏菌。2021 年，Wang 等[5]也報道了山東省某地患病鴨感染該菌。目前關(guān)于鼠鼻羅氏菌的致病力以及耐藥分析研究很少，但該菌常常表現(xiàn)出多種常用抗生素高水平耐藥現(xiàn)象[4]，這恰恰是值得研究者關(guān)注的問題。

本課題組于2020 年在東北地區(qū)某農(nóng)場的病鴨鼻拭子中分離得到一株細菌，將其命名為DB1 株，通過鑒定確定為鼠鼻羅氏菌。隨后，對分離得到的鼠鼻羅氏菌進行耐藥性分析，并對相關(guān)耐藥基因進行檢測，以期對由該菌引起感染的治療和預防起到一定指導作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源及背景 2020 年東北地區(qū)某農(nóng)場送檢發(fā)病鴨多只。病鴨主要表現(xiàn)為散發(fā)性呼吸系統(tǒng)癥狀（流黏性鼻液、咳嗽、呼吸急促），進食量減少，精神低沉。通過問詢畜主，得知該農(nóng)場飼養(yǎng)環(huán)境較差，且時處冬末春初，為保持圈舍環(huán)境溫度，常關(guān)閉門窗，舍內(nèi)通風差。發(fā)病后，畜主投喂了青霉素和板藍根，但治療效果不佳。本課題組研究人員到場后，無菌采集發(fā)病鴨鼻拭子進行細菌分離培養(yǎng)。

1.1.2 試劑及藥品 10×Buffer、ExTaq酶、dNTP、切膠回收試劑盒、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞，均購自寶生物工程（大連）有限公司；TSB液體培養(yǎng)基、TSA 培養(yǎng)基、細菌生化微量鑒定管，均購自杭州微生物試劑有限公司；DNA 提取試劑盒，購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司；卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、氟苯尼考、多西環(huán)素、頭孢氨芐、恩諾沙星8 種抗菌藥物，均購自北京海洋醫(yī)藥化工生物科技有限公司。

1.1.3 試驗動物 20 日齡試驗級法國番鴨12 只，雌雄各半，體質(zhì)量（1.5±0.2）kg，購自東北大學實驗動物中心。

1.2 細菌分離培養(yǎng)

將采集的鼻拭子放置于1 mL 無菌水中，浸泡0.5～2 h，離心收集沉淀；將收集樣品無菌接種TSA 固體培養(yǎng)基，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)24 h；挑取單個菌落接種在TSB 液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)留用。

1.3 涂片鏡檢

用接種環(huán)挑取上述培養(yǎng)基中的單個菌落，進行革蘭氏染色，在油鏡下觀察細菌菌落形態(tài)特點。

1.4 生化鑒定

將純化后的細菌培養(yǎng)物分別進行葡萄糖、麥芽糖、阿拉伯糖、甲基β-D-吡喃葡萄糖苷、蔗糖、糖原、乳糖、蜜二糖、半乳糖醛酸苷酶、精氨酸二氫酶、堿性磷酸酶等一系列生化試驗，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果并記錄。試驗結(jié)果參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》進行比對。

1.5 動物回歸試驗

將12 只法國番鴨隨機分為2 組，每組6 只。一組為試驗組，將菌液在37 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h，取5 mL 菌液12 000 r/min 離心10 min，棄上清，在所得沉淀中加入生理鹽水稀釋至原菌液濃度；將所得樣品注射試驗番鴨（3 mL/只），每隔6 h 觀察番鴨的臨床表現(xiàn)，隔離觀察7 d。另一組為對照組，注射無菌生理鹽水（3 mL/只）。

1.6 分離菌株16S rDNA 基因序列測定

用DNA 提取試劑盒提取菌液DNA。使用Primer 6.0 軟件設計16S rDNA 引物（上游引物序列：5'-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3'；下游引物序列：5'-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3'），進行PCR 擴增。反應體系：DNA 模板0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，ExTaq酶 0.2 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，最后用dd H2O補充至25.0 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃1 min，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取PCR 擴增產(chǎn)物進行核酸電泳檢測，隨后將得到的PCR 產(chǎn)物切膠回收，連接，轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，并將純化質(zhì)粒送往深圳華大基因股份有限公司進行核苷酸序列測定。

1.7 序列比對及系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

為證實親緣關(guān)系，將16S rDNA 測序結(jié)果與從Amazona aestiva中分離的菌株核酸序列（GenBank登錄號KR059855.1）進行Blast 分析比對，并從NCBI 網(wǎng)站中選取4 株全基因組序列作為分析對象，采用MEGA 5.05 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.8 藥敏試驗

選用獸醫(yī)臨床上較為常見的8 種獸用抗菌藥物，分別為卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、氟苯尼考、多西環(huán)素、頭孢氨芐、恩諾沙星。采用微量稀釋法進行最小抑菌濃度（MIC 值）測定，結(jié)果參照美國臨床和實驗室標準協(xié)會（CLSI）公布的標準《動物源性細菌抗菌藥物敏感性試驗紙片法與稀釋法執(zhí)行標準（第四版）VET01-A4》[6]，判定其耐藥情況。

采用常規(guī)PCR 檢測兩種耐藥基因（TME和OXA-23），耐藥基因引物及參考文獻見表1。PCR反應體系：DNA 模板4.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 2.0 μL，ExTaq酶 0.3 μL，上游引物1.0 μL，下游引物1.0 μL，最后以ddH2O 補充至25.0 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，50 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴增完成后，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 耐藥基因PCR 引物序列及終產(chǎn)物長度

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)

如圖1 顯示，細菌在TSA 培養(yǎng)基上生長緩慢，24 h 后，在TSA 固體培養(yǎng)基上生長出淡灰色、圓形、光滑、隆起且邊緣整齊的菌落。挑取單個菌落進行革蘭氏染色，置于油鏡下觀察，可以發(fā)現(xiàn)分離株為革蘭氏陽性球菌，單個或兩兩相連（圖2），將其命名為DB1 株。

2.2 生化鑒定

生化試驗結(jié)果（表2）顯示，分離菌株生化特性與鼠鼻羅氏菌基本一致，初步確定該菌為鼠鼻羅氏菌。

表2 菌株DB1 生化特性

2.3 動物回歸試驗

12 只健康番鴨在隔離觀察7 d 無任何異常后，進行動物回歸試驗。結(jié)果顯示：試驗組番鴨在注射菌液4 d 后出現(xiàn)明顯癥狀，主要表現(xiàn)為采食量下降，精神萎靡，鼻腔有黏性分泌物流出，所有試驗鴨均無死亡現(xiàn)象；對照組番鴨無任何異常現(xiàn)象。采集發(fā)病鴨鼻腔黏性分泌物，進行實驗室分離培養(yǎng)、生化試驗及16S rDNA 基因測序，結(jié)果從發(fā)病鴨鼻腔黏性分泌物中能夠再次分離到鼠鼻羅氏菌。

2.4 16S rDNA 基因擴增

以提取的DNA 為模板，進行16S rDNA 基因PCR 擴增，擴增產(chǎn)物通過10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果（圖3）顯示，擴增產(chǎn)物核苷酸序列大小約為1 500 bp。在GenBank 數(shù)據(jù)庫中經(jīng)Blast比對分析，結(jié)果顯示該菌株與鼠鼻羅氏菌相似度為99%。

2.5 系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

使用MEGA 5.05 軟件，將分離菌株DB1 與GenBank 數(shù)據(jù)庫中鼠鼻羅氏菌其他代表性菌株構(gòu)建進化樹。結(jié)果（圖4）顯示，分離菌株DB1 與鼠鼻羅氏菌NR025310.1 同在一個分支，表明該分離菌株為鼠鼻羅氏菌。

2.6 藥敏試驗

根據(jù)各種藥物的濃度測試范圍結(jié)果，分析MIC 結(jié)果，參照CLSI 臨床標準，得出以下結(jié)果（表3）：本試驗分離的鼠鼻羅氏菌DB1 株對卡那霉素、慶大霉素、鏈霉素、紅霉素、氟苯尼考、恩諾沙星、頭孢氨芐均耐藥，僅對多西環(huán)素敏感。

表3 鼠鼻羅氏菌DB1 株肉湯稀釋法藥敏試驗結(jié)果 單位：μg/mL

2.7 耐藥基因檢測

對分離菌株DB1 進行β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥基因（TME和OXA-23）PCR 檢測，TME和OXA-23基因預期擴增片段長度分別為535 和1 067 bp。結(jié)果（圖5）顯示，兩種耐藥基因擴增均呈陰性。

3 討論

鼠鼻羅氏菌屬于羅氏菌屬，為兼性厭氧的革蘭氏陽性菌，不形成孢子，無動力，最早被歸類為放線菌科。2000 年由Collins 等[2]首次發(fā)現(xiàn)于鼠的鼻腔，并因此得名。2011 年李楠等[7]在空氣中分離到一株鼠鼻羅氏菌，并確定其為具有高水平多重耐藥表型的分離株。2014 年David 等[3]報道在狗感染部位分離到鼠鼻羅氏菌，表明其作為共生體或者機會性病原體在與葡萄球菌混合感染中產(chǎn)生致病性。2021 年趙巧雅等[8]在患病仔兔的肺臟中分離出一株鼠鼻羅氏菌。迄今為止，在我國東北地區(qū)幾乎沒有關(guān)于該菌株在禽類中的報道。

從本研究藥敏試驗結(jié)果可知，分離菌株DB1對多種藥物耐藥，僅對多西環(huán)素敏感。β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥基因檢測結(jié)果為陰性，但分離菌株對該類藥物表現(xiàn)為耐藥，說明該菌產(chǎn)生耐藥性的原因并非耐藥基因，分析原因可能為日常飼養(yǎng)中該類藥物使用較為頻繁，從而導致耐藥性產(chǎn)生。近年來，抗生素濫用現(xiàn)象十分嚴重，細菌耐藥性已經(jīng)成為科學研究的熱點。多重耐藥菌株的產(chǎn)生，也使人們面臨著嚴峻考驗[9]。到目前為止，世界上發(fā)現(xiàn)的高水平耐藥細菌數(shù)量呈現(xiàn)增長趨勢，如金黃色葡萄球菌[10]、銅綠假單胞菌[11]、鮑曼不動桿菌[12]等，這些都是臨床上常見的病原菌，而有關(guān)高水平耐藥鼠鼻羅氏菌卻報道較少[13-14]。養(yǎng)殖人員在動物患病時，特別是疑似或確診為細菌性感染時，應及時開展藥物敏感性試驗，使用敏感性高的藥物進行針對性治療，做到合理使用，避免抗生素濫用。

本研究從某農(nóng)場患病鴨的鼻拭子中分離到一株優(yōu)勢菌，通過分子生物學方法鑒定該菌為鼠鼻羅氏菌。從鴨鼻拭子中分離到鼠鼻羅氏菌在我國東北地區(qū)尚屬首次報道。致病性試驗結(jié)果顯示，分離菌株對番鴨具有一定致病性。因此，養(yǎng)殖場在防控細菌性疾病時，一方面要加強日常飼養(yǎng)管理，提高動物機體免疫機能，保護易感動物。另一方面，要落實落細清洗、消毒等生物安全防控措施，確保養(yǎng)殖場、圈舍內(nèi)清潔衛(wèi)生，切斷細菌性疾病的傳播途徑。此外，在高水平耐藥菌株跨物種傳播趨勢增強的大背景下，需高度重視病原微生物高水平耐藥給養(yǎng)殖業(yè)帶來的潛在威脅，貯備和建立有效的監(jiān)測及防控機制，從而保障畜牧業(yè)生產(chǎn)安全和公共衛(wèi)生安全。